Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

우리는 위장관 내 숙주 미생물 상호작용의 당생물학을 연구하며, 위장관을 덮는 점액층, 특히 뮤신과 그 당류가 건강과 질병에 미치는 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 뮤신 글리칸은 박테리아에게 영양분과 결합 부위를 제공하기 때문에 숙주-미생물 상호작용에서 점점 중요한 요소로 인식되고 있습니다. 당화 프로필의 변화는 미생물 조성에 교란을 초래할 수 있으며, 그 반대도 마찬가지로, 이는 질병 상태에서 흔히 관찰되는 표현형입니다.

하지만 뮤신은 당당화가 매우 강해 연구가 매우 어렵습니다. 샘플링 기법과 후속 생물정보학 분석의 혁신과 새로운 샘플 처리 방식이 이 분야를 발전시킬 수 있으며, 이는 샘플 수집 결과를 얻는 처리 처리량을 높이고 시간을 단축할 수 있습니다. 다른 분석 기법들은 글리칸의 더 상세한 구조적 특성 분석을 가능하게 하지만, 오랜 시간과 분석 시간이 필요합니다.

여기서 설명하는 MALDI-TOF 질량분석법을 사용하는 기술은 속도가 뛰어나며, 이는 고처리량이며 스크리닝 및 프로파일링에 적합합니다. 우선, 정제된 뮤신과 250마이크로리터의 베타 제거 완충제를 4밀리리터 유리 바이알에 섞습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 안감 캡으로 바이알을 단단히 밀봉하고 45도 섭씨에서 16시간 동안 배양합니다.

얼음 위에 5% 아세트산 용액 1밀리리터를 반응 혼합물에 떨어뜨리듯 넣습니다. 샘플 탈염을 위해 유리 피펫에 소량의 유리울을 꽂으세요. 위에서 유리 피펫에 1.5밀리리터의 수지 현탁액을 추가한 후 가라앉히고 배수합니다.

이제 5% 아세트산 2밀리리터로 수지를 세척하고 흐름 부분을 버리세요. 그 후 점액 샘플을 탈염 컬럼에 추가하고 5밀리리터 튜브에 플로우스루를 모으세요. 5% 아세트산 1밀리리터로 컬럼을 두 번 세척하여 흐름을 모으세요.

그 후 원심 증발기를 사용해 아세트산을 제거하고 샘플을 5밀리바, 섭씨 30도에서 2시간 농축합니다. 샘플을 0.5밀리리터의 메탄올산 아세트산에 녹인 후 질소 흐름 아래에서 건조합니다. 유리 주사기를 사용해 수산화나트륨과 메탄올 혼합물이 담긴 바이알에 DMSO 4밀리리터를 추가하세요.

소용돌이 후 용액을 2,000G에서 2분간 원심분리합니다. 젤을 흐트러뜨리지 않고 조심스럽게 상정액을 디캔트하고 염분을 제거하세요. 더 이상 염이 형성되지 않게 된 후, 젤을 무수 DMSO 4밀리리터에 재현탁하여 과산화 베이스 현탁액을 준비합니다.

다음으로, 건조된 뮤신 샘플에 무수 DMSO와 과산화염기를 바로 추가한 뒤 아이오도메탄을 바로 첨가합니다. 과밀화 반응을 실온에서 30분간 격하게 흔들며 배양합니다. 그 후 0.5밀리리터의 물을 추가하여 반응을 종료합니다.

샘플이 흐려지면 질소로 세척해 투명해집니다. 샘플을 친수성 지질 친화 균형 96웰 추출판에 적재합니다. 양압을 가해 샘플을 분당 약 1밀리리터의 유량으로 고체 상태를 통과시킵니다.

플로우스루를 버린 후, 우물을 1밀리리터의 물로 두 번 세척하세요. 1밀리리터의 메탄올로 배지에서 글리칸을 두 번 희석합니다. 메탄올이 플레이트에서 빠져나올 때까지만 압력을 가하고, 그 후에는 중력 흐름에 의존해 필요한 속도를 유지하세요.

원심 증발기를 사용해 샘플을 건조한 후 TA50 10마이크로리터에 녹입니다. 샘플 1마이크로리터와 매트릭스를 혼합한 후 강철 MALDI 타겟 플레이트에 올려 건조시킵니다. 데이터 분석을 위해 GlycoWorkbench에서 내보낸 질량 스펙트럼의 ASCII 파일을 불러오세요.

기준선 보정을 수행한 후 피크 중심체를 계산한 후 팝업 창에서 적절한 질량 범위, 최소 신호 대 잡음비, 최소 질량 분석법 피크 강도를 선택합니다. 그 후 Glyco-Peakfinder 도구를 사용해 피크 리스트에 맞는 구조 조성을 식별합니다. perMe를 유도로, redEnd를 환원 끝으로 선택하며, 기대 잔기의 최소 및 최대 수를 설정합니다.

뮤신은 헥소스, N-아세틸-헥소사민, 디옥시-헥소스, N-아세틸뉴라민산을 선택하세요. 황산염 글리칸의 경우, 질량 87.9의 Other 잔기 옵션을 사용하세요. MALDI-TOF 데이터의 경우, 최대 나트륨 이온과 전하 수를 각각 1개로 설정하고, 정확도를 0.5 달턴으로 설정하세요.

Control 키로 모든 올바른 주석을 선택한 후 하나씩 클릭하세요. 선택한 주석을 우클릭하여 주석이 달린 피크 목록에 추가를 선택하세요. 여러 주석이 달린 스펙트럼을 비교하는 보고서를 생성하려면 도구 다음에 보고로 들어가 서로 다른 프로필을 비교하는 보고서를 생성하세요.

보고서를 PDF로 출력해서 저장하세요. 분편화 스펙트럼 분석을 위해서는 스펙트럼을 GlycoWorkbench에 로드하고 앞서 보인 대로 피크 리스트를 생성합니다. 주석이 달린 당당 조성에 대응하는 추정 당당 구조를 그려보세요.

각 구조체별로 프래그먼트를 생성하려면 우클릭으로 '프래그먼트를 캔버스에 복사'를 선택하고 '프래그래그먼트 도구'에서 '프래그먼트 계산'을 선택하세요. 추가 단편화 분석을 원한다면, 스펙트럼 뷰어에서 관심 있는 피크를 클릭하세요. 오른쪽 클릭 후 '피크와 일치하는 모든 구조물 찾기'를 선택하면, 선택한 피크의 마스터 전하 비율을 온라인 데이터베이스와 조회할 수 있습니다.

관심 있는 추정 구조물을 선택한 후 오른쪽 클릭으로 캔버스 창에 적절한 옵션을 적용해 복사하세요. 각 당당 구조에서 가능한 조각을 계산하려면 캔버스에서 구조를 선택하세요. 그 다음 도구 및 조각 항목에서 현재 구조에 맞는 컴퓨트 조각을 선택하세요.

여러 당당 구조에 대한 조각이 계산된 경우, 요약 탭의 단편 테이블 뷰로 이동해 비교 테이블을 확인하세요. 각 잠재적 당당 구조별로 피크 리스트에 맞는 조각을 선택하세요. 드롭다운 메뉴에서 '조각을 캔버스에 복사'를 우클릭 후 선택하세요.

마지막으로 도구 탭에서 프로파일러로 가서 모든 구조가 포함된 주석 피크를 확인하세요. 그 다음 도구, 보고 항목을 선택한 후 주석 보고서를 생성하세요. 이온 교환을 통한 탈염은 더 큰 글리칸의 회수를 개선했으며, 이 큰 구조가 전체 글리칸의 31%를 차지하는 반면, PGC 추출은 21%를 차지했습니다.

확인된 당류 구조 중 한 개의 당류는 이온 교환 탈염 샘플에서만 확인되었습니다. 더불어, 이온 교환과 붕산염 제거를 통한 염분 제거는 PGC를 이용한 고체 추출 후 생성된 스펙트럼보다 신호 대 잡음비가 증가했습니다. 과밀화 반응 시간은 30분과 90분이었으며, 33개의 당당 피크가 확인되었으나, 5분 반응에서는 31개의 피크만이 확인되었습니다.