Name: Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 학습하세요 Acinetobacter 바이오필름 정량화 및 시각화 방법을 통해 균주 간 생물막 형성 능력 차이를 분석하는 기술입니다. 크리스탈 바이올렛 염색과 공초점 레이저 현미경을 활용하여 감염 관리 연구에 활용할 수 있습니다.

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본 연구는 과학기술정보통신부의 지원을 받아 한국식품연구원(KFRI)의 본과제(E0210702-03)의 지원을 받았다.

1. 세균 접종물의 제조
<ol><li>-80°C에서 보관된 글리세롤 스톡 바이알을 제거합니다.</li>
	<li>멸균 피펫 팁을 사용하여 바이알에서 박테리아 균주(2-10 μL)를 제거합니다. 참고: 이 프로토콜에는 아시네토박터 균주, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) 및 A. ursingii (24-1)가 사용됩니다.</li>
	<li>시판되는 혈액 한천 플레이트(5% 양의 혈액이 보충된 트립틱 대두 한천, 재료 표 참조)에 박테리아를 접종합니다. 알림: 영양 한천 또는 MacConkey 한천과 같은 다른 매체도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>간헐적으로 연소되는 멸균 루프를 사용하여 한천 표면을 줄무늬로 만들어 얇게 만듭니다.</li>
	<li>한천 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 놓고 30°C에서 밤새 20-24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>멸균 바늘로 박테리아 배양액의 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 멸균 뇌 심장 주입액(BHI, 재료 표 참조)을 배양액과 함께 접종합니다.</li>
	<li>접종한 육수를 30°C의 진탕 인큐베이터에서 약 150rpm으로 20-24시간 동안 밤새 배양합니다.</li>
	<li>하룻밤 배양액 1mL를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 실온(RT)에서 10분 동안 6,000× g 의 야간 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>소용돌이를 사용하여 펠릿을 1mL 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>상온에서 10분 동안 6,000× g 으로 원심분리하고 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>소용돌이를 사용하여 멸균된 10배 희석된 BHI에 펠릿을 600nm에서 약 0.1의 광학 밀도로 재현탁시킵니다. 참고: 약 0.1의 광학 밀도는 약 107 CFU/mL에 해당합니다.</li>
</ol>2. 크리스탈 바이올렛을 이용한 생물막 정량화
<ol><li>멸균 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가하고( 재료 표 참조) 가장 바깥쪽 웰 각각에 200μL의 탈이온수를 추가하여 내부 웰이 건조되는 것을 방지합니다15.</li>
	<li>200μL의 10배 희석된 BHI를 음성 대조군과 동일한 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다. 참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다.</li>
	<li>각 웰에 300μL PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 참고: 멀티채널 피펫은 종종 여러 샘플에 더 편리합니다.</li>
	<li>2.5단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>200μL 크리스탈 바이올렛 용액(1%)( 재료 표 참조)을 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2.4-2.6단계를 반복합니다.</li>
	<li>각 웰에 200μL의 절대 에탄올을 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>각 웰에서 100μL 용출액을 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>마이크로플레이트 리더를 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>흡광도가 2.0을 초과하는 경우 절대 에탄올에서 시료를 흡광도 2.0 이하로 적절하게 희석하고 2.11단계와 같이 측정한다. 그런 다음 관찰된 값에 희석 계수를 곱하여 샘플의 흡광도(최종 값)를 계산합니다.</li>
	<li>동일한 웰 플레이트에 있는 테스트 샘플의 각 웰 값에서 음성 대조군의 평균값을 빼서 샘플의 실제 흡광도를 계산합니다.</li>
</ol>3. 생물막 생존력 카운트
<ol><li>멸균 폴리스티렌 12웰 플레이트(15)의 각 웰에 1mL 접종물(1단계)을 추가합니다. 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>각 웰에 1.5mL 멸균 PBS를 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 각 웰에 1mL의 멸균 PBS를 추가합니다.</li>
	<li>장착된 셀 스크레이퍼를 사용하여 우물의 바닥과 벽 표면을 긁어냅니다.</li>
	<li>수확한 세포 현탁액을 9mL 식염수(0.85% NaCl)와 10-20개의 유리 비드가 들어 있는 멸균 플라스틱 튜브(10-1)로 옮깁니다( 재료 표 참조). 알림: 웰 바닥 표면에 남아 있는 잔류 생물막 파편을 수집하기 위해 10-1 튜브의 식염수를 사용하여 피펫으로 재현탁 및 이송할 수 있습니다.</li>
	<li>최대 속도로 10-1 튜브를 60초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>9mL 식염수(0.85% NaCl)를 최대 10-7까지 포함하는 다음 멸균 튜브(10-2)에 1mL를 옮겨 10배 연속 희석합니다.</li>
	<li>각 희석액에서 100 μL를 아시네토박터 한천( 재료 표 참조)에 펴 바르고 한천 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 플레이트의 일반적인 빨간색 콜로니 수를 10에서 250 사이의 범위에서 수동으로 계산합니다.</li>
	<li>아래 방정식을 사용하여 각 웰의 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 계산하십시오. 생존 세포 = 콜로니 수 × 희석 계수 × 10</li>
</ol>4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 생물막 시각화
<ol><li>현미경 분석을 위한 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL 접종물을 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 25°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>300μL 필터 멸균 탈이온수를 각 웰에 조심스럽게 추가하고 피펫으로 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>필터 멸균된 탈이온수에 각각 10μM 및 60μM의 최종 농도로 희석한 SYTO 9와 프로피듐 요오드화물( 재료 표 참조)의 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>혼합물을 200 μL의 각 웰에 추가하고 어두운 곳에서 RT에서 20-30 분 동안 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>4.3-4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>여기 파장이 각각 488nm 및 561nm이고 방출 파장 범위가 499-535nm 및 568-712nm인 CLSM을 사용하여 바닥 표면 부착 생물막을 시각화합니다.</li>
</ol>

아시네토박터 생물막 형성 평가 및 생물막의 특성화

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

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기술된 프로토콜을 사용하여, 다양한 정도의 아시네토박터 분리물의 생물막 형성을 측정하고, 시각화하고, 생물막에서 생존 가능한 세포를 추정하였다(도 1, 도 2 및 도 3).
이 프로토콜에서는 성장을 위한 30°C와 아시네토박터의 생물막 형성을 위한 25°C의 두 가지 다른 온도를 사용했습니다. 많은 연구에서 아시네토박터의 최적 성장을 위해 30°C 이상을 사용했기 때문에 30°C를 사용하였는데, 이는 충분한 접종물12,13,14,17을 얻기에 적합...

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히 의료 시설에서 인체 감염이 점점 더 많이 보고되고 있습니다1. 병원, 의료 시설 및 식품 관련 환경에 널리 퍼져 있습니다 2,3,4. 침대 레일, 침대 옆 탁자, 인공 호흡기 표면 및 싱크대와 같은 병원 표면을 포함한 환경에서 장기간 생존할 수 있습니다4. 환경 표면에서의 이러한 지속성은 아시네토박터4의 병원 감염에 기여하는 중요한 요인 중 하나일 수 있습니다.
생물막은 미생물 생명체의 한 형태이며 살아있는 미생물 세포와 세포의 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 미생물 매트릭스입니다5. 미생물 세포는 매트릭스에 내장되어 있으며 종종 열, 염분, 건조, 항생제, 소독제 및 전단력과 같은 환경 스트레스에 매우 강합니다 6,7.
아시네토박터는 표면에 생물막을 형성할 수 있으며, 이는 병원 표면을 포함한 환경 표면에서 생존 연장에 기여하고 항생제 치료에 대한 내성을 향상시키는 데 기여할 수 있음을 시사합니다 8,9. 또한 아시네토박터의 생물막 형성은 인간의 임상 결과와 밀접한 관련이 있을 수 있다8. 따라서 아시네토박터 균주의 생물막 형성성은 환경 생존 및 인간 감염을 예측하는 지표 중 하나가 될 수 있다 8,10.
표면 부착 생물막은 정량화하고 시각화하여 생물막 형성성을 평가할 수 있습니다. 표면 부착 생물막을 정량화하기 위해, 생물막은 일반적으로 크리스탈 바이올렛과 같은 생물막 염색 염료에 의해 염색되고, 염료는 용액에서 용출되고 광학 밀도11에 대해 측정된다. 생물막의 시각화는 생물막 형성성을 평가하는 또 다른 좋은 접근법이다11. 형광 염료를 사용하여 특이성을 사용하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 시각화 방법은 SEM12,13과 같은 다른 기술에 비해 생물막 형태를 특성화하는 데 더 유용할 수 있습니다.
생물막에서 생존 가능한 세포는 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 추정하기 위해 계수될 수있다 11. biofilms에서 끼워넣어진 생존 가능한 세포는 분리되고, 묽게 되고, 한천 격판덮개에 퍼지고, 배양되고, 열거됩니다. 세포의 수가 많을수록 전염성 투여량을 충족시킬 가능성이 높기 때문에 세포 수13,14와 관련된 감염 가능성과 같은 생물막에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 기사에서는 (1) 표면 부착 생물막을 정량화하고, (2) 생물막에서 생존 가능한 세포를 계산하고, (3) 아시네토박터의 CLSM을 사용하여 생물막을 시각화하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 아시네토박터 분리물의 생물막 형성성을 평가하고 이들의 생물막을 특성화하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>폴리스티렌 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) 육수</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>혈액 한천 베이스 플레이트</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>아시네토박터</td></tr><tr><td>CHROMagar 아시네토박터</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>아시네토박터</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛용 선택적 플레이트 솔루션</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE / DEAD 생물막 생존 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 및 프로피듐 요오드</td></tr><tr><td>화물 마이크로 플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant Biofilm</td><td>측정</td></tr><tr><td>RBC 유리 도금 비드</td><td>RBC</td><td>RG001</td><td>유리 구슬</td></tr> <tr><td>및 플레이트 96 웰 블랙</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>CLSM용 마이크로플레이트</td></tr></tbody></table>

acinetobacter biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키며 생물막 형성은 병원 환경과 같은 건조한 표면에서 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 생물막 정량화 및 시각화는 아시네토박터 균주가 병원 내 감염을 일으킬 가능성을 평가하는 중요한 방법입니다. 마이크로플레이트 표면에 형성되는 생물막은 부피와 세포 수 측면에서 정량화할 수 있습니다. 생물막 부피는 크리스탈 바이올을 사용하여 염색하고, 세척하고, 에탄올을 사용하여 탈염한 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 염료를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 생물막에 묻힌 세포의 수를 정량화하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 식염수에서 수확하고, 유리 구슬의 존재 하에서 격렬하게 교반하고, 아시네토박터 한천에 퍼뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다. 배양 후에, 빨간 식민지는 biofilms에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 열거됩니다. 이 실행 가능한 계수 방법은 혼합 종 생물막에서 아시네토박터 세포를 계수하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아시네토박터 생물막은 형광 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현미경 분석을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트는 생물막을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 바닥 표면에 부착된 생물막을 SYTO9 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색하고 세척한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화합니다.

프로토콜에 따라, 원래 부엌 표면에서 분리된 아시네토박터 분리물의 생물막을 폴리스티렌 96웰 플레이트에 형성하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 염료를 에탄올에 용해시키고 생물막 질량을 측정했습니다(그림 1). biofilms의 수는 OD 0.04에서 1.69 (숫자 1)에 배열하는 긴장에 매우 따라서 변화했습니다. Stepanović et al.16에 의해 확립된 기준에 기초하여, A. bouvetii 를 제외한 모든 분리물은 생물막을 형성했습니다. A. 방사성 저항제 는 약한 생물막을 형성했습니다. A. junii 와 A. baumannii 는 강한 biofilms를 형성하는 그러나, A. pittii 와 A. ursingii 는 온건한 biofilms를 형성했습니다...

이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

생물막은 살아있는 미생물 세포로 구성되며 표면에서 제거하기가 어렵습니다. 우리 환경에서 흔히 발견되는 아시네토박터 균주는 병원 감염을 일으키며 표면에 생물막을 형성하는 것으로도 알려져 있습니다. 따라서 우리는 아시네토박터 생물막을 정량화하고 시각화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.당사의 프로토콜은 아시네토박터의 생물막을 정량화하고 시각화하는 간단하고 쉬운 방법을 제공합니다. biofilms 안쪽에 세포의 생존 가능한 수는 생존 가능한 조사 방법을 사용하여 정량화됩니다. 우리의 연구 결과는 자연적으로 존재하는 아시네토박터 벡터 균주가 생물막 형성에 대한 매우 다양한 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.더구나, 각종 biofilms 내의 명백한 형태학적인 다름이 존재할 것입니다. 이는 아시네토박터 균주 간의 큰 변이의 원인에 초점을 맞춘 연구의 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴.  J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

이 프로토콜은 슬라이드 챔버 모델을 사용하여 숙주 인자에 노출된 후 생물막 발달의 시각화를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생물막 매개변수를 분석할 뿐만 아니라 생물막 개발을 직접 시각화할 수 있습니다.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.

정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

이 프로토콜은 결정-바이올렛 바이오매스 분석, 타임랩스 위상 차비 역학, 공초점 3D/매트릭스 매핑, SEM 초구조, 생체 내 햄스터 감염 모듈을 결합한 모듈형 BSL-2 워크플로우를 제공하여 렙토스피라 바이오필름의 기능적 역할을 배양, 정량, 특성화, 조사하여 실험실 간 돌연변이 및 반바이오필름 개입의 표준화된 평가를 가능하게 합니다.

렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

학습하세요 Acinetobacter 바이오필름 정량화 및 시각화 방법을 통해 균주 간 생물막 형성 능력 차이를 분석하는 기술입니다. 크리스탈 바이올렛 염색과 공초점 레이저 현미경을 활용하여 감염 관리 연구에 활용할 수 있습니다.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

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