Name: 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 학습하세요 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화 방법을 통해 해마 CA1 apical dendrite의 구조적 특성을 정확하게 분석하고 척추 아형을 자동으로 분류하는 기술을 익히세요.

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<meta charset="utf8"></head><body>Neurolucida 360을 사용한 수지상 척추 분석 프로토콜

<ol><li>Gray, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+synaptic+contacts+on+dendrite+spines+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex.</a> Nature. 183, 1592-1593 (1959).</li>
<li>Ramón Y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sobre+la+fibras+nerviosas+de+la+capa+molecular+del+cerebelo%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Trim+Histol+Norm%22%5BJournal%5D)">Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo.</a> Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).</li>
<li>Desmond, N. L., Levy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+numerical+density+of+synaptic+contacts+with+long-term+potentiation+in+the+hippocampal+dendate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus.</a> J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).</li>
<li>Engert, F., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+chances+associated+with+hippocampal+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity.</a> Nature. 399, 66-70 (1999).</li>
<li>Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+expansion+and+stabilization+associated+with+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation.</a> J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).</li>
<li>Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+structural+plasticity+on+local+dendritic+segments+of+hippocampal+ca1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons.</a> Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).</li>
<li>Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synapse+loss+induced+by+repetitive+ltd+in+developing+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 5 (4), e10390(2010).</li>
<li>Markus, E. J., Petit, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+synaptogenesis%2C+aging%2C+and+behavior+lifespan+development+in+the+motor-sensory+system+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat.</a> Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).</li>
<li>Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dendritic+and+spine+changes+in+corticocortically+projecting+neurons+in+macaque+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys.</a> Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).</li>
<li>Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+dendritic+spines+in+the+living+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain.</a> Front Neuroanat. 8, 28(2014).</li>
<li>Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+changes+associated+with+normal+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine changes associated with normal aging.</a> Neuroscience. 251, 21-32 (2013).</li>
<li>Glausier, J. R., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+pathology+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine pathology in schizophrenia.</a> Neuroscience. 251, 90-107 (2013).</li>
<li>Phillips, M., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+autism+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders.</a> Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).</li>
<li>Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+spine+pathology+in+alzheimer%27s+disease%3A+Problems+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities.</a> Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).</li>
<li>Villalba, R. M., Smith, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+remodeling+of+striatal+dendritic+spines+in+parkinson%27s+disease%3A+From+homeostasis+to+maladaptive+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity.</a> J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).</li>
<li>Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+dendritic+spines+in+cell+cultures+with+the+carbocyanine+dye+%26%2334%3Bdii%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye &#34;dii&#34.</a> Front Neuroanat. 8, 30(2014).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+gfp%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+neurons+with+golgi+techniques+in+degenerative+diseases+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain.</a> Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).</li>
<li>Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpineJ%3A+A+software+tool+for+quantitative+analysis+of+nanoscale+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology.</a> Methods. 174, 49-55 (2020).</li>
<li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon%2C+dendrites+and+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).</li>
<li>Pfeiffer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+2p-sted+imaging+reveals+high+turnover+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo.</a> Elife. 7, e34700(2018).</li>
<li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+development%2C+and+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>Hering, H., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines%3A+Structure%2C+dynamics%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).</li>
<li>Jontes, J. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia%2C+spines%2C+and+the+generation+of+synaptic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity.</a> Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).</li>
<li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+shape+analysis-classification+or+clusterization%3F+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective.</a> Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).</li>
<li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+dynamics%3A+Are+they+all+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spine dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+three-dimensional+detection+and+shape+classification+of+dendritic+spines+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images.</a> PLoS One. 3 (4), e1997(2008).</li>
<li>Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+4D+analysis+of+dendritic+spine+morphology%3A+Applications+to+stimulus-induced+spine+remodeling+and+pharmacological+rescue+in+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model.</a> Mol Brain. 4, 38(2011).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-D+morphometric+analysis+of+individual+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines.</a> Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).</li>
<li>Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinetool+is+an+open-source+software+for+analysis+of+morphology+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines.</a> Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).</li>
<li>Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+for+analysis+of+dendritic+spine+morphology+and+number+in+neurodevelopmental+disorder+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research.</a> ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).</li>
<li>Dickstein, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+dendritic+spine+quantification+from+confocal+data+with+Neurolucida+360%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360.</a> Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Parajuli, L. K., Koike, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+dendritic+spines+revealed+by+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques.</a> Front Neuroanat. 15, 627368(2021).</li>
<li>Ferreira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance-dependent+regulation+of+NMDAR+nanoscale+organization+along+hippocampal+neuron+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).</li>
<li>Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+ca1+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).</li>
<li>Katz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+distribution+suggests+a+two-stage+model+of+dendritic+integration+in+ca1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).</li>
<li>Bourne, J., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+thin+spines+learn+to+be+mushroom+spines+that+remember%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Do thin spines learn to be mushroom spines that remember.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).</li>
<li>Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+Function+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms.</a> Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Mattila, P. K., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia%3A+Molecular+architecture+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia: Molecular architecture and cellular functions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>518F 침수 오일</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>슬라이스 준비용</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>지혈 집게</td><td>FST</td><td>13020-12</td><td></td></tr><tr><td>대형 수술용 가위</td><td>FST</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-035</td><td></td></tr><tr><td>미니 연동 펌프 II</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td>관류용</td></tr><tr><td>Neurolucida 360</td><td>MBF Bioscience</td><td>v2022.1.1</td><td>척추 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MBF Bioscience</td><td>v2022.1.1</td><td>척추 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>크라이오스타트 절편용</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (37%)</td><td>Fisherbrand</td><td>F79-1</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>FST</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>소형 수술용 가위</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>스파튤라&nbsp;</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>FIsherbrand</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microslides</td><td>Diagger</td><td>ES4951 +</td><td></td></tr> <tr><td>Vectashield HardSet 장착 중간</td><td>벡터 실험실</td><td>H-1400-10</td><td></td></tr></tbody></table>

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software

이 분석 방법을 효과적으로 활용하는 것은 추적을 위한 수지상 세그먼트를 선택하는 것으로 시작됩니다. 그림 1에서 설명한 바와 같이, 추적을 위한 이상적인 수상돌기는 다른 수상돌기에 근접하지 않습니다. 병렬로 실행되는 수상돌기는 인접한 수상돌기에서 척추를 부적절하게 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 다른 z 평면에서 직접 교차하거나 수직으로 달리는 수상돌기는 정확한 수지상 추적에도 상당한 어려움을 더합니다. 수상돌기 두께의 차이에 유의하는 것도 중요합니다. 이전에 보고된 바와 같이, 다양한 두께의 수상돌기(dendrites)와 척추 밀도(spine dendides)에는 주요 차이점이 있다(36). 또한 분기점(37)으로부터의 거리가 증가된 동일한 수상돌기 내에서도 차이가 있을 수 있다. 이상적으로는 유사한 분지 점 기원을 가진 동일한 순서와 두께의 수상돌기를 추적하면 수지상 척추 밀도의 기존 이질성을 제어할 수 있습니다. 일부 제제에서 분기점을 식별하는 것은 불가능할 수 있지만 수상돌기의 두께는 수상돌기 추적에서 항상 제어 가능한 요소여야 합니다. 수지상 세그먼트의 정확한 추적은 이 분석에서 정확한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 추적된 수상돌기의 모든 지점이 실제로 수상돌기 내에 있는지 확인해야 합니다. 다른 방향에서 3차원 수상돌기를 보는 것이 이 과정에 도움이 될 수 있습니다. 그림 2A,B에서 볼 수 있듯이 하향식 보기는 적절하게 추적된 수상돌기로 보이는 것을 보여줍니다. 측면에서; 그러나 많은 점이 수상돌기 자체에 위치하지 않습니다. 이러한 문제는 그림 2C의 측면 보기에는 나타나지 않습니다. 또한 추적 중에 수상돌기가 제대로 채워졌는지 확인하는 것이 중요합니다. 수상돌기가 충분히 채워지면 수상돌기 조각이 가시로 부적절하게 식별될 수 있습니다. 과도하게 채워진 덴드라이트는 최소 높이 임계값으로 인해 실제 척추가 식별되지 않을 수 있습니다. 사용자 안내 추적에 대한 이러한 수동 평가는 정확한 수지상 척추 분석을 허용하는 데 매우 중요합니다.
수상돌기 가시를 식별하려면 사용자 안내 접근 방식도 필요합니다. "Detect All" 기능을 사용하여 균일한 검출기 감도 임계값을 설정하는 것은 여러 가지 이유로 부적절합니다. "모두 감지" 기능을 사용하면 가장 노골적으로 명백한 스파인을 식별하는 데 유용하지만 이러한 스파인의 채우기를 확인하려면 확인해야 합니다. 초기 "Detect All(모두 감지)"이 있는 식별된 스파인은 충분히 채워지지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 식별된 스파인을 개별적으로 삭제한 다음 더 높은 검출기 감도에서 수동으로 다시 식별해야 합니다(그림 3A-C). 이렇게 하면 척추가 적절하게 채워집니다. 스파인에 필요한 검출기 감도에는 상당한 이질성이 있으며, 이는 수동으로 고려해야 합니다. 검출기 감도를 높여 모든 검출을 감지하면 스파인이 과도하게 채워질 수 있으며, 이 경우 수동 수정도 필요합니다(그림 3D). 부적절한 검출기 감도의 또 다른 문제는 여러 척추를 둘러싸고 있는 하나의 채워진 수지상 척추인 역암 척추의 부적절한 생성입니다. 서로 근접한 두 개의 척추가 하나의 역암 척추로 부적절하게 병합될 수 있습니다(그림 4A, B). 스파인 감지 소프트웨어에는 "분할" 기능이 있어 과충전으로 인해 병합된 스파인을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. "Split" 기능을 사용하면 복합 스파인에서 개별 스파인을 쉽게 생성할 수 있습니다(그림 4C). 정확한 수상돌기 추적 및 수상돌기 척추 충전을 통해 척추 아형으로 정확하게 분류할 수 있습니다. 척추 분류는 채워진 가시로부터의 형태와 수상돌기로부터의 거리에 의존하므로 프로세스의 모든 단계가 형태학적 분류에서 중요한 역할을 합니다(그림 5).
수동 선택 및 임계값 설정이 필요하기 때문에 모든 분석에 대해 일관된 표준을 따르는 것이 중요합니다. 이는 여러 사용자가 데이터 분석에 기여하는 경우에 특히 적합합니다. 분석을 수행하는 모든 조사자가 동일한 표준을 따르도록 하기 위해 조사자는 동일한 추적된 수상돌기의 데이터를 비교해야 합니다. 이렇게 하면 각 연구자가 블라인드 방식으로 공유된 균일한 기준에 따라 척추를 식별하도록 함으로써 실험자 편향의 가능성을 줄일 수 있습니다. 또한 피로로 인해 한 명의 연구자가 며칠 사이 또는 같은 날에 편향될 가능성도 있습니다. 이는 데이터 분석 프로세스 전반에 걸쳐 모니터링되어야 합니다. 분석의 타당성을 더욱 보장하기 위해 초기 결과를 문헌에 발표된 결과와 비교하면 프로토콜이 효과적으로 준수되고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 비교는 준비 및 매개 변수가 공유되는 경우에만 효과적이라는 점에 유의해야 합니다. 염색, 형광 신호의 획득, 수상돌기의 순서와 두께, 또는 뇌 영역의 차이는 다른 결과에 기여할 수 있습니다 8,36. 발표된 결과가 누락된 경우, 여러 연구자를 통해 척추 식별을 검증하면 분석의 신뢰성과 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 이 원고에는 보충 분석 폴더가 포함되어 있습니다. 이 폴더에는 수지상 분절, 추적된 수상돌기, 식별 및 분류된 척추가 있는 추적된 수상돌기, 데이터 출력(보충 표 1, 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3 및 보충 파일 4)의 샘플 이미지 파일이 포함되어 있습니다. 새 사용자는 이 데이터 세트에 대해 학습하여 이 문서에 설명된 절차를 연습할 수 있습니다. 제공된 샘플 데이터 세트의 10% 이내의 사용자 생성 결과는 분석 표준을 재현하는 데 허용되는 것으로 간주됩니다. 완전히 채워진 척추의 주관적인 기준과 자동으로 감지된 척추에 대한 수동 검사의 필요성으로 인해 연구자 간 및 연구자 내 분산은 분석의 정상적인 부분입니다. 생성된 결과가 해당 임계값을 초과하는 경우; 그러나 서로 다른 스파인 볼륨의 인스턴스와 부적절하게 포함되거나 제외된 스파인의 인스턴스를 결정하기 위해 나란히 비교를 수행해야 합니다. 그런 다음 허용 가능한 임계값에 도달할 때까지 샘플 데이터 세트를 다시 분석할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66493/66493fig01.jpg"> 그림 1: 수상돌기 척추 분석을 위한 수상돌기 선택. (A) THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 가져온 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 파란색 타원형의 두꺼운 1차 수상돌기와 분홍색 타원형의 더 얇은 2차 및 3차 수상돌기를 가진 수상돌기 순서의 이질성에 주목하십시오. (B) 수상돌기 추적을 위한 이상적인 후보는 녹색 타원으로 표시됩니다. 두께와 제한된 교차점, 겹침 및 다른 수상돌기에 대한 근접성에 유의하십시오. 빨간색 타원은 높은 교차점, 겹침 및 다른 수상돌기에 대한 근접성으로 인해 수지상 추적을 위해 피해야 하는 수지상 세그먼트를 나타냅니다. 더 두꺼운 1차 수상돌기도 추적에 적합한 후보가 아닙니다. 눈금 막대 = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/66493fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66493/66493fig02.jpg"> 그림 2: 수상돌기 분절의 정확한 추적. (A) THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 채취한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이는 사용자 안내 방향성 커널 방법을 통해 추적됩니다. 스케일 바 = 10 μm. (B) 수상 돌기 추적 불량의 예. 수상돌기는 하향식 보기에서 제대로 추적된 것으로 보입니다. 측면도는 수상돌기가 수상돌기에서 벗어난 점으로 부적절하게 채워져 있음을 보여줍니다. (C) 적절한 수상돌기 추적의 예. 하향식 뷰는 B와 비슷하게 보이지만 측면 뷰는 크게 다릅니다. C의 수상돌기는 수상돌기에서 편차 없이 완전히 채워짐으로써 표시된 대로 적절하게 추적됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/66493fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66493/66493fig03.jpg"> 그림 3: 수동 선택을 사용하여 수상돌기 가시를 정확하게 채우기. (A) 수동 검출을 기다리는 척추의 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인에 있는 CA1 근위 수상돌기에서 촬영한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 0.5 μm. (B) 부족 충전된 수지상 척추의 예. 불완전한 충전으로 인해 여전히 상당한 형광 신호가 보입니다. (C) 적절하게 채워진 수지상 척추의 예. 충전재 외부 주변에서 거의 보이지 않는 신호의 "코로나"의 존재는 수지상 가시를 정확하게 채우기 위한 표준입니다. (D) 과도하게 채워진 수지상 척추의 예. 감지기 감도가 너무 높아 척추가 과도하게 채워집니다. 충전재는 형광의 경계를 넘어 거의 감지할 수 없는 코로나를 가지고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/66493fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66493/66493fig04.jpg"> 그림 4: 쪼개지는 역암 수지상 가시 . (A) 두 개의 가시가 근접한 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 가져온 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 0.15 μm. (B) 두 개의 독립적인 척추가 하나의 역암 수지상 척추로 부적절하게 채워진 예. (C) "분할" 기능을 사용한 후, 역암 척추는 적절하게 채워진 두 개의 뚜렷한 수지상 가시로 분할됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/66493fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66493/66493fig05.jpg"> 그림 5: 수지상 척추 식별 및 아형으로의 분류. (A) 수지상 척추 정량화 및 분류를 위해 분리된 추적된 수지상 세그먼트의 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 채취한 z-stack 공초점 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 5 μm. (B) 적절한 충전 및 분할을 보장하기 위해 모든 수지상 가시를 식별하고 검사한 추적된 수지상 분절. 소프트웨어는 이 단계에서 식별된 스핀에 색상을 임의로 할당합니다. (C) 소프트웨어에서 정의된 매개변수를 사용하여 식별된 모든 수지상 가시를 하위 유형으로 분류합니다. 파란색 = 버섯, 노란색 = 얇음, 녹색 = 뭉툭함. Filopodia는 이 조직의 나이로 인해 존재하지 않습니다. (D) 버섯, 얇고 뭉툭한 가시가 채워지지 않은 경우(위)와 채워진 경우(아래)의 대표 이미지. 스케일 바 = 0.3 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/66493fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 3D 환경 액세스. 소프트웨어 인터페이스에서 볼 수 있는 컨포칼 이미지의 Z 스택. 기본 뷰어의 추적 탭에서 3D 환경 탐색이 노란색으로 강조 표시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20Figure-1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 3D 환경에 대한 이미지 매개변수 및 방향 설정. 컨포칼 z-stack 이미지를 위한 3D 환경 뷰어. 노란색 화살표로 표시된 강조 표시된 이미지 표시 변경 탭의 매개변수는 이미지 표시 형식: 3D 볼륨 및 표면 표시 형식: 최대 투영으로 설정됩니다. Move Pivot Point 및 Reset Orientation 은 노란색 화살표로 식별됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20Figure-2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 덴드라이트 세그먼트 추적. (A) 수상돌기 추적을 위한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨. 트리 탭, 사용자 안내 및 방향성 커널을 모두 선택한 상태에서 추적은 왼쪽 클릭으로 초기 커널을 덴드라이트에 배치하는 것으로 시작됩니다. (B) 커서 이동 후 덴드라이트 아래로 방향성 커널의 번식. (C) 수상돌기 아래쪽을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 방향성 커널이 채워집니다. (D) 수상돌기를 채우지 않는 방향성 커널의 예. 대신, 고독한 커널이 세그먼트 아래쪽에 있습니다. (E) 고독한 커널을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 두 점 사이의 수상돌기가 채워집니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면 추적이 종료됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20Figure-3.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 추적된 수상돌기의 점 조정. (A) 추적된 덴드라이트 세그먼트 보류 포인트 조정. 덴드라이트 편집을 위해서는 "나무" 탭과 "편집" 탭을 선택해야 합니다. 둘 다 노란색으로 강조 표시됩니다. 덴드라이트는 왼쪽 클릭으로 편집할 수 있도록 선택되었습니다. (B) 노란색으로 강조 표시된 포인트 탭을 선택하면 덴드라이트 세그먼트에서 개별 포인트를 선택할 수 있습니다. 녹색 점의 두께는 1.2μm입니다. (C) 덴드라이트를 보다 정확하게 채우기 위해 점을 조정했습니다. 녹색 점의 새 두께 값은 0.6μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20Figure-4.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 샘플 이미지 분석 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 수상돌기 및 spines.dat을 사용한 샘플 이미지 추적 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: dendrites.dat을 사용한 샘플 추적 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementart%20File%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: 샘플 수상돌기 이미지 파일.czi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementart%20File%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: Sample dendrite image file.jpx <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66493/Supplementart%20File%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Synaptic connections allow for the exchange and processing of information between neurons. The post-synaptic site of excitatory synapses is often formed ...

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Research

연구

JoVE Journal

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출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

출처: Gouder, et. al. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 형질도입된 면역 표지 피라미드 뉴런에서 수지상 가시의 이미징 및 분석을 보여줍니다. 배경 소음이 감소하고 수상돌기가 직경과 길이를 추정하여 추적됩니다. 자동화된 척추 분할에는 수상돌기 및 척추 치수에 대한 매개변수 설정과 척추 분류가 포함됩니다. 3D 모델이 생성되고 분석을 위해 내보내집니다.

공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

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우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

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