구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 수지상 가시를 초고해상도로 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 1차 해마를 준비하여 수행되며, 두 번째 단계는 GFP 형질 주입 및 염색을 통해 수지상 가시를 시각화하는 것입니다. 다음으로, GFP 표지된 수지상 가시의 획득은 SIM 현미경을 사용하여 초고해상도로 수행됩니다.

마지막 단계는 후속 이미지 분석을 위해 원시 이미지 데이터를 3D로 재구성하는 것입니다. 궁극적으로, 초고해상도로 이미지화된 1차 해마 뉴런을 발현하는 GFP는 수지상 척추 형태학의 미묘한 변화를 보여주는 데 사용됩니다. 기존 컨포칼 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 수지상 척추 형태를 더 자세히 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 수지상 가시 모양의 분자 및 약리학적 의존적 변화와 같은 신경 과학에서 진행 중인 주요 질문을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구조화된 제거 현미경 검사는 샘플에 선 패턴을 투영하는 것을 기반으로 하며, 이를 통해 컴퓨터 프로그램에서 추출할 수 있는 추가 정보를 제공하고 매우 선명한 이미지를 제공하여 MI 미토콘드리아와 세포의 다른 작은 구조를 볼 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 SIM 이미지의 유효한 재구성을 달성하는 데 중요하며, 원시 데이터의 좋은 품질을 제공하는 단계를 수행하는 데 중요합니다.

중요한 준비 단계에는 멸균 층류 후드에서 작업하고 커버 슬립을 코팅하는 것이 포함됩니다. 작은 멸균 집게를 사용하여 개별 커버 슬립을 12웰 플레이트의 단일 웰에 넣습니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 폴리리신 용액을 추가하여 커버 슬립을 담그십시오.

웰을 세척한 후 1ml의 도금 매체를 추가하고 세포를 도금하기 전에 최대 24시간 동안 조직 배양 인큐베이터에 커버 슬립을 그대로 두십시오. 절차는 우리 그룹의 박사 과정 학생인 HU is SH에 의해 시연될 것입니다. 쥐 배아를 분리한 후 가는 집게를 사용하여 뇌에서 소뇌를 제거하고 버립니다.

해부 현미경으로 정중선을 따라 시상면을 절단하여 두 반구를 분리하고, 한 쌍의 작은 집게를 사용하여 중뇌를 부드럽게 잡고 중뇌를 제거합니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 피질과 해마를 포함하는 반구의 나머지 부분을 그대로 두십시오. 다음으로, 수막을 조심스럽게 제거하고 해마가 위를 향하도록 조직의 방향을 바꿉니다.

해마는 특징적인 CS 모양의 구조로 식별할 수 있습니다. 가는 집게를 사용하여 해마를 해부하고 신선한 차가운 X-H-B-S-S가 들어 있는 새로운 30mm 접시에 넣습니다. 모든 배아에서 하마 캄피를 제거한 후 하마 캄피의 총 수를 세고 작은 조각으로 자릅니다.

X-H-B-S-S 3밀리리터가 들어 있는 15ml 원심분리 튜브에 조각을 모읍니다. 원심분리하여 상층액을 제거한 후 해마당 6마이크로리터의 트립신을 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 해마 단편을 배양하고 세척한 후, 모든 조직 조각이 단세포로 균질하게 분산될 때까지 불로 연마된 파스토르 피펫으로 단편을 30회 천천히 테이팅합니다.

거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 섭씨 37도까지 사전 경고된 5밀리리터의 도금 매체를 추가합니다. trian 파란 생명 얼룩이 지는 씨, 50를 사용하여 세포를 세기 후에, 12의 우물 당 000의 세포, 2 milliliters의 총 양을 위한 도금 매체의 1 밀리리터에 있는 좋은 판

세포를 고르게 분포시키기 위해 플레이트를 흔든 후 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다. 2-3일 후, 0.5ml의 도금 배지를 10마이크로몰 FUDR을 함유한 배양 배지로 교체하십시오. transfection을 위해 뉴런은 지방 절제술을 추가합니다.

A DNA 믹스에 적가하여 실온에서 30분 동안 배양합니다. 층류 후드에서, 30분 DNA 지방절제술 혼합물이 끝나기 10분 전에, 배양, 원래 또는 제1 배양 플레이트로부터 제2 12로 컨디셔닝된 배지를 피펫팅한다. 이 플레이트를 섭씨 37도, 첫 번째 배양 플레이트에 5% 이산화탄소로 잘 플레이트하여 보관합니다.

세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 조절된 배지를 1ml의 예열 배양 배지로 신속하게 교체했습니다. 두 플레이트를 모두 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 30분 DNA 지방절제술 배양이 끝나면 DNA 지방절제술 혼합물을 세포에 추가할 준비가 됩니다.

DNA 지방 절제술 믹스 200마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 적가하고 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 45분 동안 배양합니다. 45분 배양 후 작은 집게를 사용하여 뉴런을 잡고 있는 커버 슬립을 들어 올립니다. 신선하고 따뜻한 신경 기저 배지가 들어있는 3cm 접시에 담가 헹구고 우물에 넣으십시오.

두 번째 12에서, 컨디셔닝된 매체를 포함하는 웰 플레이트. 그런 다음 형질주입된 뉴런을 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 배양합니다. 면역 염색을 준비하려면 덮개 슬립이 포함된 웰에서 배지를 부드럽게 흡입합니다.

그런 다음 수상돌기가 손상되지 않도록 500마이크로리터의 따뜻한 4%PFA를 조심스럽게 첨가합니다. 1%T-B-S-B-S-A 용액으로 세포 블록을 실온에서 30분 동안 배양 및 세척한 후 다시 세척한 후 배양에서 희석한 1차 항체를 첨가하고 혼합하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

다음날 아침, 1차 항체를 제거하고 여기에서 다시 세척하고 커버 슬립을 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로, 배양에서 희석된 2차 형광 접합 항체를 첨가합니다. 섞어서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 2차 항체를 제거하고 미세한 핀셋을 사용하여 세포를 세척합니다. 우물에서 덮개 슬립을 제거하고 여분의 TBS를 티슈로 말리십시오. 마지막으로 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 장착하고 매니큐어로 밀봉합니다.

SIM 이미징을 시작하려면 488나노미터 레이저, 수은 램프, 스테이지 컨트롤러, 피조 컨트롤러 및 할로겐 램프를 켭니다. NSIM 모드에서 및 또는 SIM 소프트웨어를 시작합니다. 대물렌즈에 이머젼 오일 한 방울을 떨어뜨린 후 오일 방울에 기포가 없는지 확인하십시오.

해마 뉴런이 있는 커버 슬립을 현미경 스테이지에 놓습니다. 오일이 샘플에 닿을 때까지 대물렌즈를 위쪽으로 움직입니다. 수집 절차 중에 스테이지 위에 덮개를 씌워 주변 조명으로부터 샘플을 보호하고 실내 조명을 최대한 어둡게 하는 것을 잊지 마십시오.

SIM 소프트웨어에서 광학 구성 IFI를 선택하고 백색광 설정으로 육안 검사를 위해 빈 필터 블록을 선택합니다.amp르 초점. 그런 다음 백색광을 끄고 수은 램프를 켭니다. 셔터를 열고 녹색 필터를 선택하여 충분히 밝은 수상돌이를 검색합니다.

충분히 밝은 관심 있는 수상돌기를 만나고 관심 세그먼트를 시야의 중앙에 배치하면 셔터를 닫습니다. 소프트웨어를 광학 구성 3D SIM 4 88로 설정하고 카메라 설정을 다음과 같이 설정합니다. 판독 모드를 em으로 설정합니다.

1메가헤르츠 16비트를 얻습니다. 노출 시간을 100밀리초로 설정합니다. 레이저 출력을 5%로 설정하고 EM 게인을 200으로 설정합니다.

초점 속도를 매우 미세하게 설정하여 관심 있는 물체에 초점을 맞춥니다. 다음과 같이 카메라 설정을 빠르게 조정합니다. 30, 040, 5, 000 사이의 강도 값을 얻으려면 레이저 출력을 0%에서 20%로 설정하고 노출 시간을 50밀리초에서 2초로 설정합니다.

판독 모드를 em으로 설정합니다. 1메가헤르츠 16비트를 얻습니다. EM 게인을 0에서 300으로 설정합니다.

변환 게인을 1 x에서 5.1 x로 설정합니다. live 형식을 no Benning으로 설정합니다. 캡처 형식을 Benning 없음으로 설정합니다.

그런 다음 ND 시퀀스 패널에서 3개의 DZ 스택 설정을 다음과 같이 구성하고 범위를 2미크론으로 설정합니다. 단계 크기를 120나노미터로 설정하고 홈 위치를 클릭합니다. 그런 다음 람다 섹션에서 광학 구성 3D SIM 4 88을 선택합니다.

획득 모드로 3D SIM을 선택한 후 ND 시퀀스 획득을 실행하고 컨포칼 및 시뮬레이션 현미경으로 이미지화된 원시 데이터를 저장합니다. 획득은 컨포칼 및 SIM 이미지로부터 재구성되었습니다. 수상돌기를 추적하고 척추를 넥 길이, 넥 직경 및 헤드 직경과 같은 주요 매개변수를 조정한 후 소프트웨어로 자동으로 분류했습니다.

박스형 영역은 컨포칼 및 시뮬레이션 현미경으로 이미지화되고 해당 Z 스택에서 재구성된 하나의 개별 수상돌기 척추를 보여주며, 결과 3D 재구성의 해상도와 정확도의 차이를 나타냅니다. SIM에 따르면, 머리와 목의 직경에 대한 더 높은 해상도의 정량적 분석을 통해 SIM 현미경이 동일한 수지상 가시에 대해 컨포칼 현미경보다 훨씬 더 작은 치수를 측정하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 SIM이 수지상 척추 형태에서 더 작은 변화를 감지할 수 있음을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 동일한 이미지의 보다 유효한 후속 재구성을 위해 고품질의 원시 이미지를 획득하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

구조화 조명 현미경 검사는 생체 세포 이미징에도 효과적일 수 있으며, 이를 통해 헬라 세포, 뉴런 또는 대장균 박테리아와 같은 세포의 역학을 조사할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 초고해상도에서 기본 해마 뉴런에서 표준 설명을 준비, 시각화 및 이미지화하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.