Name: Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 배우세요 균류 내생균 분리 및 특성화 방법을 통해 Mycoheterotrophic 식물의 균류 다양성을 연구하세요. 이 기술은 무균 배양과 현미경 분석을 포함하며 생태학적 중요성을 밝히는 데 활용됩니다.

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저자는 공개할 것이 없으며 이해 상충도 없습니다.

식물 샘플의 표면적 소독은 제시된 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. PDA 접시에 마지막 세척 물방울이 있는 오염이 없는 것은 매우 바람직합니다. 박테리아는 격리 접시에서 오염 물질로 자주 관찰되며, 일반적으로 공기 중 포자 균류보다 더 많으며, 내생균은 식물 조직 내에서도 흔하다는 점을 고려하면 3,11. 따라서 장기 절편을 설치할 때 배양 배지에 항생제를 첨가하는 것이 필수적입니다. 다양한 유형의 항생제를 결합할 때 더 나은 결과를 얻을 수 있으며, 그 결과 작용의 스펙트럼이 더 넓어집니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 PDA와 AA를 사용하면 필연적으로 특정 종을 선택하고 다른 종을 선호하지 않기 때문에 곰팡이를 분리하는 데 내재된 편향입니다. 다른 배양 배지의 조합은 편향을 최소화할 수 있지만, 그러한 한계를 없애지는 못한다9.
<p class="jove_...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

내생균(endophytic fungi)은 식물 장기와 조직의 내부에 눈에 띄지 않는 감염(즉, 숙주에게 해를 끼치지 않고)에 서식하는 균류입니다.1,2. 이러한 균류는 숙주 식물과 중성 또는 유익하게 상호 작용할 수 있고, 병원균 및 불리한 환경 조건에 대한 저항성을 부여할 수 있으며, 식물에 유익한 화합물(예: 성장 인자 및 기타 식물 호르몬)의 합성에 기여할 수 있습니다1,3. 균근 내생식물(Mycorrhizal endophytes)은 식물과 균근 결합을 이루는 균류로, 영양소 전달에 참여한다4. Orchidaceae에서 균근 내생식물과의 상호 작용은 대다수의 종에서 종자 발아와 가족의 모든 식물에서 묘목 설립에 기본입니다5. 이러한 맥락에서, 진균 종속영양 난초는 전체 생애 주기 동안 이러한 균류에 의한 미네랄 영양소와 탄소 화합물 전달에 의존하기 때문에 균근 파트너에 대한 완전한 의존의 경우를 나타낸다6. 따라서 연관 균류의 분리 및 식별은 mycoheterotrophic life 전략을 조사할 때 기본 기반입니다. 더욱이, 균 종속 영양 식물에서 곰팡이 내생식물의 역할이나 이러한 곰팡이 7,8의 실제 다양성에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다.
내생균의 조사는 전통적으로 배양 독립적 또는 의존적이라고 설명되는 다양한 기술을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들어 (a) 직접 관찰, (b) 곰팡이 분리 및 형태학적 및/또는 분자 식별, (c) 식물 조직의 전체 DNA 추출 및 분자 식별9. 직접 관찰 (a)에서, 내생균류는 식물 세포 및 조직의 내부에 있는 동안 광 또는 전자 현미경(light or electron microscopy)9에 의해 조사될 수 있으며, 이는 Pena-Passos et al.10에 의해 상이한 현미경 프로토콜이 상세히 기술되어 있기 때문이다. 분리 방법 (b)에 의해, 곰팡이 내생식물은 그들의 군집, 균사 및 생식 또는 저항 구조 형태에 따라 특성화될 수 있다. 또한 분리 기술을 통해 DNA 추출, 분자 식별 서열(바코드 또는 지문)의 증폭 및 염기서열분석을 통해 분리물의 분자 식별을 수행할 수 있습니다11. 후자의 기술(c)은 식물 조직의 내부(메타바코드화)에 있는 동안 DNA 추출에 따라 내생균의 분자 식별을 가능하게 하고, 라이브러리 준비 및 염기서열분석12을 수행한다.
또한, 곰팡이 분리물은 독립 영양 또는 mycoheterotrophic 난초의 종자를 사용하여 공생 발아 시험에 적용될 수 있습니다. 이러한 응용의 예는 Sisti et al.13에 의해 수행된 조사로, 비균근 내생균을 포함하는 일부 분리물과 관련하여 진균종속영양 난초인 Pogoniopsis schenckii에서 원시관 발달의 발아 및 초기 단계를 설명합니다. 적용된 공생 발아 프로토콜은 Pena-Passos et al.10의 비디오에 자세히 설명되어 있습니다. 균류를 다른 식물 기관과 연관시켜 분리하면 식물-균류 상호 작용의 특성에 대한 다양한 조사에 초점을 맞출 수 있습니다(예: 연관성의 생태학적 또는 생리학적 측면을 이해하고 균류에서 식물로의 영양분 전달에 대한 조사)9.
섹션 1에 제시된 방법론은 지하 장기 샘플 수집을 기반으로 하는데, 이러한 장기는 수집에 가장 어려움을 나타내며 균근 내생식물이 군집을 이루기 때문에 주요 관심사입니다. 그러나, 포함된 프로토콜(단계 1.1 및 1.2)은 다른 진균종속영양 식물 기관(예를 들어, 뿌리줄기, 꽃줄기 및 과일)에 적용될 수 있다. 1.1단계에서 설명된 수집 방법은 형태학적 특성화(섹션 4 및 5)를 위한 내생균(섹션 2) 및/또는 분리 식별을 위한 전체 DNA 추출(섹션 6)을 위해 지정됩니다. 반면에, 1.2단계에서 설명한 수집 방법론은 메타바코딩 기법을 위한 식물 조직의 전체 DNA 추출에만 할당됩니다(섹션 7). 섹션 3에서는 사상균 저장 및 보존을 위한 4가지 방법을 제시하는데, 2개는 단기 보관(3-6개월)이고 다른 2개는 장기 보관(&gt;1년)에 적합합니다. 형태학적 특성화(섹션 4 및 5)는 이를 강화하고 곰팡이 거대 및 미세 형태에 대한 중요한 정보를 제공하기 위해 분자 식별과 관련될 수 있습니다. 그림 1 은 그 이후에 설명된 집합적 방법론을 요약한 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> 그림 1: 제시된 방법의 개략적 요약. 식물 수집 및 곰팡이 분리, 보존 및 배양 의존적 및 독립적 방법론에 의한 분자 식별. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>접착 테이프</td><td></td><td></td><td>(모든 회사에서, 미세형태학적 분석에서 접착 테이프 장착용)</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td><td>(식물 조각 설치용, 다른 항생제 사용 가능 - 2.2.1단계 확인)</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td></td><td></td><td>(모든 회사에서, 여러 단계의 재료 살균용)</td></tr><tr><td>세균학 한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>(많은 단계)</td></tr><tr><td>C1, C2, C3, C4, C5, C6 솔루션</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매)</td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>5810 G</td><td>(진균 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Merck</td><td>CLS430828</td><td>(시료 채취용)</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>(진균 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>Supelco</td><td>75768</td><td>(균사 염색용)</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Merck</td><td>BR114831</td><td>(용) 많은 단계)</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Supelco</td><td>100983</td><td>적절한 희석을 수행해야 합니다(여러 단계)</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>3609</td><td>(곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출)</td></tr><tr><td>여과지</td><td>머크</td><td>WHA10010155</td><td>(여러 단계)</td></tr><tr><td>유리 시험관</td><td>머크</td><td>CLS7082516</td><td>(껍질을 벗기지 않은 쌀알의 냉동 보존을 위해)</td></tr><tr><td>유리솜</td><td>Supelco</td><td>20411</td> <td>(껍질을 벗기지 않은 쌀알의 냉동 보존 용)</td></tr> <tr><td>포도</td>당 <td>시그마 -알드리치</td><td>G8270</td><td>또는 포도당 (질석의 냉동 보존 용)</td></tr> <tr><td>글리세롤</td><td>시그마 -알드리치</td><td>G5516</td><td>또는 글리세린 (질석의 냉동 보존, LPCB 준비 용)</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>563935</td> <td>(곰팡이에서 총 DNA 추출 용) 분리)</td></tr><tr><td>젖산</td><td>시그마-알드리치</td><td>252476</td><td>(LPCB - 균사 염색 준비용)</td></tr><tr><td>락토페놀 블루 용액(LPCB)</td><td>시그마-알드리치</td><td>61335</td><td>(균사 염색용)</td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td>(클래스 I, 모든 회사, 여러 단계)</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td></td><td></td><td>(모든 회사, 균사 관찰용)</td></tr><tr><td>MB 스핀 컬럼</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매)</td></tr><tr><td>메틸블루(코튼 블루)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5528</td><td>(LPCB - 균사 염색 준비용)</td></tr><tr><td>미세원심분리기 튜브(1.5mL)</td><td>Merck</td><td>HS4323</td><td>(곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>미세원심분리기관(2mL)</td><td>Merck</td><td>BR780546</td><td>(여러 단계용)</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td></td><td></td><td>(곰팡이 분리물 보존용)</td></tr><tr><td>종이 봉지</td><td></td><td></td><td>평균 크기 150mm x 200mm(샘플 채취용)</td></tr><tr><td>페트리 접시(유리, 120mm x 20mm)</td><td>Merck/Pyrex</td><td>SLW1480/10D</td><td>(오토클레이브 가능, 곰팡이 슬라이드 배양용, 높은 것 선호)</td></tr><tr><td>페트리 접시(유리, 50mm x 17mm)</td><td>Merck/Aldrich</td><td>Z740618</td><td>(곰팡이 분리 물의 정제를 위해); 대안 : 폴리스티렌 페트리 접시 (멸균, &gamma; -방사선 조사, 비 오토 클레이브)</td></tr><tr><td>페트리 접시 (유리, 80 mm x 15 mm)</td><td>Merck / Brand</td><td>BR455732</td> <td>(식물 조각 설치 용); 대안 : 폴리스티렌 페트리 접시 (sterile, &gamma;-irradiated, non-autoclavable)</td></tr> <tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td> <td>(곰팡이 분리 물에서 총 DNA 추출, LPCB 준비)</td></tr><tr><td>도자기 모르타르</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td>(진균 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>도자기 유봉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247502</td><td>(진균 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>감자 포도당 한천(PDA)</td><td>Millipore</td><td>P2182</td><td>(여러 단계용)</td></tr><tr><td>PowerBead 튜브</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoil 키트와 함께 구매)</td></tr><tr><td>신속한 장착 매체 (Entellan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.0796</td><td>(곰팡이 슬라이드 배양용)</td></tr><tr><td>실리카겔</td><td>Supelco</td><td>717185</td>(<td>껍질을 벗기지 않은 쌀알의 동결 보존용)</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>(곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>라우릴 설페이트 나트륨염(총 DNA 추출용) 곰팡이 분리물에서)</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨(2% 활성 염소 포함)(</td><td></td><td></td><td>상용 제품, 표재성 박멸용)</td></tr><tr><td>토양 DNA 추출 키트(DNeasy PowerSoil 키트)</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(식물 기관에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>분광 광도계 - Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>(식물 기관에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td></td><td></td><td>(=해부 현미경, 모든 회사, 거대 형태 분석용)</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td>(식물 조각 설치용)</td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>EP5362000035</td><td>(또는 타사 제품)</td></tr><tr><td>조직 균질화 및 세포 용해기</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (식물 기관에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich/Harleco</td><td>364-M</td><td>(균사 염색용)</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td><td>(질석의 동결 보존용)</td></tr><tr><td>Tris Base Solution (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1699</td><td>(곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>껍질을 벗기지 않은 쌀알</td><td></td><td></td><td>(냉동 보존용)</td></tr><tr><td>U자형 유리 막대</td><td></td><td></td><td>(또는 적응 - 곰팡이 슬라이드 배양을 위한 5.4.1단계 확인)</td></tr><tr><td>질석</td><td></td><td></td><td>미세 과립계(질석의 동결 보존용)</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td><td>BMSBV1000</td>(<td>곰팡이 분리물에서 총 DNA 추출용)</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td> <td>(질석의 냉동 보존)</td></tr></tbody></table>

mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 dna 추출

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic 식물은 가장 극단적 인 형태의 균근 의존성 중 하나를 나타내며 독립 영양 능력을 완전히 잃었습니다. 다른 중요한 자원과 마찬가지로 이 식물과 밀접하게 연관되어 있는 균류는 식물에게 필수적입니다. 따라서 mycoheterotrophic 종을 연구하는 데 가장 관련성이 높은 기술 중 일부는 관련 균류, 특히 뿌리 및 지하 기관에 서식하는 균류를 조사할 수 있는 기술입니다. 이러한 맥락에서, 배양 의존적 및 배양 비의존성 내생균을 식별하기 위한 기술이 일반적으로 적용된다. 곰팡이 내생식물을 분리하는 것은 형태학적으로 식별하고, 다양성을 분석하고, 난초 종자의 공생 발아에 적용하기 위한 접종물을 유지하는 수단을 제공합니다. 그러나 식물 조직에 서식하는 다양한 비배양 균류가 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 배양에 독립적인 분자 식별 기술은 종의 다양성과 풍부도에 대한 더 넓은 범위를 제공합니다. 이 기사는 두 가지 조사 절차, 즉 문화 종속 및 독립 조사 절차를 시작하는 데 필요한 방법론적 지원을 제공하는 것을 목표로 합니다. 배양 의존적 프로토콜과 관련하여, 균종속영양 식물의 지하 및 공중 기관에서 사상균을 분리하고, 분리물을 수집하고, 슬라이드 배양 방법론에 의한 균사를 형태학적으로 특성화하고, 전체 DNA 추출을 통해 균류의 분자 식별과 함께 채취 장소에서 실험실 시설까지 식물 샘플을 수집하고 유지하는 과정이 자세히 설명되어 있습니다. 배양에 독립적인 방법론을 포괄하는 세부 절차에는 메타게놈 분석을 위한 식물 샘플 수집과 상용 키트를 사용하여 아클로로필 식물 장기에서 전체 DNA 추출이 포함됩니다. 마지막으로, 연속성 프로토콜(예: 중합효소연쇄반응[PCR], 염기서열분석)도 분석을 위해 제안되며, 여기에 기술이 제시됩니다.

격리 프로토콜에서 마지막 세척에 사용된 물로 인한 오염이 있고 접종된 파편이 있는 페트리 접시에서도 오염이 검출되는 것을 고려하면 오염 물질의 유형에 따라 다른 조치를 취할 수 있습니다(표 1). 이 절차는 포자가 많은 곰팡이 오염 물질의 경우 처음부터 반복해야 하며, 이는 또한 성장을 가속화하고 선택한 항생제에 내성이 있는 강렬한 증식 박테리아를 나타냅니다. 대신, 곰팡이 오염 물질이 느린 성장을 나타내거나 포자가 형성되지 않는 경우, 프로토콜의 후속 단계에서 분리하는 것을 피할 수 있습니다. 마지막으로, 천천히 증식하는 박테리아 균주에 의한 오염은 균사를 회수할 때 후방 단계, 특히 정제에서 쉽게 피할 수 있습니다.
이전에 제시된 모든 사례에서 이상적인 시나리오는 내성 박테리아가 첫 번째 접...

현재 논문은 식물 관련 내생균의 분리, 분리물의 장기 보존, 형태학적 특성 분석 및 후속 분자 식별 및 균유전체 분석을 위한 전체 DNA 추출을 위한 상세하고 적절한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

여기에 제시된 기술은 다양한 식물 기관과 관련된 내생균 군집을 조사하는 데 유용합니다. 내생균 분리는 이들의 식별을 가능하게 하며, 공생 발아와 같은 다른 기술에서 가치가 있습니다. 먼저 8-10 센티미터의 PDA 배양 배지 페트리 접시에 항생제 리터당 3 밀리리터를 보충하십시오.사용하기 전에 배양 배지 페트리 접시를 섭씨 36도에서 24시간 동안 배양하여 오염 여부를 확인하십시오. 다음 날, 표준 절차를 사용하여 건강한 균하영양 식물 조각을 표면적으로 제거하고 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 샘플의 표면 소독 효능을 평가하려면 PDA에서 샘플을 마지막으로 세척할 때 사용된 증류수 몇 방울을 접종합니다.그런 다음 화염 메스와 집게를 사용하여 샘플을 0.2cm 두께의 조각으로 나눕니다. 샘플을 절편화하여 매체와 접촉할 표면적을 증폭합니다. 항생제가 보충된 PDA 플레이트에 지하 장기의 5개 조각을 접시 가장자리를 건드리지 않고 가능한 한 멀리 놓습니다.페트리 접시를 접착 필름으로 밀봉하고 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 5일 동안 보관합니다. 서브 컬쳐 하루 전에 리터 당 5-7 그램의 AA 배지를 사용하여 5 센티미터 페트리 접시를 준비하고 플레이트를 섭씨 36도에서 24 시간 동안 배양합니다. 진균 분리물을 정제하려면 PDA 플레이트 콜로니를 색상, 성장 패턴, 질감 및 마진 형식으로 구별합니다.그런 다음 접시 바닥면의 식민지 여백을 구분합니다. 또한 코드로 콜로니를 식별합니다. 오토클레이브 나무 이쑤시개 끝을 사용하여 식별된 곰팡이 군집의 가장자리에서 소량의 균사체를 회수하고 AA 플레이트를 줄무늬로 만들어 서로 1cm에 3개의 줄무늬를 생성하고 접시 가장자리를 생성합니다.스티커 용지와 연필을 사용하여 AA 플레이트에 적절한 코드로 라벨을 붙입니다. 접시를 밀봉한 후 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 3일 동안 배양합니다. 배양 후 플레이트를 꼼꼼하게 관찰하여 개별 군체를 형성하는 미세한 균사를 식별합니다.영구 마커를 사용하여 개별 식민지의 영역을 구분합니다. 오토클레이브 이쑤시개를 사용하여 콜로니가 포함된 배지의 일부를 절단하고 절단된 부피를 항생제 없이 새 PDA 페트리 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 페트리 접시에 분리 코드를 표시한 후 접착 필름으로 밀봉하고 섭씨 25도에서 27도의 어두운 곳에서 7-14일 동안 보관합니다.Castellani의 방법으로 곰팡이 분리물의 보존을 시작하려면 오토클레이브 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 0.5밀리리터의 증류수를 추가합니다. 오토클레이브 이쑤시개를 사용하여 이미 성장한 정제된 분리물의 균사체 가장자리에서 0.5 x 0.5cm 직육면체 배지를 자릅니다. 4-6개의 직육면체를 증류수와 함께 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.튜브를 섭씨 25도의 어두운 곳에 필요한 만큼 보관하십시오. 필요한 경우 직육면체를 회수하여 새 PDA 접시의 중앙에 놓아 저장된 분리물을 성장시킵니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 Toluidine blue-O 얼룩을 한 방울 떨어뜨려 티즈 마운트 방법을 시작합니다.이러한 기술에는 다른 얼룩이 사용될 수 있습니다. 고압멸균 이쑤시개를 사용하여 성장한 분리물에서 일부 균사를 조심스럽게 제거하고 얼룩 방울에 넣습니다. 커버 슬립을 놓고 광학 현미경으로 분석합니다.접착 테이프 장착 방법의 경우 깨끗한 유리 슬라이드에 락토페놀 코튼 블루 얼룩 한 방울을 떨어뜨립니다. 투명 접착 테이프 스트립을 유리 슬라이드와 중앙 얼룩 방울에 잘 맞는 크기로 자릅니다. 접착 스트립의 끈적끈적한 표면을 균사체 표면으로 향하게 하고 균사를 너무 많이 누르거나 모으지 않고 일부 균사를 수집하십시오.그런 다음 테이프를 유리 슬라이드에 붙여서 얼룩이 수집된 균사와 접촉하도록 합니다. 테이프 위에 물 한 방울을 떨어뜨리고 광학 현미경으로 슬라이드를 분석하기 전에 커버 슬립을 놓습니다. 단편의 내부에서 나오는 사상균 균사체의 작은 그룹의 성장은 PDA 배지에 균하영양 식물 장기 단편을 접종한 지 5일 후에 관찰되었습니다.정제된 분리물의 접종 7 내지 14일 동안, PDA에서 순수 진균 분리물 콜로니의 원심 성장이 관찰되어, 유일한 원형 균사체를 형성하였다. 가능한 오염은 쉽게 식별되어 배지에서 성장 형태 측면, 색상 및 안료 생산과 관련된 콜로니 균질성을 손상시켰습니다. 균하영양 난초(mychoheterotrophic orchid)인 Wullschlaegelia aphylla의 방추형 뿌리에서 분리된 군체는 배지에 확산성 색소나 삼출물이 없어 불투명했습니다.군체는 윗면이 희끄무레하거나 회색이고 아랫면이 갈색을 띤다. 균사체는 공중에 풍부하고 가장자리는 불규칙하고 공중에 있습니다. 군체는 벨벳 같은 질감과 거시적 구조가 없는 주름진 지형을 가지고 있었습니다.염색되지 않은 균사체에서 쉽게 보이지 않는 구조는 곰팡이 균사체를 락토페놀 코튼 블루와 톨루이딘 블루-O로 염색한 후 식별이 용이하도록 했습니다. 여기에 제시된 곰팡이 분리 방법은 곰팡이 내생식물을 식별하기 위해 녹색 식물에도 적용될 수 있습니다. 분리된 균류는 공생 발아 시험에 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

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글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 이 기사에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP가 미생물에 미치는 영향을 정량화하기위한 일반적인 지침을 소개합니다.

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엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

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고처리량 scRNA-seq 분석법의 실현 가능성과 효과는 식물 연구에서 단일 세포 시대를 예고합니다. 여기에 제시된 것은 특정 Arabidopsis thaliana 뿌리 세포 유형을 분리하고 후속 전사체 라이브러리 구성 및 분석을 위한 강력하고 완전한 절차입니다.

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

여기에서 우리는 숲 나무 천공충에서 곤충병원성 균류를 얻기 위한 프로토콜과 딱정벌레목 모델 곤충을 사용하여 곤충병원성 활성을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 자연 산림에서 나무를 뚫는 곤충 해충으로부터 곤충 병원성 곰팡이 자원을 탐사하는 데 효율적이고 편리합니다.

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer(포레스트 우드 보어의 곤충병원성 곰팡이의 격리, 행동 식별 및 병원성 평가)

iChip 기술은 토양에서 새로운 미생물 발견 속도를 높이는 저렴하고 간단한 현장 격리 장치를 사용합니다. 새로운 미생물은 다른 응용 분야 중에서도 토양 미생물 군집 또는 천연 제품 발견과 관련된 추가 연구에 사용할 수 있습니다.

iChip 기술을 사용한 토양 미생물 분리

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Mycoheterotrophic 식물에서 내생균 균류를 식별하기 위한 분리, 특성화 및 전체 DNA 추출

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