Name: 렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 렙토스피라 바이오필름의 정량적 분석 방법을 크리스탈 바이올렛 분석과 현미경 기술을 활용하여. 이 모듈식 워크플로우는 생물막 형성과 구조 연구에 필수적인 표준화된 프로토콜을 제공합니다.

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<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 & 마이크로; 무균 친수성 폴리카보네이트 막</td><td>IT4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>12mm 멸균 유리 커버슬립</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 (PFA)와 nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>BD 메디컬</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>24웰 마이크로플레이트</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>이비디</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 Hi-Q4 접시</td><td>이비디</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트</td><td>네스트</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>안티페이드 마운팅 매체 &nbsp;</td><td>바이오라드</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>카본 코터</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>에미 ACE600</td><td></td></tr><tr><td>CFDA/SE 추적기</td><td>바이오레전드</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>전도성 카본 접착제</td><td>전자현미경 과학</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛 (CV)</td><td>시그마</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>암시야 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>11888846</td><td>라이카 DM4000 B, 다크 필 콘덴서 장착 (cat n&deg; 11505142)</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>VWR 케미컬스</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>인비트로젠</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>수펠코</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>글루타알데히드 용액</td><td>시그마-올드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔</td><td>아크로스 오가닉스</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>멤머트</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>역방향 공초점 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템</td><td>라이카 DMI6000 TCS SP8 X</td><td>공초점 현미경 SP8</td></tr><tr><td>위상 대비 광학 장치가 장착된 역현미경</td><td>니콘</td><td>셀-S2</td><td>바이오스테이션 IM-Q</td></tr><tr><td>렙토스피라 중간 기저 EMJH&nbsp;</td><td>벡턴 디킨슨</td><td>BD&nbsp; 279410</td><td>렙토스피라용 EMJH 배지</td></tr><tr><td>오스뮴 테트로사이드 (OsO4)와 nbsp;</td><td>시그마</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>프로피디움 아이오다이드&nbsp;</td><td>바이오티움</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자현미경</td><td>제올</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>카코딜산 나트륨 버퍼 & nbsp;</td><td>열보 사이언티브 케미컬스</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계 Varioskan Lux</td><td>써모 사이언티픽</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수</td><td>바이오솔브(Biosolve)</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1 mL)</td><td>치라나</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 녹색 형광 핵산 염색 &nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

렙토스피라 바이오필름의 정량적, 구조적, 기능적 분석을 위한 모듈식 워크플로우

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

접종물이 올바르게 준비되면 배양은 3-5일 이내에 중간 로그 단계에 진입하며, OD405 값은 ~ 0.2-0.4 정도이며, 암시야 현미경 하에서 밝고 매우 운동성이 높은 장(세포의 90% 운동성)과 눈에 띄는 뭭≥ 없습니다. 최적이 아닌 준비는 느린 박테리아와 필드 전반의 이질적인 운동성으로 나타납니다; 이러한 배양은 종종 약한 바이오필름을 생성하므로 폐기되어야 합니다. 실제로는 시드 시작 직전에 운동성과 OD를 나란히 확인하는 것이 실패한 러닝을 최소화합니다. 접종 단계에서 이러한 품질 관리 게이트를 구축하는 것이 하위 응용 분야에서 성공을 예측하는 가장 좋은 방법입니다. 방법론은 L. interrogans serovar Manilae L495에 최적화되었으나, 동일한 절차가 Leptospira biflexa Patoc 균주에도 적용되어 종 간 적용 가능성을 입증하였다. L. biflexa 는 일반적으로 L. interrogans에 비해 덜 응집력 있고 얇은 바이오필름을 형성하지만, 적절한 매개변수 조정을 통해 특징적인 발달 순서와 구조적 특징은 여전히 감지됩니다. 따라서 두 종을 모두 포함하는 것은 병원성 및 부생성 렙토스피라 모두에 대한 작업 흐름의 적응성을 강조합니다.
30°C에서 가습 챔버에서 21일간 정적 배양(또는 Leptospira 종에 적합한 기간)을 마친 후, 바이오필름은 유리 커버슬립과 친수성 폴리카보네이트 멤브레인에서 육안으로 보입니다. 성공적인 성장은 2-3주 후 점형 또는 가지, 또는 망상형 발자국이 표면에 부착되는 특징적인 CV 패턴을 만듭니다(그림 2A).
일반적인 관찰에서 야생형 L. interrogans Manilae L495는 3주차까지 표면 커버 ~50%에 도달하는 반면, 저바이오필름 돌연변이체는 약 ~ 20% 정체, 고바이오필름 표현형은 약 ~ 70-80%에 가까워 스크리닝을 위한 실용적인 동적 범위를 설정합니다. 바이오필름 형성의 정도는 렙토스피라 종과 균주에 따라 달라질 수 있으며; 예를 들어, L. biflexa Patoc 균주는 눈에 띄는 바이오필름을 더 빠르게 형성하며, 이전 연구들은 접종 후 120시간경부터 성숙한 바이오필름으로 간주되었습니다35.
결정 바이올렛 염색은 바이오필름 생체량을 정량화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 잘 발달된 바이오필름에서는 염색이 덮개 또는 막 부위에 국한된 짙은 보라색을 나타내며, 이는 높은 수준의 부착 생체량을 나타냅니다(그림 2A). 염색 및 용해화 단계에서의 시각적 단서는 프로토콜 성공을 나타내는 유용한 지표도 제공합니다. 예를 들어, CV 분포의 불균일하거나 연한 염색은 씨앗 부족, 증발, 또는 초기 바이오필름이 떨어지는 강한 세척 때문일 수 있습니다.
570 nm에서의 흡광도 측정값은 남아 있는 염색의 양과 따라서 상대적인 바이오필름 밀도를 반영합니다(그림 2B). 대표적인 실험에서 최적의 조건에서 배양된 L. interrogans 배양은 복제체 간에 일관되고 재현 가능한 OD₅₇₀ 수치를 보여, 안정적인 바이오필름 형성을 반영합니다. 반면, 매체 교환 시 샘플이 과도하게 피펫팅될 경우 복제 간 큰 변동이 관찰되며, 이는 접착력이 좋지 않거나 부분적인 바이오필름 박리를 나타낸다. 이러한 변동성은 기술적 문제의 신호로 간주되어야 하며, 영향을 받은 샘플은 제외하거나 프로토콜을 신중히 검토해야 합니다. 특히 L. biflexa Patoc은 유사한 조건에서 유리 커버슬립과 다중카보네이트 막에 더 광범위한 바이오필름을 형성하며, 이는 더 높은 CV 흡수 값으로 나타나 이 프로토콜이 Leptospira 종 전반에 걸쳐 적응 가능하고 효과적임을 보여줍니다.
성공적인 SEM 준비는 3일째부터 세포외 기질 침착물을 드러낼 수 있으며, 성숙한 바이오필름에서는 눈에 띄게 편광된 구조가 나타납니다: 다공성 내부 구조를 고정하는 거친 채널링 기저면(종종 &gt; 5 μm 채널 포함)과 스피로헤이트가 밀집된 매트릭스에 얽힌 매끄러운 끝면(그림 2C, D, E, F). 고배율 필드는 종종 가지가 뻗은 세포외 섬유와 가끔씩 버섯 같은 돌출부를 포착합니다; 타임랩스에서 관찰되는 결합 역학에 해당하는 특징들(보충 영상 1). 최적이 아닌 준비에서는 접힌 매트릭스, 충전 상태, 불분명한 셀 윤곽이 관찰될 수 있는데, 이는 보통 불충분한 고정 후처리, 불충분한 전도성 코팅, 또는 건조 불량을 반영합니다. 기저-끝 극성과 광범위한 채널이 명확할 때, SEM 판독값은 두께와 다공성의 공초점 추정치와 매우 일치하여 준비와 영상 촬영 모두의 성공적인 수행을 확인한다.
효과적인 타임랩스 시리즈에서는 고립된 지점들이 24-72시간 이내에 나타나 점차 더 큰 집합체로 응집되어 표면을 가로질러 이동하다가 공간 제한으로 인해 움직임이 느려집니다(그림 3A, B, C). 정량적 세분화는 총 커버 면적이 단조적으로 증가하는 반면, 총합 수는 증가했다가 정점에 달했다가 ~12시간에서 216시간 사이에 충돌과 합병이 지배적으로 일어나면서 감소합니다. 이러한 운동학(면적 증가, 집합체 수는 감소)은 단순한 퇴적이 아니라 활발한 축적을 나타냅니다. 실패하거나 경계선에 있는 런은 초반 펀크타가 부족하거나, 평평한 면적과 시간 경비 곡선을 보이며, 불안정한 온도/습도로 인한 집중 분산이 발생합니다. 95% 습도의 안정된 30°C 환경을 유지하고 각 시점마다 자동 초점을 사용하면 돌연변이나 치료법을 비교할 수 있는 선명한 궤적을 복원할 수 있습니다.
성숙한 바이오필름에서 나온 대표적인 Z-스택은 두께가 50 μm를 넘는 폼 같은 다층 구조를 보이며, 대부분의 세포는 살아있는 염색(SYTO 9-양성)을 보이고, 성장 중 집단 재배열을 나타내는 중앙 빈틈도 가끔 존재한다(그림 3D). 기질 프로브는 기질 조성을 조사하는 데 사용될 수 있습니다: WGA는 다당류 에피토프를 강조하고, BOBO-3는 풍부한 세포외 DNA를 표지하며, 단백질 선택적 염색은 외부 세포 관련 신호를 거의 기여하지 않습니다(그림 3E). 최적이 아닌 결과로는 프로피듐 요오다이드가 지배하는 얇거나 불연속적인 스택, 강한 광표백, 또는 일관되지 않은 게인 설정이 있어, 각각이 정량적 비교 가능성을 저해합니다. 두께, 생체부피, 생사비를 함께 해석하면(조건상 레이저 출력, 검출기 이득, 핀홀 비율을 일정하게 유지함) 성숙 상태를 확인하고 SEM 초구조 및 CV 생체량과의 직접 비교를 지원합니다.
렙토스피라의 바이오필름 형성 과정은 일반적으로 뚜렷한 단계를 따르지만, 종이나 균주에 따라 정확한 시기와 값은 달라질 수 있습니다. L. interrogans 균주 Manilae L495를 기준으로 하면, 21일간의 예상 진행에는 박테리아가 대부분 플랑크톤성 상태로 유지되고 바이오필름이 최소화된 초기 단계(0-3일)가 포함됩니다(그림 4A). 이후 3일차부터 7일까지의 기하급수적 성장 단계가 이어지며, 이 기간 동안 플랑크톤 박테리아와 바이오필름 관련 박테리아가 약 9 x 10⁸ cells/mL에 도달하고, 바이오필름 집합체가 형성되고 확장됩니다. 7일째에서 12일째 사이에 플랑크톤 박테리아는 크게 감소하고, 바이오필름 관련 세포는 개체군의 약 80%를 차지하며 최고조에 달합니다. 마지막으로, 성숙 단계(12일째-21일)에는 플랑크톤 세포 수가 증가하지 않고 바이오필름 박테리아 수가 감소하지만, 바이오필름 크기와 복잡성은 계속 증가합니다. 이러한 변화의 연속을 관찰하는 것은 프로토콜이 렙토스피라 바이오필름의 역동적인 발달과 성숙을 효과적으로 포착하고 있음을 보여줍니다.
적절히 수행될 경우, 감염 프로토콜은 명확히 정의된 플랑크톤(5일) 또는 바이오필름(21일) 배양에서 추출한 200 μL EMJH에 ~2 x 10⁸ 렙토스피리얼을 포함한 접종체를 사용합니다. 이 두 배양 유형은 서로 다른 생리학적 상태를 나타내지만, 이 차이는 의도된 것으로, 실험은 대사 활동 감소와 구조적 분화가 특징인 렙토스피라 바이오필름이 감염을 시작할 수 있는 능력을 유지하는지 여부를 확인하는 것을 목표로 합니다. 이 대조는 플랑크톤과 바이오필름 간 유전자 발현의 주요 변화를 보여주는 전사체 연구들에 의해 뒷받침됩니다. 바이오필름 골재는 21G 바늘을 통과한 후에도 구조를 보존하고 주입 전에 확인된 대로 신중하게 수확됩니다(그림 4C, D). 복강 내 주사 후 골든 시리아 햄스터는 보통 3일에서 5일 이내에 렙토스피라증의 임상적 징후(예: 무기력, 털이 헝클어지기, 엎드림)를 보입니다. EMJH 배지를 단독으로 주사한 음성 대조군은 질병 징후를 보이지 않습니다. 임상 징후의 진행 및 심각도, 안락사까지의 시간은 접종 종류에 따라 달라지는데, 플랑크톤성 박테리아는 종종 더 일찍 급성 증상을 유발하는 반면, 바이오필름 유래 집합체는 지연되지만 지속적인 감염을 일으킬 수 있다(그림 4B). 하루 두 번 최대 21일간 모니터링하면 질병의 전체 경과를 포착할 수 있습니다.
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2. 결정 바이올렛 염색, 정량화 및 렙토스피라 바이오필름의 초구조적 영상. (A) 다양한 기판에서 성장한 바이오필름의 크리스탈 바이올렛(CV) 염색. CV 염색은 다양한 종과 기판의 바이오필름 구조와 초기 부착 패턴을 시각화할 수 있게 해줍니다. i. 폴리카보네이트 필터 위의 L. interrogans; ii. 폴리카보네이트 필터 위의 L. biflexa; iii. 유리 커버 슬립에 있는 L. interrogans; iv. 유리 덮개 슬립에 있는 L. biflexa. (B) L. interrogans와 L. biflexa에 대해 CV 흡수력(OD570 nm)으로 시간에 따라 정량적 바이오필름 형성 사례를 평가합니다. 이 운동학 판독은 초기 접착과 바이오매스 축적 역학을 모두 포착하며, 병원성 종과 부생성 종 간 바이오필름 성장의 차이를 강조합니다. 이 수치는27명에서 수정되었습니다. (C-E) L. interrogans 바이오필름의 주사 전자현미경(SEM): (c) 초기 미세 군락 형성과 초기 세포외 기질 침착을 보여주는 3일 된 바이오필름; (d) 14일 된 생물막으로 광범위한 매트릭스 구조와 3차원 조직을 가진 성숙한 구조를 보여줌; (e-f) 3주 된 바이오필름은 장기간 배양에 걸친 구조적 고정과 매트릭스 성숙을 보여줍니다. CV 염색, 정량적 외측 측정, SEM 이미징의 결합은 초기 부착부터 성숙한 초구조 조직에 이르기까지 바이오필름 발생에 대한 포괄적인 개요를 제공하여 종 및 배양 기간 간 직접 비교를 가능하게 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3. 렙토스피라 바이오필름 형성의 시각화. BioStation으로 획득한 위상 대비 이미지는 (A) 48시간, (B) 96시간, (C) 144시간의 바이오필름 형성을 보여줍니다. (D) 3D 시각화를 위한 직교 단면으로 전체 생체 부피를 표시하는 Leptospira 바이오필름의 CLSM 재구성. (E) 성숙한 바이오필름의 공초점 염색(DAPI, 녹색)과 WGA(빨간색)로 박테리아 세포와 세포외 기질 구성 요소를 강조합니다. 이 수치는37명에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4. 플랑크톤 및 바이오필름 분획의 시간 분해 정량 및 렙토스피라 바이오필름의 기능 평가. (A) 405nm 흡수로 측정된 바이오필름 형성의 동역학. 각 시점마다 전체 우물, 바이오필름 분획, 플랑크톤성 렙토스피어가 포함된 상청액에서 측정하여 부착 박테리아와 자유 유영 박테리아를 구분할 수 있었습니다. (B) 바이오필름 집합체, 플랑크톤성 렙토스피어, 또는 EMJH 대조군을 주입한 햄스터의 생존 곡선 예시. 바이오필름 주입된 동물은 병원성이 낮아 일부는 21일 생존하는 반면, 플랑크톤성 렙토스피르는 빠른 사망을 일으킵니다. (C-D) 바이오필름 무결성의 예비 검증: 주입 전(C) 주사 전에는 집합체가 보이고, 21G 주사기(D, 흰색 화살표)를 통과한 후에도 온전함을 유지하여 취급 중 바이오필름 구조가 보존됨을 확인한다. 이 수치는36명에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>

Here, we present an integrated suite of protocols for the cultivation, quantitative monitoring, structural and functional characterization of Leptospira ...

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