단일 분자 국소화 현미경을 사용한 세포 핵의 절대 DNA 밀도 매핑

본 방법을 사용하면 세포 핵의 절대 DNA 밀도 측정을 통해 번역 후 히스톤 변형으로만 특성화되는 염색질 구조의 공간적 제약을 조사할 수 있습니다. SMLM과 결합된 Voronoi 테셀레이션을 사용하면 제곱 마이크로미터당 염기쌍 측면에서 DNA의 절대 밀도 추정이 가능합니다. 필요한 유일한 선험적 지식은 측정된 세포핵의 총 DNA 함량입니다.

향후 실험에서는 절대 밀도 차이가 후성유전학적 변형의 면역형광 또는 Hi-C 데이터와 같은 다른 방법의 생물학적 정보와 상관관계가 있는지 조사하는 것이 흥미로울 것입니다. 미리 기록된 단일 이미지를 함께 타일링하여 스캔한 영역을 재구성하는 것부터 시작합니다. CellProfiler를 연 다음 파이프라인 cellcycleanalysis.cpproj를 로드합니다.

파이프라인의 첫 번째 단계 이미지에서 참조 이미지를 포함하여 이미지를 끌어다 놓습니다. 다음으로 참조 이미지가 저장될 위치를 정의합니다. 그런 다음 테스트 모드 시작 아이콘을 클릭한 다음 실행을 클릭합니다.

분석할 이미지에서 핵의 히스토그램이 표시되면 G1, S 및 G2 단계의 강도 간격을 결정하고 파이프라인의 후속 필터 개체 단계에 입력되고 이러한 단계가 활성화되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 실행 버튼을 다시 클릭하여 파이프라인의 후반부를 계속합니다. 서로 다른 세포 주기 단계인 G1, S 또는 G2를 나타내는 오버레이가 있는 세 장의 사진을 보고 이미지 핵의 염기쌍에 있는 DNA의 양을 알 수 있도록 추가 이미징을 위해 G1 또는 G2의 핵을 선택합니다.

단일 분자 국소화 현미경에서 세포를 재배치하고 FPALM 프로세스가 적절하게 깜박이도록 합니다. 먼저 슬라이스당 500프레임만 사용하여 선택한 핵의 3D 스택을 기록합니다. 이를 통해 중간 부분에서 DNA의 상대적 양을 결정할 수 있으며, 나중에 더 많은 프레임으로 이미지화되어 초미세 구조를 드러냅니다.

50밀리초의 노출 시간을 사용하여 이미지 시리즈 획득을 시작하면 초당 약 20프레임의 프레임 속도가 됩니다. 200나노미터 스텝 간격과 광 광학 섹션당 500프레임으로 핵을 통과하는 Z-스택을 가져갑니다. 스택을 획득한 후 초기 z 위치로 돌아가 동일한 50밀리초 노출 시간으로 50, 000 프레임의 메인 데이터 세트를 획득합니다.

ImageJ에서 FPALM 데이터 세트를 엽니다. 깜박이는 신호 감지 설정을 최적화하려면 ThunderSTORM을 클릭한 다음 분석 실행을 클릭합니다. 이제 카메라 설정을 선택합니다.

이미지 데이터의 올바른 픽셀 크기, A/D 수, 사용된 카메라의 양자 효율, 기본 수준 및 EM 게인을 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 깜박이는 신호를 피팅하여 현지화 좌표를 결정하는 알고리즘을 선택합니다. 이미지 필터링 섹션에서 웨이블릿 필터 B-스플라인을 B-스플라인 차수 3 및 B-스플라인 배율 2와 함께 사용합니다. 그런 다음 분자의 근사치 국소화 방법을 로컬 최대 값으로 설정하고 피크 강도 임계값 및 연결성을 8-neighborhood로 설정합니다.

분자의 하위 픽셀 국소화 섹션에서 방법으로 PSF 통합 가우시안을 선택하고, 피팅 반경 px를 3으로 설정하고, 피팅 방법을 최대 우도로 선택하고, 초기 시그마를 1.6으로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 신호 감지 및 이미지 재구성을 시작합니다. 획득이 다른 이미지 스택으로 분할되는 경우 ThunderSTORM에서 현지화 테이블을 연결합니다.

이렇게 하려면 팝업 창에서 가져오기를 클릭합니다. 현재 테이블에 추가 옵션이 활성화되어 있고 테이블에서 현지화를 재정의하지 않도록 올바른 시작 번호가 사용되는지 확인합니다. 그런 다음 파일 경로를 선택하고 확인을 클릭하여 파일을 차례로 가져옵니다.

연속 프레임에서 신호를 과도하게 계산하지 않으려면 분자당 최대 거리 20나노미터, 최대 오프 프레임 1개, 최대 프레임 0개를 사용하여 현지화 데이터를 병합한 다음 병합을 클릭합니다. 데이터 하위 섹션을 상호 연관시켜 드리프트를 측정하고 수정하려면 드리프트 수정 메뉴를 열고 화살표를 클릭합니다. 3개의 빈을 추가하고 배율을 5로 설정합니다.

그런 다음 적용을 클릭하면 x 및 y 드리프트를 보여주는 창이 나타납니다. 각 슬라이스에 대해 500프레임으로 미리 기록된 3D 스택의 각 슬라이스에서 DNA 함량에 비례하는 신호의 양을 확인하려면 플러그인, ThunderSTORM, 가져오기/내보내기를 차례로 선택하고 스택의 첫 번째 슬라이스에 대한 결과 테이블을 가져옵니다. 3D 스택의 다른 이미지 평면에서 신호를 과도하게 계산하는 것을 방지하려면 슬라이스 사이의 z(z) 200나노미터 스텝 간격 외부의 신호를 제거해야 합니다.

히스토그램 플롯을 누르고 분포 대화 상자를 열어 z를 선택하고 확인을 누릅니다. 피크의 위치를 결정하고 필터 필드를 사용하여 광학 스텝 크기가 200나노미터인 신호를 선택합니다. 시각화를 클릭하고 히스토그램 옵션을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 결과 이미지를 TIFF 형식의 폴더에 저장합니다. 모든 슬라이스를 열고 Image, Stacks, Images to Stack을 차례로 사용하여 결합합니다.

전체 이미지 영역을 선택한 후 분석으로 이동하여 도구를 클릭하고 ROI 관리자를 선택합니다. 추가를 클릭한 다음 분석을 클릭한 다음 측정 설정을 클릭하고 통합 밀도를 선택합니다. 이제 더 보기 옵션을 선택하고 다중 측정을 선택한 다음 모든 스택 측정과 슬라이스당 한 행을 선택합니다.

확인을 클릭하면 결과가 나타납니다. 모든 슬라이스의 강도의 합은 개별 슬라이스의 강도가 전체 게놈의 비율에 비례하는 것과 같은 방식으로 전체 핵의 DNA 함량에 비례합니다. 50, 000 프레임의 신호를 포함하는 중심면의 결과 테이블을 연 후 100 나노 미터의 두께로 필터링합니다.

앞서 설명한 대로 결과 신호의 히스토그램을 생성하고 중심 섹션의 통합 밀도를 측정합니다. MATLAB 스크립트 TS2orte를 실행하여 중앙 섹션의 초미세구조 정보가 포함된 대형 ThunderSTORM 현지화 테이블을 csv 형식에서 ORTE 형식으로 변환합니다. m은 현지화 테이블을 MATLAB 행렬로 변환하고 mat 형식으로 저장합니다.

LAND-voronoi 폴더로 이동하여 coreAlgorithm 하위 폴더에서 voronoicluster 파일을 엽니다. m 및 절대 밀도 계산을 위해 사용된 세포 유형 및 세포주기 단계에 따라 DNA 함량, 전체 핵 분획 DNA 및 국소화의 관찰된 중심 부분의 분율, 변환 계수를 조정합니다. voronoi.m 분석을 시작하는 스크립트를 편집합니다.

orte 현지화 데이터 및 결과 파일의 출력 폴더에 대한 파일 경로를 조정합니다. 테셀레이션을 수행해야 하는 영역을 정의하는 좌표를 지정합니다. 동일한 입력 데이터 세트 내에서 계산할 여러 영역을 정의합니다.

스크립트를 실행한 후 면적 분포의 히스토그램과 밀도를 보여주는 그래프가 포함된 다른 파일과 함께 절대 DNA 밀도를 보여주는 이미지를 찾습니다. m 출력 폴더에서 계산된 모든 단일 Voronoi 셀의 밀도를 포함하는 파일입니다. 50, 000 프레임으로 구성된 FPALM 측정은 100 나노미터 두께의 중간 부분 내에서 감지된 국소화 6의 2.68 곱 10 승을 가져 왔습니다.

재구성된 이미지의 위치 파악 정확도는 10나노미터였습니다. 많은 수의 국소화로 인해 절대 DNA 밀도를 보여주면서 초고해상도 이미징의 조합이 가능했습니다. 측정된 DNA 밀도가 핵 전체에 균일하게 분포되어 있지 않고 광범위한 동적 범위를 커버하는 것이 분명했습니다.

더 큰 보로노이 세포를 나타내는 핵 내 영역의 배율이 높을수록 DNA 밀도가 낮음을 나타내는 반면, 세포가 작을수록 DNA 밀도가 높음을 나타냅니다. G1C3H10T 절반 핵에서 측정된 DNA 밀도는 다른 유형과 종의 핵 내에서 절대 DNA 밀도 분포를 보여주었습니다. 기본 조직은 초기 G1 HeLa 핵처럼 보였지만 추가로 초중심 헤테로크로마틴의 구성 클러스터를 가지고 있었습니다.

핵 크기가 약간 증가했음에도 불구하고 G2 핵에서는 극적인 구조적 변화가 관찰되지 않았습니다. TSA로 처리된 HeLa 핵은 핵 지형과 DNA 밀도와 관련하여 현저한 차이를 보였습니다. DNA 밀도가 더 높은 섬을 보인 말초 헤테로크로마틴을 제외하고, 나머지 염색질은 훨씬 더 균질하고 축축되지 않은 것처럼 보였습니다.