Name: 바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 학습하세요 산호 정자의 반자동 냉동 보존 워크플로우를 통해 생물다양성 보전 및 암초 복원을 위한 유전자 자원을 확보하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 산호 번식 관리에 필수적입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>멸종 위기에 처한 산호 종의 산호 정자 냉동 보존 최적화

<ol><li>Eakin, C. M., Sweatman, H. P. A., Brainard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2014-2017+global-scale+coral+bleaching+event%3A+Insights+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">The 2014-2017 global-scale coral bleaching event: Insights and impacts.</a> Coral Reefs. 38 (4), 539-545 (2019).</li>
<li>Anthony, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interventions+are+needed+to+save+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">New interventions are needed to save coral reefs.</a> Nature Ecology & Evolution. 1 (10), 1-3 (2017).</li>
<li>Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+resource+banking+for+wildlife+research%2C+management%2C+and+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Genome resource banking for wildlife research, management, and conservation.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 41 (4), 228-234 (2000).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+and+using+germplasm+and+dissociated+embryonic+cells+for+conserving+Caribbean+and+Pacific+coral%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preserving and using germplasm and dissociated embryonic cells for conserving Caribbean and Pacific coral.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33354(2012).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+frozen+repository+for+the+Great+Barrier+Reef+coral+created%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First frozen repository for the Great Barrier Reef coral created.</a> Cryobiology. 65 (2), 157-158 (2012).</li>
<li>Zuchowicz, N., Daly, J., Lager, C., Williamson, O., Hagedorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing+on+the+beach%3A+A+robust+coral+sperm+cryopreservation+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Freezing on the beach: A robust coral sperm cryopreservation design.</a> Cryobiology. 101, 135-139 (2021).</li>
<li>Hobbs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+coral+biobanking+science+in+Australia+-+transitioning+into+applied+reef+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Marine+Science%22%5BJournal%5D)">A decade of coral biobanking science in Australia - transitioning into applied reef restoration.</a> Frontiers in Marine Science. , 9(2022).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+can+assist+gene+flow+on+the+Great+Barrier+Reef%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation can assist gene flow on the Great Barrier Reef.</a> Coral Reefs. 41, 455-462 (2022).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assisted+gene+flow+using+cryopreserved+sperm+in+critically+endangered+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assisted gene flow using cryopreserved sperm in critically endangered coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (38), e2110559118(2021).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+coral+larvae+using+vitrification+and+laser+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of coral larvae using vitrification and laser warming.</a> Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).</li>
<li>Daly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+proof+of+concept+demonstration+of+nanowarming+in+coral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Sustainable+Systems%22%5BJournal%5D)">The first proof of concept demonstration of nanowarming in coral tissue.</a> Advanced Sustainable Systems. , (2023).</li>
<li>Powell-Palm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+revival+of+Hawaiian+stony+corals+via+isochoric+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and revival of Hawaiian stony corals via isochoric vitrification.</a> Nature Communications. 14, 4859(2023).</li>
<li>Reef Restoration and Adaptation Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gbrrestoration.org">https://gbrrestoration.org</a> (2023).</li>
<li>Florida Coral Rescue. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue">https://myfwc.com/research/habitat/coral/disease/rescue</a> (2023).</li>
<li>Harrison, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrison%2C+PL+%22Coral+reefs%3A+An+ecosystem+in+transition%22">Coral reefs: An ecosystem in transition</a>. , Chapter 6 59-85 (2011).</li>
<li>Hagedorn, M., Carter, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobiology%3A+Principles%2C+species+conservation+and+benefits+for+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cryobiology: Principles, species conservation and benefits for coral reefs.</a> Reproduction, Fertility and Development. 28 (8), 1049(2016).</li>
<li>Zuchowicz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+coral+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessing coral sperm motility.</a> Scientific Reports. 11, 61(2021).</li>
<li>Thomas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+cryovial+dispensing+system+for+cell+banking%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+%26+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated cryovial dispensing system for cell banking.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 37 (17), 22-23 (2017).</li>
<li>Coral cryopreservation training course. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course">https://nationalzoo.si.edu/center-for-species-survival/coral-cryopreservation-training-course</a> (2023).</li>
<li>Bailey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+sperm+counting+methods+using+limits+of+agreement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Validation of sperm counting methods using limits of agreement.</a> Journal of Andrology. 28 (3), 364-373 (2007).</li>
<li>Hu, E., Yang, H., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cryopreservation+of+spermatozoa+of+blue+catfish+%28Ictalurus+furcatus%29%3A+Establishment+of+an+approach+for+commercial-scale+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput cryopreservation of spermatozoa of blue catfish (Ictalurus furcatus): Establishment of an approach for commercial-scale processing.</a> Cryobiology. 62 (1), 74-82 (2011).</li>
<li>Pickett, B. W., Berndtson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+bovine+spermatozoa+by+freezing+in+straws%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Preservation of bovine spermatozoa by freezing in straws: A review.</a> Journal of Dairy Science. 57 (11), 1287-1308 (1974).</li>
<li>Westbrook, C. E., Daly, J., Bowen, B., Hagedorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+collector+urchin+embryo%2C+Tripneustes+gratilla%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the collector urchin embryo, Tripneustes gratilla.</a> Cryobiology. 15, 104865(2024).</li>
<li>Maria, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryotubes+for+the+cryopreservation+of+Tambaqui+fish+semen+%28Colossoma+macropomum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Use of cryotubes for the cryopreservation of Tambaqui fish semen (Colossoma macropomum).</a> Cryobiology. 70 (2), 109-114 (2015).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+%26+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreservation & Biobanking. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ovation ALI-Q 2 VS 피펫 컨트롤러 - 부분 표본 피펫</td><td>Vistalab</td><td>2100-1005</td><td>유체 취급 &ndash; 정자 부피 측정, 동결 보호 용액 추가, cryovials</td></tr><tr><td>5 mL 혈청 피펫 (벌크)</td>으로 샘플 분취<td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Nunc 170355</td><td>유체 처리 &ndash; 정자 부피 측정, 동결 보호 용액 추가, 냉동</td></tr> 시료로 분할 <tr><td>10 mL 혈청 피펫 (대량)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nunc&nbsp; 170356</td><td>유체 처리 &ndash; 정액 부피 측정, 동결 보호 용액 추가, 냉동 보호 용액으로 시료 분할</td></tr><tr><td>P2 0.2&ndash; 2 &마이크로; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>F144054M</td><td>농도 및 동기 평가를 위한 정자 활성화 용액 및 정자 샘플 처리</td></tr><tr><td>준비 P10 1&ndash; 10 & 마이크로; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td>농도 및 동기 평가를 위한 정자 활성화 용액 및 정자 샘플 처리</td></tr><tr><td>준비 P20 2&ndash; 20 & 마이크로; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>&nbsp; F144056M</td><td>농도 및 동기 평가를 위한 정자 활성화 용액 및 정자 샘플 취급 준비</td></tr><tr><td>P200 20&ndash; 200 &마이크로; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td>농도 및 동기 평가를 위한 정자 활성화 용액 및 정자 샘플 처리</td></tr><tr><td>준비 P1000 100&ndash; 1000 &마이크로; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td>농도 및 물질 평가를 위한 정자 활성화 용액 및 정자 시료 처리</td></tr><tr><td>준비 진공 펌프</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>용액 준비를 위한 여과된 해수 준비</td></tr><tr><td>재사용 가능한 병탑 여과 시스템</td><td>Thermo Scientific</td><td>DS0320-5045</td><td>용액 준비를</td></tr> <tr><td>위한 여과된 해수 준비0.22-&마이크로; M 필터 디스크, 혼합 셀룰로오스 에스테르&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>용액 준비를 위한 여과된 해수 준비</td></tr><tr><td>여과된 해수</td><td>N/A</td><td>&ndash;</td><td>정자 활성화 및 동결 보호 용액을 위한 기본 배지</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>정자 동결 보존을 위해 여과된 해수에서 최종 농도 10% v/v로 사용되는 동결 보호 화학 물질</td></tr><tr><td>카페인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750</td><td>정자 운동성을 활성화하는 데 사용</td></tr><tr><td>BSA 열 충격 분율</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>CASA 웰 슬라이드에 대한 정자 부착을 최소화하는 데 사용</td></tr><tr><td>15-mL 튜브 - 랙형</td><td>열 Scientific</td><td>339651</td><td>정자 활성화 용액</td></tr><tr><td>50-mL 튜브 랙</td><td>준비 Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>배우자 다발 및 여과된 정자 샘플 수집용</td></tr><tr><td>이송 피펫 Thermo</td><td>Scientific</td><td>Samco 202PK</td><td>물 표면에서 배우자 다발의 수집을 돕기 위해</td></tr><tr><td>100-&micro; m 필터 바스켓</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>정자 시료 분리 시 난자 제외</td></tr><tr><td>Eppendorf 랙</td><td>Interpath</td><td>511029</td><td>농도 및 동기성 평가를 위한 정자 희석 및 활성화</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5-mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>농도 및 동기성 평가를 위한 정자 희석 및 활성화</td></tr><tr><td>Glass coverslips 18x18 mm</td><td>브랜드</td><td>4700 45</td><td>위상 현미경을 사용한 정자 농도 및 운동성 평가</td></tr><tr><td>일반 유리 슬라이드, 사전 세척, 75x25mm</td><td>Corning</td><td>2947</td><td>위상 현미경을 사용한 정자 농도 및 운동성 평가</td></tr><tr><td>혈액구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>위상 현미경을 사용한 정자 농도 및 운동성 평가</td></tr><tr><td>CASA 슬라이드(Leja 20-&micro; m 4 chamber, SC-20-01-04-B)</td><td>IMV Technologies</td><td>025107</td><td>CASA(Computer Assisted Sperm Analysis)를 사용한 정자 농도 및 운동성 평가</td></tr><tr><td>Makler 정자 계수 챔버(CASA)</td><td>IVFStore</td><td>SM-373</td><td>CASA(Computer Assisted Sperm Analysis)를 사용한 정자 농도 및 운동성 평가</td></tr><tr><td>accu-bead&reg; 계수 구슬</td><td>Hamilton-Thorne</td><td>710111</td><td>CASA(Computer Assisted Sperm Analysis)</td></tr><tr><td>CASA 시스템 + 노트북</td><td>Hamilton Thorne</td><td>Ceros II</td>를 사용한 <td>정자 농도 및 운동성 평가 CASA(Computer Assisted Sperm Analysis)를 사용한 정자 농도 및 운동성 평가안전</td></tr> <tr><td>안경</td><td>일반</td><td>&ndash;</td><td>DMSO 및 액체 질소를 다룰 때 사용하기 위한 개인 보호 장비[pment</td></tr><tr>; 랩<td>코트</td><td>긴 소매, 전체 길이</td><td>&ndash;</td><td>DMSO 및 액체 질소를 다룰 때 사용하기 위한 개인 보호 장비</td></tr><tr><td>Cryogloves (쌍)</td><td>Tempshield</td><td>Mid-Arm</td><td>DMSO 및 액체 질소를 다룰 때 사용하기 위한 개인 보호 장비</td></tr><tr><td>중간 펜치</td><td>일반</td><td>&ndash;</td><td>극저온 랙에서 동결 보존된 시료를 제거하고 액체 질소에서 시료를 조작하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td>바코드 스캐너(2D 호환)</td><td>Zebra</td><td>DS2278</td><td>시료 관리를 위한 냉동 보관용 1D 및 2D 바코드 판독용</td></tr><tr><td>2.0mL 극저온 보관 바이알, 외부 스레드, 캡핑, 2D SafeCode(DataMatrix/ECC200), 선형 및 사람이 읽을 수 있는</td><td>Eppendorf</td><td>30079434</td><td>정자 시료 동결 보존을 위한 바코드 극저온</td></tr> 보관용 냉동 <tr><td>보관 랙</td><td>Simport</td><td>T315</td><td>크라이오비알을 담을 수 있는 랙, 한 손으로 캡을 제거하고 캡핑할 수 있는 잠금 베이스가 있는</td></tr><tr><td>동결 랙</td><td>맞춤형</td><td>&ndash;</td><td>산호 정자를 위해 맞춤 설계된 동결 보존 시스템으로, 3D 프린팅 및 쉽게 구할 수 있는 구성 요소를 활용합니다. 부품 목록 및 조립 지침은 Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)에서 확인할 수</td></tr> 있습니다.<tr><td></td><td></td><td></td><td>산호 정자를 위해 맞춤 설계된 동결 보존 시스템으로, 3D 프린팅 및 쉽게 구할 수 있는 구성 요소를 활용합니다. 부품 목록 및 조립 지침은 Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)에서 확인할 수 있습니다.</td></tr> 냉동 <tr><td>보온병 &ndash; 1.5 리터 18/8 스테인레스 스틸 이중 벽 진공 식품 용기</td><td>Isosteel</td><td>&nbsp; VA-9683&nbsp;</td><td>산호 정자를 위해 맞춤 설계된 동결 보존 시스템으로, 3D 프린팅 및 쉽게 구할 수 있는 구성 요소를 활용합니다. 부품 목록 및 조립 지침은 Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)</td></tr><tr><td>Lab timers</td><td>Generic</td><td>&ndash에서</td> 확인할 수 있습니다.<td>동결 보존 전 동결 보호제 평형 타이밍을 위해</td></tr><tr><td>질소 수조 9L</td><td>BelArt</td><td>M16807-9104</td><td>냉동 보존 중 시료 담금질 및 분류 및 취급 중 시료 보관용</td></tr><tr><td>열전대 데이터 로거 - 다중 채널</td><td>Omega</td><td>HH520</td><td>동결 속도 및 종점 확인을 위한 냉동 보존 중 온도 모니터링</td></tr><tr><td>열전대 프로브 &ndash; Type K</td><td>Omega</td><td>5SC-TT-K-30-36</td><td>동결 속도 및 종료 지점을 결정하기 위한 냉동 보존 중 온도 모니터링</td></tr> 크라이<tr><td>오 펜/컬러 영구 펜</td><td>Staedtler Lumocolor</td><td>318</td><td>샘플 관리를 돕기 위해 냉동 뚜껑 표시용 옵션</td></tr><tr><td>드라이 쉬퍼 - 충전</td><td>Taylor Wharton</td><td>CXR100 또는 CX500</td><td>현장/수집 사이트에서 생물 저장소로 냉동 보존 샘플을 전송하기 위해 보관</td></tr></tbody></table>

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

A Semi-Automated Workflow for the Cryopreservation of Coral Sperm to Support Biobanking and Aquaculture

이 프로토콜에 설명된 단계는 Hagedorn et al.4 이 설명한 산호 정자 동결 보존을 위한 원래 방법과 Zuchowicz et al.6의 후속 개선을 기반으로 하며, 동결 보존 및 바이오뱅킹을 위한 정자 처리의 효율성을 높이기 위한 주요 개선 사항을 제공합니다. 바코드가 부착된 극저온 피펫과 부분 표본 자동 피펫터를 사용하면 극저온 비페알을 인쇄하고 수작업으로 라벨링할 필요가 없어 정자 포장 절차가 간소화되고 많은 수의 샘플을 수동으로 피펫팅하는 부담을 줄일 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 개선으로 냉동 보존을 위한 시료 준비에 필요한 시간이 약 8-10분에서 5분 미만으로 단축된다는 것입니다. CASA의 사용과 함께 이러한 개선은 산호 정자의 효율적인 바이오뱅킹에 필요한 인력 수를 기존 방법의 4명에서 6명으로 줄였으며 현재 프로토콜을 사용하는 사람은 2명으로 줄었습니다. 또한 바코드된 극저온 디스크를 사용한다는 것은 각 튜브에 고유 식별자가 있음을 의미하므로 배치 인쇄 라벨을 사용하는 이전 방법보다 더 높은 해상도로 데이터베이스 내에서 각 튜브를 추적할 수 있습니다.
2022년 호주 그레이트 배리어 리프 산란 시즌 동안 두 번의 산란 이벤트에 대한 프로토콜의 현장 테스트는 두 명의 작업자(CASA의 경우 1명, 동결 보존의 경우 1명)가 5종의 57개 군체에서 389개의 샘플을 냉동 보존 및 바이오뱅킹했으며, 필요에 따라 한 명의 추가 인원이 다발 분해 및 정자 분리를 지원했습니다. 2022년 11월 호주 퀸즐랜드의 코노미(North Keppel Island)에서 열린 산란 행사에서 Acropora millepora 의 24개 군체에서 채취한 150개의 샘플이 두 명의 작업자에 의해 2시간 동안 냉동 보존되었습니다. 이렇게 많은 수의 산호 군락에서 채취한 이 대량의 시료를 효율적으로 처리하고 냉동 보존할 수 있었던 것은 주로 시료 전처리 시간의 효율성과 워크스테이션 간의 메타데이터 전송이 간소화되었기 때문에 가능했습니다.
2023년 12월 산란 중 워크플로우에 대한 추가 테스트를 통해 산호 정자의 경우 Makler 계수 챔버가 CASA 시스템과 함께 일반적으로 사용되는 상용 고정 커버슬립 일회용 챔버 슬라이드에 비해 더 정확한 운동성 및 농도 데이터를 제공하는 것으로 확인되었습니다. Makler 계수 챔버는 4 μL 샘플 부피와 산호 정자에 사용되는 표준 CASA 설정17 을 가진 알려진 농도의 상업적으로 이용 가능한 라텍스 마이크로비즈를 사용하여 CASA에 대해 검증되었습니다. 이러한 분석은 제조업체가 제공한 예상 농도 범위(46.0 ± 700만/mL) 내에 속하는 낮은 변동성(44.5 ± 700만/mL)으로 일관된 수치를 보여주었습니다(그림 2). Makler 계수 챔버와 고정 커버슬립 챔버 슬라이드를 사용하여 수집된 Acropora millepora 에 대한 CASA 데이터를 비교한 결과, 두 챔버 유형 간의 정자 농도 수에서 유의한 차이가 발견되었습니다(P = 0.002; 그림 2), 고정 커버슬립 챔버 슬라이드는 Makler 계수 챔버를 사용하여 측정된 농도의 절반 미만을 등록합니다. 이러한 경향은 두 개의 다른 산호 종의 정자 샘플에서도 관찰되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한 2023년 12월 동안의 테스트에서는 20% DMSO로 1:1 희석 또는 30% DMSO로 1:2 희석(정자: 극저온 희석)을 사용하여 냉동 보존된 샘플에서 총정자, 운동성 정자 또는 점진적 운동성 정자의 해동 후 농도에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다(그림 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig01.jpg"> 그림 1: 냉동 보존을 위한 산호 정자의 반자동 처리에 사용되는 워크플로우 및 현장에서 사용되는 모바일 장비의 예. (A) 산호 배우자 다발은 FSW 5mL 이상인 5mL 다발의 비율로 수집되고 난자와 정자를 분리하기 위해 분해됩니다(i). 콜로니 메타데이터는 자동 데이터시트(ii)에 입력되고 분리된 정자 샘플은 컴퓨터 보조 정자 분석(CASA)(iii)을 사용하여 평가됩니다. FSW(iv)에서 20% 또는 30% DMSO의 첨가를 계산하기 위해 정자 품질 매개변수가 자동 데이터시트에 추가되고, 희석된 샘플은 바코드가 부착된 극저온(v)에 분주됩니다. 극저온 분은 극저온 랙에 로드되고 자동 데이터시트(vi)로 스캔된 후 -20°C/min에서 -80°C(vii)의 속도로 냉각됩니다. 그런 다음 샘플을 액체 질소로 담금질하고 Taronga CryoDiversity Bank(viii)로 운송하기 위해 건조 선적업체로 이송됩니다. (B) 코노미 환경 교육 센터(Konomie Environmental Education Centre)의 교실에서 원격 현장 현장에 설치된 CASA(왼쪽) 및 냉동 보존 스테이션의 예. (C) 호주 해양 과학 연구소(Australian Institute of Marine Science)에서 여러 크라이오 랙을 운영하기 위해 설치된 실험실 기반 고용량 냉동 보존 스테이션의 예: National Sea Simulator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig02.jpg"> 그림 2: 산호 정자 농도 측정을 위한 두 가지 다른 챔버 슬라이드 옵션 비교. (A) Makler 계수 챔버와 상업적으로 이용 가능한 고정 커버슬립 챔버 슬라이드를 사용한 Acropora millepora (n = 3명)의 총 정자 농도 측정 비교. 열은 평균 ± SEM을 표시합니다. 별표는 유의한 차이(P = 0.002)를 나타냅니다. (B) 산호 정자에 대한 알려진 농도 및 표준 CASA 설정에서 상업적으로 이용 가능한 라텍스 마이크로비즈를 사용한 Makler 계수 챔버의 검증. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66233/66233fig03.jpg"> 그림 3: 동결 보존된 샘플에서 총정자, 운동성 정자 또는 점진적 운동성 정자의 해동 후 농도. 냉동 보존을 위한 최종 10% DMSO 농도를 달성하기 위해 FSW에서 20% 또는 30% DMSO를 사용하여 총, 운동성 및 점진적 운동성 정자 농도의 해동 후 비교. n = 3명의 개체에서 채취한 샘플을 각각 2개의 분취액으로 분할하였으며, 1개의 분취액은 20% DMSO를 1:1로 동결 보존하였고, 두 번째 분취액은 30% DMSO의 1:2 첨가(정자: 동결 희석)로 냉동 보존을 위해 FSW를 사용하여 &lt;2 × 109/mL로 희석하였다. 열에는 평균± SEM이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/66233fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 산호 바이오뱅킹 자동 데이터시트 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66233/Coral%20biobanking%20auto%20datasheets_TEMPLATE.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Coral reefs are facing a crisis as the frequency of bleaching events caused by ocean warming increases, resulting in the death of corals on reefs around ...

a-semi-automated-workflow-for-cryopreservation-coral-sperm-to-support

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.

병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

이 프로토콜은 산호 홀로비온트의 생리학적 특징을 조사하는 데 사용할 수 있는 미세 호흡 측정 시스템의 설정 및 실행에 대해 설명합니다.

새로운 미세 호흡 측정 도구를 사용한 산호 홀로비온트의 생리학적 특성 분석

여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.

가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학

학습하세요 산호 정자의 반자동 냉동 보존 워크플로우를 통해 생물다양성 보전 및 암초 복원을 위한 유전자 자원을 확보하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 산호 번식 관리에 필수적입니다.

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

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