생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

이 연구는 공초점 현미경 모드에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 단일 분자 수준에서 생체 분자의 국부적 유연성과 역학을 연구하는 것을 목표로 합니다. 단일 분자 검출 및 위치 파악을 통해 생체 분자를 관찰할 수 있었지만 역학을 포착하려면 다른 접근 방식이 필요합니다. 시간 분해 형광 방법은 이러한 격차를 메우는 데 도움이 됩니다.

단일 분자 프렛 및 NMR을 포함한 생체 분자 역학을 실험적으로 연구하기 위한 일반적인 도구입니다. 단일 분자 수준에서 다양한 분석, 공정, 광자 형광 방출에 의한 광자, 여기에는 시간 분해 분석 및 버스트 분산 분석이 포함됩니다.

smFRET 실험에 여러 형광단을 사용하면 실험 설계와 충분한 품질의 샘플을 만드는 데 복잡성이 발생할 수 있습니다. 단일 라벨과 형광 이방성을 사용하면 이러한 복잡성 중 일부가 해결됩니다.

우리는 인간 FoxP1의 포크헤드 도메인의 단량체 형태가 무질서한 단백질로 행동하고 이량체화할 때 접힘 개체군을 증가시킨다는 것을 발견했습니다.

[강사] 시작하려면 준비된 표준 완충 용액을 0.22마이크로미터 기공 크기 필터를 통해 여과합니다. 그런 다음 단일 분자 획득을 위해 숯 필터를 통해 표준 완충액을 여과합니다. 형광 프로브의 경우, 준비된 BODIPY Fluorescent Pro의 소량 분취량을 준비합니다. 편광 분해 설정을 보정하려면 먼저 평행 및 수직 검출기 채널을 켜고 청색 레이저의 전원을 켭니다. 레이저 출력이 60마이크로와트로 설정되어 있는지 확인하고 시간 상관 단일 광자 계수 또는 TCSPC 소프트웨어 제어판을 엽니다. 다음으로 100나노몰 로다민 110 마이크로리터와 49 마이크로리터의 증류수를 혼합합니다. 현미경 대물 렌즈 위에 침지 액체 한 방울을 추가합니다. 커버 유리를 현미경 대물렌즈 위에 놓고 물방울이 렌즈 중앙에 있는지 확인합니다. 교정 측정을 위해 희석된 로다민 110 용액 50마이크로리터를 커버 유리 중앙에 추가합니다. 이미지 평면을 용액 내부와 유리 표면 위에 오도록 조정합니다. 초점 노브를 사용하여 두 번째 밝은 초점을 찾아 1 1/2회전으로 조정합니다. 이제 Time-Tagged Time-Resolved 모드에서 소프트웨어를 열고 START 버튼을 클릭합니다. 120초 동안 카운트 속도를 기록합니다. 배경 측정의 경우 커버 유리 중앙에 50마이크로리터의 증류수를 추가하고 획득을 반복합니다. 300초 동안 광자 카운트 속도를 기록하고 파일을 water.ptu로 저장합니다. 추가 배경 측정을 위해 커버 유리 중앙에 50마이크로리터의 표준 완충액을 추가합니다. 300초 동안 광자 카운트 속도를 기록하고 파일을 standard_buffer.ptu로 저장합니다. 이제 Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, 분석 소프트웨어를 실행하고 자동 창에서 설정 확인을 클릭합니다. 그런 다음 파일에서 매개변수 가져오기를 클릭한 다음 확인을 클릭합니다. 분석할 측정값을 선택하려면 데이터 경로 배열을 클릭하고 적절한 데이터 세트를 선택합니다. 이제 Green Scatter, Green 배경의 경우 standard_buffer.ptu 파일, Green thick의 경우 Rhodamine110.ptu와 같은 배열에 대한 물 측정 water.ptu 파일을 로드합니다. Single Molecule 선택 파라미터 아래에서 Next, Adjust 를 차례로 클릭하여 새 팝업 창을 엽니다. 그런 다음 임계값을 눌러 광자간 도착 시간을 수정하고 평균 광자 간 도착 시간에 대해 단일 분자 이벤트 시간을 선택합니다. 이제 최소 수를 클릭하여 단일 분자 이벤트당 최소 광자 수를 설정합니다. 그런 다음 Return 및 OK를 클릭하여 팝업 창을 닫습니다. Color Fit 매개변수를 클릭하여 형광 감쇠 매개변수를 사용하여 녹색 및 기타 색상의 초기 형광 수명을 조정합니다. 시작 및 종료 값을 조정하여 값을 수정, 프롬프트 및 지연하고 팝업 창을 닫습니다. 마지막으로 저장을 눌러 ASCII 파일을 처리하고 선택한 폴더에 저장합니다. 대장균 C41의 하룻밤 사전 접종물을 1:500 희석 비율로 사전 첨가된 항생제가 있는 LB 배지 500밀리리터에 옮깁니다. 배양 성장을 모니터링하기 위해 600나노미터에서 배양의 흡광도를 측정합니다. 광학 밀도가 0.5 내지 0.7 사이에 도달하면 IPTG를 최종 농도 0.5밀리몰로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 배양합니다. 배양액이 1.4 내지 1.6의 광학 밀도에 도달하면 섭씨 4도에서 20분 동안 박테리아 세포를 3,000g으로 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 펠릿을 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 50 내지 100 마이크로몰 FoxP1 단백질을 DTT 또는 TCEP의 10배 몰 초과에 첨가하고 배양합니다. 완충액 교환을 위해 컬럼 어댑터를 사용하여 PD-10 탈염 컬럼을 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 평형을 위해 5밀리리터의 PBS 완충액을 컬럼에 첨가하고 1,000g에서 2분 동안 원심분리합니다. PD-10 컬럼을 새로운 50밀리리터 튜브로 옮기고 2밀리리터의 PBS 완충액을 컬럼에 추가합니다. 이제 500마이크로리터의 FoxP1 단백질을 컬럼에 로드합니다. 정제된 단백질을 수집하기 위해 1,000g에서 2분 동안 원심분리하여 컬럼을 용리합니다. 단백질을 10킬로달톤 분자량 차단 초원심 필터로 옮깁니다. 7,500g에서 10분간 원심분리한 후, 농축된 용출액을 채취한다. 단백질 농도를 측정합니다. 그런 다음 BODIPY를 넣고 회전 장치에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 완충액 교환 및 단백질 농축을 반복합니다. 단백질 농도를 결정한 후 공식을 사용하여 라벨링 정도를 측정합니다. 495마이크로리터의 초순수와 5마이크로리터의 트윈 20을 챔버 슬라이드의 웰에 넣고 잘 섞습니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후 챔버를 초순수로 부드럽게 두 번 세척하고 건조시킵니다. 배경 형광을 보정하려면 완충 용액을 측정하십시오. 빠르게 회전하는 염료에서 데이터를 수집하여 평행 및 수직 검출기의 상대적 감도를 보정합니다. 단량체 FoxP1에 대한 단일 분자 형광 이방성 실험의 경우 100피코몰 BODIPY 표지 FoxP1 및 100 나노 몰 표지 없는 FoxP1을 챔버 슬라이드의 표준 완충액 500 마이크로리터에 추가합니다. 측정을 시작하고 BIFL 소프트웨어에서 30초 이내에 기록된 버스트 수가 60에서 90 사이인지 확인합니다. 샘플이 더 농축된 경우 버스트 카운트가 이 범위 내에 들어갈 때까지 희석합니다. 마지막으로 측정값을 분석합니다. 단일 분자 형광 이방성 수명 분석은 FoxP1 DNA 결합 도메인에서 두 개의 별개의 회전 상관 시간에서 발생하는 단일 분포를 밝혀 질서 정연하고 무질서한 구조 앙상블의 공존을 시사합니다. 버스트 분산 분석은 높은 이방성과 과도한 변이를 나타내는 FoxP1 분자의 하위 집합을 식별하여 동적 구조 변화의 존재를 시사합니다. 광자 분포 분석은 단량체와 이량체 FoxP1 상태를 구별하여 뚜렷한 이방성 분포와 교환율을 보여주었습니다. 이량체화는 특정 시스테인 표지 부위에서 상당한 이방성 변화를 나타내는 초과 분산 측정과 함께 FoxP1의 국소 및 전역 운동에 영향을 미쳤습니다. 동적 이방성 분석에 따르면 FoxP1은 이량체화 및 DNA 결합 시 부분적으로 풀려 구조화되고 무질서한 집단의 비율을 변경하는 것으로 나타났습니다.