Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

Lu-Ping Zhang; Yong-Hong Nie; Tuo Tang; Ai-Xue Zheng; Xian Hong; Tao Wang

doi:10.3791/66501

GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

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Biology

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Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

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09:29 min

February 2, 2024

DOI: 10.3791/66501-v

Lu-Ping Zhang¹, Yong-Hong Nie¹, Tuo Tang¹, Ai-Xue Zheng¹, Xian Hong¹, Tao Wang¹

¹Laboratory of Protein Structure and Function, Institute of Medicine and Pharmacy,Qiqihar Medical University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study outlines protocols for extrachromosomal nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) assays to assess the efficiency of DNA double strand break repairs in HEK-293T cells. The assay techniques leverage the use of plasmids, enabling swift analysis of DNA repair mechanisms in a controlled environment.

Key Study Components

Research Area

DNA double strand break repair mechanisms
Cellular response to DNA damage
Genetic assays for repair efficiency

Background

NHEJ and HR are critical for repairing DNA lesions
Efficiency quantification assists in understanding DNA repair dynamics
Extrachromosomal assays allow faster analysis than integrated methods

Methods Used

Extrachromosomal NHEJ and HR assays
HEK-293T cells as the model system
Flow cytometry for quantifying repair efficiency

Main Results

The study demonstrates the successful application of non-integrated reporter assays
Efficiency of NHEJ and HR can be quantitatively compared
Impact of specific proteins on repair efficiency was noted

Conclusions

The protocols establish reliable methods to evaluate DNA repair efficiency
Findings provide insights into genetic mechanisms involved in DNA repair

Frequently Asked Questions

What are NHEJ and HR?

NHEJ (nonhomologous end joining) and HR (homologous recombination) are two primary mechanisms that cells use to repair double strand breaks in DNA.

Why use HEK-293T cells?

HEK-293T cells are widely used in research due to their high transfection efficiency and ability to grow rapidly in culture.

What is the advantage of extrachromosomal assays?

Extrachromosomal assays allow for quicker analysis of repair efficiency compared to chromosomally integrated approaches, making them suitable for comparative studies.

How are the efficiencies of NHEJ and HR quantified?

The efficiencies are quantified through flow cytometry, measuring the ratio of reporter gene expression (such as GFP) relative to control markers (e.g., mCherry).

What role does the WASH protein play in DNA repair?

The study suggests that the WASH protein is involved in modulating NHEJ efficiency, highlighting its significance in the DNA repair process.

Can these methods be applied to other cell types?

Yes, while this study focuses on HEK-293T cells, the protocols can be adapted for other cell lines to study DNA repair mechanisms.

What are fluorescence reporter genes used for?

Fluorescence reporter genes serve as indicators of successful DNA repair events, enabling quantification through fluorescence-based methods.

이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 NHEJ 및 HR의 효율성을 정량화하기 위한 염색체 외 비상동 말단 결합(NHEJ) 분석 및 상동 재조합(HR) 분석을 설명합니다.

DNA 이중 가닥 절단은 가장 위험한 DNA 병변을 나타냅니다. 이에 대응하여 세포는 DNA 이중 가닥 파손 복구를 위한 두 가지 주요 메커니즘인 NHEJ와 HR을 사용합니다. NHEJ와 HR의 효율성을 별도로 정량화하는 것은 관련 메커니즘 및 관련 요인을 탐색하는 데 중요합니다. NHEJ 분석 및 HR 분석은 NHEJ 및 HR의 효율성을 측정하는 데 사용되는 확립된 방법입니다. 이러한 방법은 DSB 유도를 위한 엔도뉴클레아제 I-SceI에 대한 인식 부위가 있는 파괴된 녹색 형광 단백질 유전자를 포함하는 세심하게 설계된 플라스미드에 의존합니다.

NHEJ 분석 및 HR 분석은 염색체 통합 또는 염색체 외 접근법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 염색체 통합 접근법을 사용하면 염색체 경합 내에서 DSB 복구를 분석할 수 있습니다. 그러나 염색체 통합 접근법은 장시간의 세포가 필요하며 여러 세포주를 포함하는 비교 연구에는 적합하지 않습니다.

이 프로토콜에서는 파괴된 GFP 및 I-SceI 플라스미드를 HEK-293T 세포로 transfection하고 후속 유세포 분석을 포함하는 염색체 외 NHEJ 및 HR 분석에 대해 설명합니다. 이러한 비통합 리포터 분석은 당사를 포함한 여러 실험실에서 NHEJ 효율성과 HR 효율성을 평가하기 위해 사용되었습니다. 염색체 통합 접근법과 달리, 이 염색체 외 접근법은 확립되고 안정적인 세포주를 활용하여 NHEJ 또는 HR 효율성의 신속한 분석을 가능하게 합니다.

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