Name: GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 HEK-293T 세포에서 비상동성 말단 접합(NHEJ)과 상동 재조합(HR) 효율을 GFP 기반 리포터 시스템으로 분석하는 방법을. 유전자 가위를 이용한 DNA 이중 가닥 절단 복구 메커니즘을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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이 연구는 중국 헤이룽장성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China, YQ2022C036)과 치치하얼 의과대학 대학원 혁신재단(Graduate Innovation Foundation, QYYCX2022-06)의 지원을 받았다. 그림 1은 MedPeer를 사용하여 생성되었습니다.

1. 플라스미드 분리
<ol><li>표준 형질전환 프로토콜20에 따라 플라스미드 EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI(I-SceI 발현 플라스미드) 및 PCI2-HA-mCherry(mCherry 발현 플라스미드)(재료 표 참조)를 사용하여 유능한 E. coli를 형질전환시킵니다. 참고: PCI2-HA-mCherry는 다른 mCherry 또는 DsRed 발현 플라스미드로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>형질전환된 대장균 을 100μg/mL 암피실린이 보충된 500mL의 액체 LB 배지에 넣고 37°C에서 밤새 흔들어 배양합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 endotoxin-free plasmid maxi isolation kit를 사용하여 plasmid를 분리합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>nanodrop 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 정량화합니다. 플라스미드 농도를 1 μg/μL로 조절합니다.</li>
</ol>2. 세포 준비 및 transfection
<ol><li>10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 HEK-293T 세포를 배양합니다. HEK-293T 세포 또는 확립된 HEK-293T 안정 세포가 양호한 성장 상태인지 확인하십시오. 참고: 동결된 세포는 transfection 전에 최소 두 번의 분열을 거쳐야 합니다.</li>
	<li>transfection 전날, HEK-293T 세포를 2 × 105 세포/웰의 6웰 플레이트에 파종하여 다음 날 약 60%의 밀도를 달성합니다.</li>
	<li>transfection 당일에는 약 60%를 목표로 세포 밀도를 확인합니다. NHEJ 분석의 경우, 제조업체의 지침에 따라 상용 transfection 시약을 사용하여 1 μg의 EJ5-GFP, 1 μg의 pCBASceI 및 1 μg의 PCI2-HA-mCherry 플라스미드가 있는 6-웰 플레이트의 실험용 샘플 세포를 transfection합니다( 재료 표 참조). HR assay를 위해 EJ5-GFP plasmid를 DR-GFP plasmid로 교체합니다.</li>
	<li>FACS calibration control의 경우, transfection되지 않은 세포의 웰을 negative control로 남겨 둡니다. (1) 1μg의 EJ5-GFP(NHEJ 분석용) 또는 1μg의 DR-GFP(HR 분석용)와 함께 GFP 단색 대조군으로 pCBASceI 1μg 또는 (2) mCherry 단색 대조군으로 PCI2-HA-mCherry 1μg을 사용하여 6웰 플레이트의 세포를 transfection합니다.</li>
</ol>3. 유세포 분석에 의한 GFP 양성 및 mCherry 양성 세포 분석
<ol><li>transfection 2일 후 형광 현미경을 사용하여 GFP 및 mCherry 단백질의 발현을 확인합니다.</li>
	<li>transfection 3일 후, 웰에서 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세척한 다음 각 웰에 500μL 트립신을 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양하여 플레이트에서 모든 세포를 분리합니다. 이 단계와 후속 단계를 통해 직사광선으로부터 세포를 보호하십시오.</li>
	<li>각 웰에 500 μL의 완전한 DMEM 배지를 추가하고 세포를 재현탁시켜 덩어리가 보이지 않도록 합니다.</li>
	<li>각 웰의 모든 세포를 1.5mL 원심분리 튜브에 옮긴 다음 실온에서 1000× g 에서 2분 동안 세포를 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 1.0mL PBS로 한 번 세척합니다.</li>
	<li>다시 피펫팅을 통해 상층액을 조심스럽게 제거하고, 500μL의 PBS에 세포를 재현탁하고, 세포를 FACS 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 참고: 최적의 결과를 얻으려면 세포 수확 직후 유세포 분석을 시작하십시오. 또는 세포를 몇 시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>untransfection된 세포(negative control), EJ5-GFP/DR-GFP 및 pCBASceI-transfection된 세포(GFP 단색 대조군) 및 mCherry-transfection된 세포(mCherry 단색 대조군)로 FACS를 보정합니다. GFP와 mCherry 사이의 형광 파급을 최소화하기 위해 전압 및 보상을 조정합니다.</li>
	<li>각 튜브에서 최소 10,000개의 온전한 세포를 획득하고 기록합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
참고: 다음 단계는 FlowJo 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 FACS 데이터를 분석합니다. 대체 분석 소프트웨어에서 유사한 절차를 실행할 수 있습니다.
<ol><li>모든 FACS 파일을 대시보드로 드래그합니다. 파일 중 하나를 더블 클릭하여 FSC/SSC 플롯을 표시합니다.</li>
	<li>폴리곤 게이트를 만들어 왼쪽 아래 모서리에 있는 파편을 제외하고 손상되지 않은 셀을 선택합니다. 이 하위 모집단의 이름을 "Intact Cells"로 지정하고 이 게이트를 "All Samples" 막대로 끌어옵니다. Next Sample 버튼을 사용하여 각 샘플을 스크롤하여 각 샘플에 적절한 게이팅을 확인합니다(그림 2A).</li>
	<li>negative control sample (untransfection된 cells)의 Intact Cells subpopulation을 두 번 클릭하여 새 플롯을 표시합니다. 축을 FL1-H (x축, GFP) 및 FL2-H(y축, mCherry)로 변경합니다.</li>
	<li>Quad Gating 도구를 선택하고 음의 세포 집단의 오른쪽 상단 극단을 클릭합니다(그림 2B). 4개의 직사각형 게이트를 "Intact Cells" 막대로 드래그합니다. 다음 샘플 버튼을 사용하여 GFP 단색 제어 또는 mCherry 단색 제어 샘플을 스크롤하여 GFP 양성 또는 mCherry 양성 대조 세포와 음성 대조 세포를 구별하기 위한 적절한 게이팅을 확인합니다(그림 2C, D). 필요한 경우 사분면 게이팅을 미세 조정하고 이 게이팅을 모든 "Intact Cells" 개체군에 적용합니다.</li>
	<li>Layout Editor를 클릭합니다. 대표 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Copy to Layout Editor를 선택합니다. 모든 대표 플롯을 선택한 다음 두 번 클릭하여 그래프 정의를 엽니다. 축 레이블, 주석 및 범례를 원하는 대로 조정합니다.</li>
	<li>실험 샘플에서 mCherry 양성 세포의 비율은 transfection 효율 제어 역할을 합니다. 동일한 플롯에서 GFP 양성 세포의 수와 mCherry 양성 세포의 수를 비교하여 상대적인 DNA 복구 효율을 계산합니다.</li>
</ol>

NHEJ 및 HR 효율성을 평가하기 위한 GFP 및 mCherry 리포터 세포의 FACS 분석

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

공개해야 할 이해 상충은 없습니다.

여기에 설명된 방법은 NHEJ 효율성 및 HR 효율성 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19를 평가하기 위해 여러 논문에서 사용되었습니다. 이 방법은 DNA DSB 복구의 기본 메커니즘을 설명하고 NHEJ 및 HR과 관련된 새로운 요인을 식별하는 데 적합합니다. 예를 들어, DNA 의존성 단백질 키나아제 촉매 소단위체(DNA-PKcs)9, 코일린 상호작용 핵 ATPase 단백질(hCINAP)10, WASH11, 레티노산 유도 유전자 I(RIG-I)12, X선 복구 교차 보완 단백질 4(XRCC4)12, HORMA 도메인 함유 단백질 1(HORMAD1)13, 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44(USP44)14의 기능, 및 NHEJ 또는 HR에서 lncRNA NIHCOLE(ligation efficiency에서 발암성 역할을 하는 간세포 암종에서 유도된 noncoding RNA)은 염색체 외 방법의 적용을 통해 공개되거나 검증되었습니다. 염색체 통합 접근법과 달리, 이 염색체 외 접근법은 확립된 안정적인 세포주를 활용하여 NHEJ 또는 HR 효율성의 신속한 분석을 가능하게 합니다.
이전에 당사와 다른 10,11,12에 의해 HEK-293T 세포에서 사용되었던 염색체 외 NHEJ 및 HR 분석은 U2OS 세포16,17, 배아 암종 세포17,19, HCT116 세포 9, SUM159 세포13, HCC1143 세포13, MDA-MB-436 세포13, SUNE1 셀(14), Huh7 셀(18) 및 JHH6 셀(18). 이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 수행된 NHEJ 및 HR 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. HEK-293 세포의 현저한 transfection 효율을 감안할 때, 1μg의 EJ5-GFP 또는 1μg DR-GFP와 1μg pCBASceI의 조합은 6웰 플레이트에서 배양된 HEK-293T 세포에 적합한 것으로 간주됩니다. 그러나 HEK-293T 9,16,17 이외의 세포주에서는 transfection 조건이 다를 수 있으므로 연구자는 성공적인 transfection을 위한 정확한 조건을 꼼꼼하게 결정해야 합니다.
transfection에 앞서 필요한 세포 밀도를 확보하는 것은 프로토콜의 중추적인 절차입니다. 세포 수가 불충분하거나 과도한 경우 transfection의 효능을 실질적으로 저해할 수 있습니다. 세포 수가 부족하면 transfection 후 독성이 악화되어 DSB 복구의 정확한 평가를 방해합니다. 또한, EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry 및 transfection 시약의 혼합물에서 편차가 결과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으므로 한 실험에서 plasmid와 transfection 시약의 동일한 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다.
NHEJ 및 HR 외에도 a-EJ(Alternate End Joining) 및 SSA(Single-Strand Annealing)가 DSB 수리를 위한 추가 메커니즘으로 확인되었습니다. 그러나 야생형 세포에서 NHEJ와 HR은 DSB 복구를 위한 주요 경로인 반면 a-EJ와 SSA는 이와 관련하여 미미한 기여만 합니다. EJ5-GFP 플라스미드를 활용한 NHEJ assay는 NHEJ 및 a-EJ 이벤트를 모두 검출하므로 NHEJ 및 a-EJ5를 모두 포함하는 total-NHEJ에 대한 분석법으로 간주될 수 있습니다. a-EJ의 개별 분석은 EJ5-GFP를 EJ2-GFP18로 교체하여 간단하게 달성할 수 있습니다. 중단된 GFP 리포터를 hprtSAGFP21로 교체하여 SSA의 수리 효율성을 분석하기 위해 유사한 분석을 수행할 수도 있습니다.

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 DNA 손상의 가장 해로운 형태로, 즉시 복구하지 않으면 게놈 불안정, 염색체 재배열, 세포 노화 및 세포 사멸을 유발할 수 있습니다1. 잘 정립된 두 가지 경로인 NHEJ(nonhomologous end joining)와 HR(homologous recombination)은 DNA DSB 2,3을 해결하는 데 효과적인 것으로 인정받고 있습니다. HR은 DSB 복구를 위한 오류 없는 메커니즘으로 간주되며, 손상된 DNA 분자의 원래 구성을 복원하기 위한 템플릿으로 자매 염색분체의 상동 서열을 활용합니다3. 반면에 NHEJ는 템플릿에 의존하지 않고 끊어진 DNA 말단을 결합하는 오류가 발생하기 쉬운 DSB 복구 경로입니다2.
NHEJ 분석 및 HR 분석은 원래 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center의 Jasin의 실험실에서 개발된 고전적인 방법으로, NHEJ 및 HR의 효율성을 각각 4,5,6,7로 정량화하는 데 사용됩니다. 이러한 분석은 NHEJ 및 HR 8,9,10,11,12,13,14와 관련된 관련 메커니즘 및 요인을 조사하는 데 중요한 역할을 합니다. 두 분석 모두 I-SceI 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 DSB의 수리를 모니터링하기 위해 EJ5-GFP 및 DR-GFP라는 두 개의 중단된 GFP 리포터의 구현에 의존합니다. EJ5-GFP 리포터는 NHEJ 분석에 사용되고, DR-GFP 리포터는 HR 분석에 활용됩니다. 각 리포터는 I-SceI-유도 DSB가 GFP 발현 카세트(4,5)를 복원하기 위한 특정 수리 경로에 의해서만 수리될 수 있도록 미묘하게 설계되어 있다.
NHEJ 분석 및 HR 분석은 염색체 통합 또는 염색체 외 접근법을 사용하여 수행할 수 있습니다15,16. 염색체 통합 접근법은 게놈에 파괴된 GFP 리포터의 통합을 필요로 하여 염색체 컨텍스트 6,15 내에서 DSB 복구를 분석할 수 있습니다. 그러나 이 접근법은 장기간의 세포 통과가 필요하고 임의의 염색체 통합으로 인해 여러 세포주를 포함하는 비교 연구에는 적합하지 않으며, 내재적 차이 외에도 추가적인 교란 요인을 도입합니다. 이 프로토콜에서는 파괴된 GFP 및 I-SceI 플라스미드를 HEK-293T 세포로 일시적으로 transfection한 후 유세포 분석을 포함하는 염색체 외 NHEJ 분석 및 HR 분석에 대해 설명합니다(실험 워크플로우는 그림 1 참조). 이러한 비통합 리포터 분석은 원래 DNA 가닥 교차 연결 복구(16)를 연구하기 위해 Jasin의 실험실에서 보고되었으며, 우리 실험실11을 포함한 여러 실험실(9,10,11,12,13,14,17,18,19)에서 NHEJ 효율성 및 HR 효율성을 평가하는 데 사용되었습니다 . 이러한 염색체 외 접근법은 확립된 여러 안정 세포주를 포함하는 비교 연구에서 DSB 복구 분석을 용이하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>6cm 접시&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>작업 농도 : 100 & g/mL</td></tr><tr><td>DH5&알파; Competent Cells</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; 키트</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>대체 엔도톡신-프리 플라스미드 추출 키트는</td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>FALCON</td><td>352054 사용할 수 있습니다.</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACS칼리버</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>대체 분석 소프트웨어 사용 가능</td></tr><tr><td>HEK-293T 세포</td><td>세포주 자원의 국가 인프라</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>대체 형질주입 리젠트를 사용할 수</td></tr> 있습니다. <tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>I-SceI 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td><td>DsRed를 함유하는 대체 플라스미드를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

gfp 기반 리포터 시스템을 사용한 hek-293t 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 상당한 유전 정보 손실과 세포 사멸을 유발할 수 있는 가장 위험한 DNA 병변을 나타냅니다. 이에 대응하여 세포는 DSB 복구를 위한 두 가지 주요 메커니즘, 즉 비상동성 말단 결합(NHEJ)과 상동 재조합(HR)을 사용합니다. NHEJ와 HR의 효율성을 별도로 정량화하는 것은 각각과 관련된 관련 메커니즘 및 요인을 탐색하는 데 중요합니다. NHEJ 분석 및 HR 분석은 각각의 복구 경로의 효율성을 측정하는 데 사용되는 확립된 방법입니다. 이러한 방법은 DSB를 유도하는 엔도뉴클레아제 I-SceI에 대한 인식 부위가 있는 파괴된 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 포함하는 세심하게 설계된 플라스미드에 의존합니다. 여기에서는 HEK-293T 세포를 EJ5-GFP/DR-GFP 플라스미드, I-SceI 발현 플라스미드 및 mCherry 발현 플라스미드와 함께 co-transfection하는 염색체 외 NHEJ 분석 및 HR 분석에 대해 설명합니다. NHEJ 및 HR 효율성의 정량적 결과는 유세포 분석으로 계산한 바와 같이 GFP 양성 세포와 mCherry 양성 세포의 비율을 계산하여 얻습니다. 염색체 통합 분석과 달리, 이러한 염색체 외 분석은 확립된 여러 안정적인 세포주와 관련된 비교 조사를 수행하는 데 더 적합합니다.

NHEJ 및 HR 분석의 정확성을 보장하기 위해서는 적절한 보상 조정 및 게이팅 전략의 구현이 필요합니다. 일반적으로 mCherry 형광은 530nm 필터를 사용할 때 GFP 검출기에서 나타나지 않습니다. 그러나 매우 높은 GFP 발현을 나타내는 세포의 경우 575nm 필터를 사용할 때 GFP 형광이 mCherry 검출기를 오염시킬 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 negative control, GFP single-color control 및 mCherry single-color control 샘플을 사용하여 보정하고 gating 전략을 조절했습니다. 제어 셀의 일반적인 FACS 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 보상 조정 및 게이팅 전략은 대부분의 GFP 양성 세포를 오른쪽 하단 사분면(그림 2C)에 배치하고 대다수의 mCherry 양성 세포를 왼쪽 상단 사분면(그림 2D)에 배치해야 합니다.
최종 대표 플롯은 그림 3A,B에 나와 있습니다. I-SCEI에 의한 DSB 유도 후, 성공적인 복구 이벤트는 GFP 유전자를 재구성합니다. 따라서 GFP 양성 세포의 비율은 DNA DSB 복구 및 transfection 효율의 효율성에 해당합니다. mCherry 양성 세포의 비율은 transfection 효율에만 해당합니다. DNA DSB 복구의 상대적 효율성은 GFP 양성 세포와 mCherry 양성 세포의 비율로 계산할 수 있습니다(그림 3C).
DNA 복구에서 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 상동체(WASH)의 역할을 특성화하기 위한 NHEJ 분석의 구체적인 예가 그림 4에 나와 있습니다. 이 예에서는 NHEJ 분석을 수행하여 shControl 세포 및 shWASH 세포의 NHEJ 효율성을 평가했습니다(그림 4). 분명히, WASH의 손실은 NHEJ 효율성의 감소를 초래했으며, NHEJ 분석에 의해 결정된 NHEJ 효율성을 촉진하는 WASH의 역할을 확인시켜 주었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> 그림 1: NHEJ/HR 분석을 위한 워크플로우 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> 그림 2: 유세포 분석을 위한 게이팅 전략. (A) 온전한 세포에 대한 FSC-H/SSC-H 게이팅. (B) 형질주입되지 않은 HEK-293T 세포는 자가형광 세포를 배제하기 위한 음성 대조군으로 사용하였다. (C) EJ5-GFP 및 pCBASceI 플라스미드로 transfection된 HEK-293T 세포는 GFP 양성 세포에 대한 게이팅을 설정하는 데 사용되었습니다. (D) mCherry 플라스미드로 transfection된 HEK-293T 세포는 mCherry 양성 세포에 대한 gating을 설정하는 데 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> 그림 3: 일반적인 결과. (A) NHEJ의 분석을 보여주는 대표 그림. (B) 인사 분석을 보여주는 대표 플롯. (C) 계산 방법의 모델 다이어그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> 그림 4: WASH는 NHEJ 효율성을 촉진합니다. (A) shControl 세포 및 shWASH 세포의 NHEJ 효율 분석을 보여주는 대표 플롯. (B) shControl 셀과 shWASH 셀 간의 NHEJ 효율을 비교한 대표적인 통계 결과. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 NHEJ 및 HR의 효율성을 정량화하기 위한 염색체 외 비상동 말단 결합(NHEJ) 분석 및 상동 재조합(HR) 분석을 설명합니다.

GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

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DNA 이중 가닥 절단은 가장 위험한 DNA 병변을 나타냅니다. 이에 대응하여 세포는 DNA 이중 가닥 파손 복구를 위한 두 가지 주요 메커니즘인 NHEJ와 HR을 사용합니다. NHEJ와 HR의 효율성을 별도로 정량화하는 것은 관련 메커니즘 및 관련 요인을 탐색하는 데 중요합니다. NHEJ 분석 및 HR 분석은 NHEJ 및 HR의 효율성을 측정하는 데 사용되는 확립된 방법입니다. 이러한 방법은 DSB 유도를 위한 엔도뉴클레아제 I-SceI에 대한 인식 부위가 있는 파괴된 녹색 형광 단백질 유전자를 포함하는 세심하게 설계된 플라스미드에 의존합니다.NHEJ 분석 및 HR 분석은 염색체 통합 또는 염색체 외 접근법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 염색체 통합 접근법을 사용하면 염색체 경합 내에서 DSB 복구를 분석할 수 있습니다. 그러나 염색체 통합 접근법은 장시간의 세포가 필요하며 여러 세포주를 포함하는 비교 연구에는 적합하지 않습니다.이 프로토콜에서는 파괴된 GFP 및 I-SceI 플라스미드를 HEK-293T 세포로 transfection하고 후속 유세포 분석을 포함하는 염색체 외 NHEJ 및 HR 분석에 대해 설명합니다. 이러한 비통합 리포터 분석은 당사를 포함한 여러 실험실에서 NHEJ 효율성과 HR 효율성을 평가하기 위해 사용되었습니다. 염색체 통합 접근법과 달리, 이 염색체 외 접근법은 확립되고 안정적인 세포주를 활용하여 NHEJ 또는 HR 효율성의 신속한 분석을 가능하게 합니다.

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연구

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