Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

여기에 제시된 기술은 다양한 식물 기관과 관련된 내생균 군집을 조사하는 데 유용합니다. 내생균 분리는 이들의 식별을 가능하게 하며, 공생 발아와 같은 다른 기술에서 가치가 있습니다. 먼저 8-10 센티미터의 PDA 배양 배지 페트리 접시에 항생제 리터당 3 밀리리터를 보충하십시오.

사용하기 전에 배양 배지 페트리 접시를 섭씨 36도에서 24시간 동안 배양하여 오염 여부를 확인하십시오. 다음 날, 표준 절차를 사용하여 건강한 균하영양 식물 조각을 표면적으로 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 샘플의 표면 소독 효능을 평가하려면 PDA에서 샘플을 마지막으로 세척할 때 사용된 증류수 몇 방울을 접종합니다.

그런 다음 화염 메스와 집게를 사용하여 샘플을 0.2cm 두께의 조각으로 나눕니다. 샘플을 절편화하여 매체와 접촉할 표면적을 증폭합니다. 항생제가 보충된 PDA 플레이트에 지하 장기의 5개 조각을 접시 가장자리를 건드리지 않고 가능한 한 멀리 놓습니다.

페트리 접시를 접착 필름으로 밀봉하고 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 5일 동안 보관합니다. 서브 컬쳐 하루 전에 리터 당 5-7 그램의 AA 배지를 사용하여 5 센티미터 페트리 접시를 준비하고 플레이트를 섭씨 36도에서 24 시간 동안 배양합니다. 진균 분리물을 정제하려면 PDA 플레이트 콜로니를 색상, 성장 패턴, 질감 및 마진 형식으로 구별합니다.

그런 다음 접시 바닥면의 식민지 여백을 구분합니다. 또한 코드로 콜로니를 식별합니다. 오토클레이브 나무 이쑤시개 끝을 사용하여 식별된 곰팡이 군집의 가장자리에서 소량의 균사체를 회수하고 AA 플레이트를 줄무늬로 만들어 서로 1cm에 3개의 줄무늬를 생성하고 접시 가장자리를 생성합니다.

스티커 용지와 연필을 사용하여 AA 플레이트에 적절한 코드로 라벨을 붙입니다. 접시를 밀봉한 후 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 3일 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 꼼꼼하게 관찰하여 개별 군체를 형성하는 미세한 균사를 식별합니다.

영구 마커를 사용하여 개별 식민지의 영역을 구분합니다. 오토클레이브 이쑤시개를 사용하여 콜로니가 포함된 배지의 일부를 절단하고 절단된 부피를 항생제 없이 새 PDA 페트리 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 페트리 접시에 분리 코드를 표시한 후 접착 필름으로 밀봉하고 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 7-14일 동안 보관합니다.

Castellani의 방법으로 곰팡이 분리물의 보존을 시작하려면 오토클레이브 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.5밀리리터의 증류수를 추가합니다. 오토클레이브 이쑤시개를 사용하여 이미 성장한 정제된 분리물의 균사체 가장자리에서 0.5 x 0.5cm 직육면체 배지를 자릅니다. 4-6개의 직육면체를 증류수와 함께 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

튜브를 섭씨 25도의 어두운 곳에 필요한 만큼 보관하십시오. 필요한 경우 직육면체를 회수하여 새 PDA 접시의 중앙에 놓아 저장된 분리물을 성장시킵니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 Toluidine blue-O 얼룩을 한 방울 떨어뜨려 티즈 마운트 방법을 시작합니다.

이러한 기술에는 다른 얼룩이 사용될 수 있습니다. 고압멸균 이쑤시개를 사용하여 성장한 분리물에서 일부 균사를 조심스럽게 제거하고 얼룩 방울에 넣습니다. 커버 슬립을 놓고 광학 현미경으로 분석합니다.

접착 테이프 장착 방법의 경우 깨끗한 유리 슬라이드에 락토페놀 코튼 블루 얼룩 한 방울을 떨어뜨립니다. 투명 접착 테이프 스트립을 유리 슬라이드와 중앙 얼룩 방울에 잘 맞는 크기로 자릅니다. 접착 스트립의 끈적끈적한 표면을 균사체 표면으로 향하게 하고 균사를 너무 많이 누르거나 모으지 않고 일부 균사를 수집하십시오.

그런 다음 테이프를 유리 슬라이드에 붙여서 얼룩이 수집된 균사와 접촉하도록 합니다. 테이프 위에 물 한 방울을 떨어뜨리고 광학 현미경으로 슬라이드를 분석하기 전에 커버 슬립을 놓습니다. 단편의 내부에서 나오는 사상균 균사체의 작은 그룹의 성장은 PDA 배지에 균하영양 식물 장기 단편을 접종한 지 5일 후에 관찰되었습니다.

정제된 분리물의 접종 7 내지 14일 동안, PDA에서 순수 진균 분리물 콜로니의 원심 성장이 관찰되어, 유일한 원형 균사체를 형성하였다. 가능한 오염은 쉽게 식별되어 배지에서 성장 형태 측면, 색상 및 안료 생산과 관련된 콜로니 균질성을 손상시켰습니다. 균하영양 난초(mychoheterotrophic orchid)인 Wullschlaegelia aphylla의 방추형 뿌리에서 분리된 군체는 배지에 확산성 색소나 삼출물이 없어 불투명했습니다.

군체는 윗면이 희끄무레하거나 회색이고 아랫면이 갈색을 띤다. 균사체는 공중에 풍부하고 가장자리는 불규칙하고 공중에 있습니다. 군체는 벨벳 같은 질감과 거시적 구조가 없는 주름진 지형을 가지고 있었습니다.

염색되지 않은 균사체에서 쉽게 보이지 않는 구조는 곰팡이 균사체를 락토페놀 코튼 블루와 톨루이딘 블루-O로 염색한 후 식별이 용이하도록 했습니다. 여기에 제시된 곰팡이 분리 방법은 곰팡이 내생식물을 식별하기 위해 녹색 식물에도 적용될 수 있습니다. 분리된 균류는 공생 발아 시험에 사용할 수 있습니다.