효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡 정량화

미토콘드리아 호흡은 대부분의 상황에서 세포 에너지의 주요 생성기이며 세포 대사 및 적합성의 중요한 지표입니다. 따라서 미토콘드리아 기능은 생체 에너지 세포 상태를 나타냅니다. 이 프로토콜은 G 살아있는 세포의 미토콘드리아 호흡을 생체 에너지 매개변수로 정량화하는 기술을 설명합니다.

이 프로토콜에 설명된 기술은 레스베라트롤 및 코아르시텐과 같은 일부 폴리페놀의 생체 에너지 메커니즘을 정의하는 데 도움이 됩니다. 또한 PTSPT의 오탄당 대사를 측정하는 도구 역할을 하며 택시 나무 뒤의 생체 에너지 변화와 지반 작업 효과를 설명했습니다. 우리는 세포가 세포 생물 에너지학의 중요한 변화와 함께 택시 트리 및 지반 작업 효과와 같은 일부 표현형을 획득하는 방법을 해독하는 데 관심이 있습니다.

미토콘드리아 호흡은 이 대사 현상 뒤에 있는 분자 메커니즘을 밝히는 데 필수적인 도구입니다. 먼저 3밀리리터의 YPD 배지가 들어 있는 10밀리리터 유리 시험관에 250마이크로리터의 글리세롤 보존 효모 세포를 접종합니다. 분당 200회 회전하면서 섭씨 30도에서 밤새 시험관을 배양합니다.

그런 다음 멸균 루프를 사용하여 10ml 유리 시험관에서 자란 효모 세포와 함께 YPD 오거 플레이트를 줄무늬를 만듭니다. 고립된 군체가 나타날 때까지 섭씨 30도에서 페트리 접시를 배양합니다. 접종 전 준비를 위해 2% 포도당이 함유된 YPD 배지 3밀리리터에 2개 또는 3개의 분리된 효모 콜로니를 접종하고 배양합니다.

그런 다음 500ml 삼각 플라스크에 100ml의 멸균 합성 완전 배지를 얻습니다. 600나노미터에서 0.1의 초기 광학 밀도로 하룻밤 동안 접종 전 효모 배양을 배지에 접종합니다. 미토콘드리아 호흡을 테스트하기 위해 100마이크로몰 레스베라트롤과 같은 화학적 챌린지를 추가합니다.

다음으로, 중간 대나무 단계 세포를 비어있는, 미리 무게를 잰 15 밀리리터 원뿔 관으로 따르고, 4, 000 G에 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 상등액을 버린 후 25ml의 탈이온수로 펠릿을 세 번 씻습니다. 세척된 펠릿이 들어 있는 원뿔형 튜브의 무게를 측정하여 빈 튜브의 무게를 빼서 젖은 무게를 얻습니다.

그런 다음 세척 된 펠릿을 2 밀리리터의 탈 이온수에 다시 현탁시킵니다. 먼저 레스베라트롤과 같은 적절한 약물로 처리된 효모 세포를 확보하십시오. 5ml의 10mmolar MES-TEA 완충액과 50mg의 습식 세포를 극성 이식 챔버에 넣습니다.

Clark 유형 산소 전극을 부드럽게 배치하여 기포가 형성되지 않도록 합니다. YSI 5300A 모니터와 데이터 수집 컴퓨터를 켭니다. 채널 1 설정 다이얼을 방송으로 선택하고 채널 1 보정 다이얼을 사용하여 채널 1을 100%로 조정합니다.

데이터 기록을 시작하고 크로노미터를 사용하여 시간 측정을 시작합니다. 크로마토그래피 주사기를 사용하여 산화가능한 기질을 최종 농도인 10밀리몰까지 첨가하고 일정한 교반으로 챔버를 닫은 상태로 유지합니다. 그런 다음 크로마토그래피 주사기를 사용하여 올리고 마이신을 첨가하여 산소 농도계 챔버에서 0.01밀리몰의 최종 농도를 얻고 공기 소비량을 기록합니다.

마찬가지로, 산소 농도계 챔버에서 최종 농도인 0.015밀리몰에 CCCP를 추가하여 최대 호흡 용량을 결정합니다. 다음으로, 전자 수송 사슬 억제제인 치아 및 오일 트리플루로시톤(TTFA)을 1밀리몰에 첨가한 다음 항마이신 A를 1밀리리터당 1밀리그램에 첨가합니다. 다음 탄소원으로 진행하기 전에 70% 에탄올로 챔버를 각각 세 번 세척한 다음 탈이온수를 사용합니다.

먼저 다양한 탄소원과 대조군을 사용하여 효모 세포에 대한 산소 소비량 분석을 수행합니다. 통계 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만들고 만들기 섹션에서 XY를 선택합니다. 그런 다음, Enter 키를 선택하거나 데이터 테이블 섹션의 새 테이블로 데이터를 가져옵니다.

옵션 섹션에서 X 하위 섹션과 Y 하위 섹션에서 숫자를 선택합니다. Enter three replicate values in side-by-side sub columns(나란히 있는 하위 열에 세 개의 복제 값 입력)를 클릭합니다. X 열에 시간 데이터를 입력하고 Y 열에 공기 백분율 데이터를 입력합니다.

선형 회귀 분석을 수행하려면 메뉴 표시줄에서 분석을 클릭하고 분석에서 XY 분석에 대한 단순 선형 회귀를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 데이터 테이블의 결과 섹션에서 기울기 값을 가져옵니다. 계산된 경사 값을 데이터 시트에 복사합니다.

호흡기 억제제 혼합물에서 얻은 기울기 값을 빼고 산화성 기질, 올리고마이신 및 CCCP의 혼합물에서 혼합하여 다른 산소 소비원을 버립니다. 이제 기울기 값에 237마이크로몰의 산소를 곱하면 해당 조건에서 산소의 용해도를 나타내고 완충액을 나타냅니다. 값을 분당 산소의 마이크로몰로 변환하여 플롯당 시간이 어떻게 되는지에 따라 조정합니다.

결과를 실험에 사용된 세포의 밀리그램을 나타내는 50으로 나눕니다. 마지막으로, 산소 소비량은 분당 세포 1mg당 산소의 마이크로몰로 표시됩니다. 0.5%의 포도당에서 성장한 세포는 5%의 포도당에서 성장한 세포에 비해 기저 호흡, ATP 연계 호흡 및 최대 호흡 능력에서 훨씬 더 높은 산소 소비량을 보였습니다.

케르세틴은 포도당 0.5%로 성장한 세포에서 미토콘드리아 호흡을 현저히 감소시켜 기저호흡, ATP 연계 호흡 및 최대 호흡에 영향을 미쳤습니다. 반면에, 케르세틴은 5%포도당에서 성장한 세포의 미토콘드리아 호흡에 유의한 영향을 미치지 않았습니다.