Name: 생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준에서 생체 분자의 국소 유연성과 동역학을 시간 분해 형광 이방성을 이용해 분석하는 방법을. 공초점 현미경 모드에서 FoxP1 단백질의 구조적 특성을 상세히 관찰할 수 있습니다.

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터, 10kDa MWCO</td><td>밀리포어 시그마</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨염</td><td>밀리포어 시그마</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL 말레이미드(BODIPY FL N-(2-아미노에틸))말레이미드)</td> <td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>일회용 PD 10 탈염 컬럼</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro DMSO, 무수</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>10104159001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli C41 박테리아 세포&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037 HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>밀리포어 시그마</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758 MCE 멤브레인 필터, 0.22 및 mu; m 기공 크기</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014 Nunc Lab-Tek II 챔버 슬라이드 시스템</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) 화학적으로 유능한 세포</td><td>밀리포어 시그마</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>밀리포어 시그마</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>로다민 110</td><td>써모피셔 과학</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>나트륨 인산염 이염기성</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, 염산염, 시약 등급</td><td>Milllipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>밀리포어 시그마</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(time-resolved fluorescence anisotropy from single molecules)

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

형광 이방성은 형광단의 흡수와 방출 쌍극자 모멘트의 상대적 방향에서 발생합니다. 형광단이 편광에 노출되면 입사광의 전기장 벡터와 정렬된 흡수 전이 모멘트를 가진 형광단이 우선적으로 여기됩니다(광선택). 결과적으로, 여기 상태 집단은 부분적으로 배향 상태가 되며, 여기 분자의 상당 부분은 편광된 여기 빛(61)의 전기장 벡터와 정렬된 전이 모멘트를 갖습니다. 형광단은 브라운 운동으로 인해 회전합니다. 따라서 방출 전이 모멘트도 회전하여 형광 이방성에 대한 시간 의존성이 발생합니다. 이 효과는 형광 분자의 회전 운동을 측정하고, 결합 이벤트를 감지하고, 형광단의 환경을 특성화하고, 분자 역학을 캡처하는 데 사용할 수 있습니다.
단일 분자 실험은 샘플의 이질성을 결정할 수 있는 고유한 준비가 되어 있습니다. 단일 분자 감도와 형광 이방성을 활용하면 다중 파라미터 형광 분광법에 또 다른 차원이 추가됩니다. 일반적인 단일 분자 컨포칼 현미경(그림 2)20,21에서 펄스 레이저를 사용할 때 강도 기반 또는 시간 분해를 통해 형광 이방성을 결정할 수 있습니다.
컨포칼 현미경(62)에서 높은 개구수 대물렌즈의 탈분극 효과를 고려하기 위해, 시간-분해 이방성(35,63)의 적절한 형태는 다음과 같이 주어진다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
여기서<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;">, 및 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> 는 파장 x에서 여기 후 y번째 검출 채널에서 시간 분해 형광 강도이고, 병렬 및 수직 편광 L1 및 L2에 대한 이고, 는 이러한 측정에 사용된 높은 개구수(NA) 대물렌즈로 인한 병렬 및 수직 신호 간의 혼합을 설명하는 요인입니다(35,62), 64. 염료에 대한 병렬 및 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">수직 검출 채널의 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">검출 효율 차이는 검출 효율 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">의 비율로 보정됩니다. GUV는 G 인자라고도 합니다.
시간 분해 형광 이방성은 다음과 같이 더 큰 생체 분자에 부착되는 형광단을 설명하기 위해 다지수 감쇠를 사용하여 모델링할 수 있습니다.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
여기서 r0 는 형광단 의존 기본 이방성 (일반적으로 r0 = 0.38), r∞ 는 잔류 이방성, ρ1 및 ρ2 는 각각 빠름 (형광단의 국소 운동) 및 느린 (거대 분자의 전역 운동) 회전 상관 시간입니다.
단일 분자 이방성 측정(그림 2)에서 BIFL(Burst-Integrated Fluorescence Lifetime) 분석을 사용하여 개별 이미터를 식별하기 위해 광자 도착 시간이 기록됩니다33,35. 광자 간 도착 시간(Δt)은 실행 평균을 사용하여 평활화된 다음 시각화를 돕기 위해 플롯됩니다. 이 시간의 히스토그램에는 배경에서 발생하는 광자의 평균과 표준 편차를 결정하기 위해 반 가우스가 맞춰져 있습니다. 표준 편차의 배수로 설정되는 임의의 임계값은 각 버스트의 첫 번째 광자와 마지막 광자를 식별하면서 개별 이벤트를 필터링하는 데 사용됩니다. 그런 다음 각 버스트 내의 광자는 방정식 1 및 2를 사용하거나 최대 우도추정기 35를 통해 시간 분해 및 강도 기반 정상 상태 형광 이방성을 계산하는 것을 포함하는 추가 분석을 위해 통합됩니다. 단일 분자 이벤트에서 광자의 수가 제한되어 있기 때문에 최대우도 추정기는 단일 지수 성분만 고려하며 더 이상 논의되지 않습니다.
단일 분자 이벤트의 2차원 히스토그램에서 평균 형광 수명(τ) 및 이방성(rxy)은 평균 회전 시간(ρ)을 얻기 위해 Perrin의 방정식29,61에 의해 관련될 수 있습니다.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
특정 ρ 값은 서로 다른 버스트의 광자가 결합된 시간 분해 형광 이방성 감쇠에 통합되는 "하위 앙상블"(se) 분석을 통해 더 높은 확실성을 얻을 수 있으며, 이는 방정식 2의 매개변수를 실험적 감쇠(seTRFA)에 최적화하여 분석할 수 있습니다. Time-resolved anisotropy는 ns 시간 프레임 내에서 발생하는 형광 방출 내에서 생체 분자의 회전 운동(국소 및 전역)과 관련된 이질성 및 역학을 해결할 수 있습니다.
단일 분자 이벤트(밀리초 미만 규모) 내에서 역학을 감지하기 위해 시간 분해 이방성 버스트 분산 분석(traBVA)57을 도입했습니다. traBVA에서, Mi 연속적인 광자 세그먼트를 포함하는 광자 폭발의 경우, 폭발에 대한 초과 이방성 분산(s2)은 다음과 같습니다.
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
단일 비등방성 상태의 경우 σ2 의 분산은 샷 노이즈65 (sn: √N, 여기서 N 은 광자의 수)에서만 발생합니다.
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
여기서 m은 버스트의 광자 수입니다. 따라서 이방성에서 추가 분산을 식별하기 위해 구조적 이질성으로 인한 초과 이방성 분산(S2)을 방정식 4와 5의 차이로 정의할 수 있습니다.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
개별 분자의 관찰 내에서 발생하는 역학을 포착하고 분산 근사치를 고려하기 위해 동적 이방성 광자 분포 분석(daPDA)55,56을 사용할 수 있습니다. daPDA에서 형광 강도는 이항 분포로 표현되는 조건부 확률(<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">)에 따라 모델링됩니다.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
함께, Poisson 분포를 따르는 배경 계수 비율의 추정치와 함께
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
여기서 <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> 는 설정된 시간 창당 평균 배경 광자 수입니다. 병렬 및 수직 배경 개수 <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> 및 <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">는 버퍼 샘플을 참조로 사용하여 측정할 수 있습니다. 실험적으로 결정된 형광 이방성은 운동 변화를 포함할 수 있는 편광 채널당 형광 강도 분포로 성능 수치 χ2 를 최소화하여 최적화됩니다.
제공된 분석 루틴 및 데이터 표현은 수집된 데이터를 해석하는 포괄적인 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 주로 나노초에서 밀리초까지의 이방성 변화를 캡처하는 데 제한이 있는 컨포칼 측정에 중점을 두지만, 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 채택하여 더 긴 시간 동안 형광 이방성을 모니터링할 수 있으므로 시계열 분석이 가능합니다 66. 단일 분자 공초점 측정의 경우, 관찰된 앙상블의 고유한 지문을 생성하는 다차원 히스토그램의 사용을 강조합니다. 선택된 집단에서 재구성된 시간 분해 형광 감소는 나노초 규모에서 형광 이방성의 진화를 추적할 수 있습니다(그림 3). 광자 분포 분석(Photon Distribution Analysis) 55,56 및 버스트 분산 분석(BVA)57,58 은 또한 시간 분해 감쇠와 다차원 히스토그램 사이의 중간 시간 척도에서 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 프로토콜은 나노초에서 밀리초 시간 척도를 연결할 수 있는 펄스 여기67,68의 유무에 관계없이 편광 형광 상관 분광법(FCS)의 사용을 다루지 않지만, 제시된 프로토콜의 범위를 벗어나지만 동일한 데이터를 사용하여 FCS69를 계산할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행하는 경우 더 긴 시료 측정 시간이 권장됩니다.
이 접근 방식은 인간 FoxP 단백질과 같은 복잡한 시스템에 적용되어 작용 메커니즘과 관련된 움직임에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. FoxP 단백질은 뇌 및 폐 발달과 같은 여러 생리학적 측면에 관여하는 전사 인자입니다. 중요한 것은 다양한 돌연변이가 이러한 단백질의 기능을 손상시키는 것으로 인식되었다는 것입니다 70,71. FoxP1의 DNA 결합 도메인을 모델로 사용하여 다양한 단일 시스테인 돌연변이를 생성하여 BODIPY-FL 염료를 움직임의 추적기로 도입했습니다(그림 4A). 실제로, 우리는 이합체화(dimerization)와 DNA 결합(DNA binding)의 효과를 이 단백질의 주요 구조 조절자(structural regulators)로 평가했습니다. smFA 접근법을 사용하여 2D-smFA 플롯을 생성하고 단량체 및 이합체 조건에서 각 돌연변이에 대한 traBVA 및 daPDA를 만들었습니다. 연구된 단일 돌연변이 중 하나의 예를 보여줍니다(그림 4). 이방성 거동은 높고 낮은 회전 상관 시간을 결정하는 측면에서 모든 돌연변이에서 유사하며, 따라서 추정 가능하고, 무질서하고, 접힌 앙상블을 결정합니다. 그럼에도 불구하고, 각 앙상블의 분획 및 동역학 측면에서 모든 돌연변이에서 매우 이질적이며, 이합체화 및 DNA 결합에 의해 영향을 받는 서로 다른 질서-무질서 전이 변화를 입증하고 사슬을 따라 구조 역학의 고해상도로 설명을 보여줍니다(그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
그림 1: 생체 분자의 동적 범위와 형광 이방성 방법. (A) 관심 생체 분자의 골격을 따라 다양한 위치에 묶여 있는 작은 형광단의 이방성은 국소 구조 역학에 정보를 제공합니다. (B) 형광 강도 감소(time-resolved fluorescence anisotropy, FA) 및 컨포칼 단분자 현미경 데이터의 단분자 히스토그램에 의해 조사된 시간 척도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
그림 2: Single-molecule fluorescence anisotropy data registration and processing. (A) 자유롭게 확산되는 분자는 단일 선형 편광 여기 레이저(이 경우 파란색)가 장착된 컨포칼 단일 분자 현미경을 사용하여 분석됩니다. 형광 방출(이 경우 녹색)은 빔 편광자가 신호를 두 개의 편광(여기원에 대한 <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">평행 <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">및 수직 )으로 분할한 후 두 개의 검출기에 의해 감지됩니다. (B) 감지된 각 광자는 미시 시간, 매크로 시간 및 채널 유형의 세 가지 매개변수로 특징지어집니다. 데이터는 TTTR(Time-Tagged Time-Resolved) 형식(72)으로 저장된다. (C) 개별 분자의 버스트를 선택하고 처리하여 관찰된 각 분자에 대한 형광 이방성을 포함한 형광 매개변수를 추출합니다. (D) 데이터는 형광 이방성 대 형광 수명의 2차원 플롯 및 시간 분해 이방성 감소를 포함하여 여러 가지 방식으로 표현됩니다. 이러한 표현을 통해 형광 수명, 회전 상관 시간 및 시스템 이질성에 대한 시각적 및 정량적 결정을 모두 수행할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
그림 3: FoxP1 도메인 스왑 이량체의 대표 데이터. (A) 분자당 평균 형광 수명에 대한 형광 이방성(r산란)의 상관관계를 윤곽 플롯으로 나타낸 것. 분자의 앙상블 평균을 대표하는 두 개의 회전 성분에 대한 단일 Perrin 방정식의 오버레이, 각각 0.2 ns 및 8.5 ns의 ρ1 및 ρ2 를 고려합니다. (B) Sub-ensemble time-resolved 형광 감쇠는 샘플의 time-resolved 형광 이방성을 계산하는 데 사용됩니다. 방정식 2에 맞추면 형광 이방성의 국소 및 전역 성분이 해결되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
그림 4: 단일분자 형광 이방성(smFA)을 사용하여 모니터링한 밀리초 미만의 FoxP1 역학. (A) 단량체 FoxP1 구조를 만화로 표현한 것. (B) 2차원 히스토그램은 동적 이질성을 보여주며, 시간 분해 형광 이방성을 통해 식별된 두 개의 뚜렷한 회전 상관 시간을 나타냅니다. 시간 분해 이방성 버스트 분산 분석(traBVA)은 큰 이방성을 나타내는 초과 분산(식 6)이 있는 이벤트의 작은 하위 집합을 발견합니다. PDA(Photon Distribution Analysis)를 사용한 정량적 동적 이방성 분석은 이 프로세스에 대한 환율을 추가로 추출합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
그림 5: 이합체화 중 FoxP1의 국소 및 전역 운동 스크리닝. (A) 단량체 FoxP1과 이합체 형태를 비교한 만화 표현. (B) 단량체 및 이합체 조건에서 위치별 평균 초과 분산이 표시되며, 초과 분산이 클수록 이방성의 더 큰 변화를 나타냅니다. (C) 광자 분포 분석(PDA)을 사용한 동적 이방성 분석은 DNA의 부재(녹색) 및 존재(노란색)에서 개체군 분율(어두운 색에서 높은 이방성, 밝은 색에서 낮은 이방성)을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 접근 방식에서는 로컬 행동과 글로벌 행동 간의 전환에 대한 속도(표시되지 않음)를 추정하여 FoxP1이 부분적으로 풀림을 겪는다는 것을 밝혔습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

time-resolved-fluorescence-anisotropy-from-single-molecules-for

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

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단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

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단일 분자 FRET를 사용한 막 수용체의 구조적 역학 시각화

학습하세요 단일 분자 수준에서 생체 분자의 국소 유연성과 동역학을 시간 분해 형광 이방성을 이용해 분석하는 방법을. 공초점 현미경 모드에서 FoxP1 단백질의 구조적 특성을 상세히 관찰할 수 있습니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

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