렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

우리는 환경과 숙주 지속을 가능하게 하는 보호 구조로서 바이오필름을 연구하며, 형성 역학, 분자 조성, 적응적 특징 및 감염에 대한 기여도를 조사합니다. 결정 생물 분석, 시간 텍스트 이미징, 공초점 현미경, 주사 전자현미경, 전사체학을 실험실에서 결합하여 통합 다차원 분석을 통해 바이오필름 연구를 발전시킵니다. 먼저, 평평한 바닥의 스크류 캡 유리관 내 EMJH 배양액에서 렙토스피라 세포를 배양합니다.

배양물을 30도 섭씨의 호기성 조건에서 중간 로그 단계에 도달할 때까지 흔들지 않고 배양하세요. 배양 밀도가 405나노미터에서 0.2에서 0.4 사이로 도달하도록 해야 하며, 이는 2에서 5 곱하기 10의 제곱 제곱에 해당합니다. 20배 배율의 암시야 현미경을 사용해 세포가 모달(modal)이고 뭉쳐 있지 않은지 확인하세요.

검증된 중간 로그 부정맥상 배양물을 신선한 EMJH 배지에서 1:100 비율로 희석하여 약 1 곱하기 10의 6 세포/밀리리터를 얻고, 소용돌이 없이 역전으로 부드럽게 혼합합니다. 이제 멸균 겸자를 사용해 0.1마이크로미터 무균 친수성 폴리카보네이트 멤브레인을 각 웰 바닥에 평평하게 놓고, 뚜껑이 있는 멸균 24웰 플레이트에 넣습니다. 각 웰에 멸균 EMJH 배지 1밀리리터를 추가하고, 막을 30도 섭씨에서 2시간 동안 미리 담가둡니다.

다음으로, 각 웰에서 막을 밀어내지 않고 담그는 용액을 제거하고, 1.5밀리리터의 희석된 박테리아 현탁액을 추가하여 막이 바닥에 단단히 고정되도록 합니다. 그 후 인큐베이터 안에 물이 담긴 쟁반을 놓아 습도를 유지하세요. 플레이트를 30도 섭씨에서 정적인 조건에서 배양하여 바이오필름 형성을 돕습니다.

성장이 느린 균주를 위해 최대 3주간 접시를 두는 것. 원하는 시점에 바이오필름을 건드리지 않고 가능한 한 많은 배양지를 조심스럽게 흡입하세요. 각 웰을 1밀리리터 살균 PBS로 부드럽게 세척한 뒤, 막을 바닥에 평평하게 유지하세요.

각 웰에 PBS에 4% 파라폼 알데히드 1밀리리터를 첨가하고 37도 섭씨에서 30분간 배큐하여 바이오필름 샘플을 고정합니다. 배양 후에는 고정제를 제거하고 1밀리리터 PBS로 두 번 부드럽게 헹군습니다. 각 웰에 0.1% 중량 대비 크리스탈 바이올렛 용액 1밀리리터를 추가하고, 실온에서 15분간 배양하며, 덮개 슬립이 완전히 잠기도록 합니다.

그 후 각 우물에서 크리스탈 바이올렛 염료를 버리고 PBS 1밀리리터로 두 번 세척합니다. 접시를 기울이고 남은 액체를 모두 빼내세요. 플레이트를 실온에 두어 바닥재가 완전히 마른 것처럼 보일 때까지 자연 건조시키고, 가능하면 하룻밤 동안 보관하세요.

다음으로, 각 우물에 50% 에탄올과 50% 빙하 아세트산으로 구성된 엘루시안 완충제를 500마이크로리터 추가합니다. 바이오필름에 결합된 얼룩을 완전히 녹이기 위해 피펫을 위아래로 움직이세요. 이제 각 샘플 200마이크로리터를 광학 투명 96웰 마이크로플레이트에 옮깁니다.

570나노미터에서 흡수를 측정하고, 모든 단계에서 처리된 접종되지 않은 대조군에서 배경값을 빼세요. 최소 세 번의 기술 복제에 대해 평균과 표준편차를 기록하세요. 앞서 보여준 것처럼 웰 플레이트에 바이오필름을 확보하세요.

4% 파라포름 알데히드와 1% 글루타알데히드 용액을 pH 7.4에서 0.2몰 나트륨 완충제에 첨가합니다. 고정된 샘플을 37도 섭씨에서 30분간 배양하세요. 고정제를 제거하고 PBS로 샘플을 두 번 헹구어 표면에 부착된 바이오필름을 보존하면서 박리를 최소화하세요.

이제 커버 슬립을 PBS에 희석한 1%사산화오스미늄에 담근 후 1시간 배양하여 주사 전자현미경 대비를 향상시킵니다. 그 다음 PBS로 기질을 두 번 헹구세요. 샘플을 등급 에탄올 시리즈에 10분씩 순차적으로 담가 탈수합니다.

다음으로 헥사메틸디실라잔 500마이크로리터를 추가하고 5분간 배양합니다. 그 후 신선한 헥사메틸디실라잔으로 교체하고 추가로 5분간 배양합니다. 그 후 과도한 용액을 제거하고 샘플을 완전히 공기 건조시켜 훈기 후드 아래에서 건조시킵니다.

이제 건조된 샘플을 양면 전도성 탄소 테이프를 사용해 주사 전자현미경 스텁에 부착합니다. 샘플에 약 10나노미터의 금 또는 백금을 얇게 코팅하여 전자 대비를 높이고 영상을 만듭니다. 마지막으로, 준비된 스텁을 적절한 샘플 홀더를 사용해 주사 전자현미경에 넣습니다.

가능하면 영상 품질을 높이기 위해 챔버를 밤새 비우세요. 그 후 적절한 배율을 사용하여 5킬로볼트에서 15킬로볼트 사이에서 2차 전자 이미지를 획득하여 바이오필름의 초구조를 시각화합니다. 21일간의 잠복 후, 크리스탈 바이올렛 염색 결과, 레프토스피라 인터로건과 레프토스피라 비플렉스카의 폴리카보네이트 필터와 유리 커버 슬립에서 눈에 띄는 바이오필름 패턴이 드러났습니다.

각 종은 점모양, 가지, 망상무늬 등 독특한 건축적 발자국을 보입니다. 570나노미터에서의 흡광도 측정은 모든 시점에서 leptospira byflexa 바이오필름에서 leptospira interrogans보다 결정 자비 잔류가 더 높다는 것을 확인하여, 균주 내 생체량 축적이 더 높음을 나타냈다. 렙토스피라 인터로건 바이오필름의 주사 전자현미경 촬영은 3일 된 생체막에서 초기 세포외 기질 침착물을 포착했으며, 14일째에는 3차원 구조를 가진 성숙하고 채널링된 기저면, 21일째에는 완전히 발달한 밀집된 구조의 매트릭스 응착이 확인되었다.

최적화된 프로토콜은 동일한 배양에서 보완적인 읽음을 동기화하여 견고성을 높이고 변동성을 줄이며 동적 및 구조 정보를 드러내며, 단일 방법 접근법으로 제공됩니다. 보완적 분석을 통합함으로써 우리의 연구 결과는 바이오필름 평가를 표준화하고 렙토스피라 역학과 구조를 명확히 했습니다. 이들은 구조와 병원성을 연결하고 재현 가능한 비교 연구를 강화합니다.

미래의 돌연변이체는 조절과 바이오필름 형태 및 역학을 연계하여 환경 지속성을 명확히 하고, 바이오필름 정보를 교란하거나 확산을 촉진하는 전략을 평가할 것입니다.