인간 CD14⁺ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

우리는 어떤 면역 조절 치료가 이미 분화된 단핵구 유래 수지상 세포에서 내약성 수지상 세포를 생성할 수 있는지 이해하려고 하며, 이는 자가면역 및 이식 연구에 매우 가치가 있습니다. 자가 치료는 제조의 발전으로 인해 더욱 실용화되고 있으며 관용성 수지상 세포는 전임상 연구에서 가능성을 보여주었습니다. 그들은 항원 특이적 내성을 생성할 수 있습니다. 가장 일반적인 것은 세포 분석입니다. 이는 내약화된 세포를 분석하는 빠르고 접근 가능한 방법을 제공합니다. 생체 내에서 두 가지 기능을 모두 유지하는 관용성 수지상 세포를 생성하는 것은 어렵습니다. 이것이 내약성에 대해 임상적으로 승인된 수지상 세포 치료법이 없는 이유입니다. 우리는 내약화된 수지상 세포 기능의 개선을 보여주는 대규모 스크리닝 연구에서 면역 조절 화합물의 새로운 조합을 확인했습니다. 우리는 또한 내성 나노 입자 제형을 설계합니다.

[강사] 시작하려면 농축된 인간 단핵구와 T 세포가 들어 있는 15밀리리터 튜브를 원심분리기에 넣습니다. 원심분리가 완료되면 피펫을 사용하여 튜브에서 상청액을 흡인합니다. 단핵구 펠릿에 1밀리리터의 MODC 배양 배지를 첨가하고, T 세포가 있는 튜브에 1밀리리터의 T 세포 배양 배지를 첨가하고 세포 계수를 하기 전에 잘 혼합합니다. 다음으로, 단핵구 현탁액에 9밀리리터의 따뜻한 MODC 배양 배지를 첨가하여 최종 부피 10밀리리터를 만듭니다. 그런 다음 GM-CSF 및 IL-4 원액을 각각 100마이크로리터씩 피펫팅합니다. 현탁액을 MODC로 표시된 라벨이 붙은 페트리 접시로 옮기고 배양합니다. 다음으로, T 세포 현탁액에 1밀리리터의 T 세포 동결 배지를 첨가합니다. 혼합물을 2밀리리터 냉동 바이알 2개로 나눕니다. 밀봉된 극저온 바이알을 사용하지 않는 웰의 밸런싱 튜브가 있는 냉동실에 넣습니다. 4일째에 단핵구관에 신선한 MODC 배양 배지 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 GM-CSF 및 IL-4 원액 7개를 각각 100마이크로리터씩 피펫팅하고 7일째까지 배양합니다. 7일째에 분화된 단핵구 유래 수지상 세포(MDOC)를 50밀리리터 튜브로 옮기고 이전과 같이 원심분리합니다. 1밀리리터의 따뜻한 MODC 배양 배지를 세포 펠릿에 넣고 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 원하는 세포 농도가 얻을 때까지 GM-CSF 및 IL4를 포함하는 따뜻한 MODC 배양 배지로 현탁액을 희석합니다. 30,000개의 세포를 함유한 현탁액 100마이크로리터를 바닥이 평평한 96웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 1마이크로리터의 면역조절제를 지정된 웰에 넣고 배양합니다. 다음날, MODC 플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부드럽게 제거한 후 200마이크로리터의 따뜻한 HBSS를 플레이트 측면에 부드럽게 넣고 원심분리합니다. 다시 말하지만, 상청액 흡인 후 GM-CSF 및 IL4를 포함하는 따뜻한 MODC 배양 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 면역자극을 사용하는 경우, 1마이크로리터의 100X 지질다당류 스톡을 지정된 웰에 추가하고 배양합니다. 8일째에 내용물이 녹기 시작할 때까지 섭씨 37도의 뜨거운 구슬 욕조에서 두 개의 냉동 바이알을 해동합니다. 부분적으로 해동되면 바이알을 세포 배양 후드로 옮깁니다. 그런 다음 따뜻한 T 세포 배양 배지 1밀리리터를 첨가하여 세포를 빠르게 해동합니다. 내용물을 50밀리리터 튜브로 옮기고 추가 1밀리리터의 T 세포 배양 배지로 냉동 바이알을 헹구어 모든 세포를 수집합니다. 현탁액에 15밀리리터의 유동 염색 용액을 채우고 원심분리합니다. 펠릿을 5밀리리터의 유동 염색 용액에 재현탁하고 다시 원심분리한 다음 상청액을 피펫팅한 후 세포 펠릿을 1밀리리터의 따뜻한 T 세포 배양 배지에 재현탁합니다. 9밀리리터의 따뜻한 T 세포 배양 배지를 첨가하여 최종 부피 10밀리리터를 만듭니다. 현탁액을 재해동된 T 세포로 표시된 페트리 접시로 옮기고 배양합니다. 8일째에 MODC 플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 피펫팅한 후 각 웰에 200마이크로리터의 유동 염색 용액을 첨가하고 배양합니다. 그런 다음 다시 원심분리하기 전에 부착된 세포와 세포 현탁액을 새로운 96웰 V-바닥 플레이트로 위아래로 피펫팅합니다. 비특이적 결합을 차단하기 위해 상청액을 흡인한 후 50마이크로리터의 FC 수용체 결합 억제제 항체를 각 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양한 후, 준비된 검증 패널 항체 칵테일 50마이크로리터를 각 웰에 첨가합니다. 50마이크로리터의 보상 비드와 50마이크로리터의 희석된 각 항체를 1.5밀리리터 튜브에 혼합하고 배양합니다. 플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 유동 염색 용액에 재현탁시켜 세포를 세척합니다. 최종 세척 및 원심분리 후, 유세포 분석을 위해 세포를 110마이크로리터의 유동 염색 용액에 재현탁합니다. 내약성 MODC의 경우 항체 칵테일을 내성 패널 칵테일로 대체하십시오. 9일째에 재해동된 T 세포 페트리 접시를 50밀리리터 튜브로 옮기고 튜브에 유동 염색 용액을 채웁니다. 삼각 분석을 위해 염색되지 않은 T 세포가 들어 있는 두 번째 튜브를 사용합니다. 튜브를 250G에서 5분 동안 회전시킵니다. 상청액을 제거한 후 세포를 따뜻한 세포 배양 배지에 재현탁합니다. T 세포의 수를 계산하고 최소 400만 개의 세포를 얻었는지 확인합니다. MODC 플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인한 후 각 웰에 200마이크로리터의 T 세포를 추가합니다. 삼각 분석 플레이트를 위해 염색되지 않은 T 세포를 추가합니다. T 세포를 자극하고 12일까지 배양하기 위해 음성 대조군 웰을 제외한 모든 그룹에 밀리리터당 25마이크로리터의 항-CD3/CD28 항체 칵테일을 추가합니다. 다음으로, 96웰 배양 플레이트의 모든 세포 현탁액을 유동 염색 용액이 있는 V-바닥 플레이트로 옮깁니다. 200마이크로리터의 유동 염색 용액으로 세포를 두 번 세척합니다. 보상 제어를 위해 일부 셀을 따로 마련하십시오. 두 번째 세척 후 플레이트를 원심분리합니다. 그런 다음 희석된 FC 수용체 결합 억제제 항체 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 배양합니다. 배양이 완료되면 준비된 삼각 패널 항체 칵테일 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 보상 대조군의 경우, 50마이크로리터의 염색되지 않은 보상 세포와 50마이크로리터의 각 단일 염색된 항체를 혼합합니다. 플레이트와 보상 대조군을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한 다음 원심분리하기 전에 유동 염색 용액으로 세척합니다. 이제 저온 배양 전에 웰당 200마이크로리터로 HBSS에 희석된 Live/Dead Near-IR 염료로 세포를 염색합니다. Fox P3 및 유세포 분석으로 염색하기 전에 플레이트를 세척하고 원심분리합니다. 1일째에 미분화 단핵구는 주로 작은 CD14 마이너스가 있는 HLA-DR-마이너스였고, 7일째에 분화된 단핵구는 대부분의 세포가 HLA-DR-플러스 CD14 마이너스, CD1c-플러스, CD141 플러스로 나타났습니다. 지질다당류 유무에 관계없이 라파마이신을 사용한 치료는 DC-SIGN과 CD1c-플러스 집단을 유의하게 감소시키고 LPS 치료 단독으로 관찰된 CD86 및 CD40 마커의 상향 조절을 억제했습니다. FOX P3 플러스 T 조절 세포 집단은 MDC가 T 세포와 공동 배양되었을 때 증가했습니다. 그러나 4개의 MODC 치료군 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. T 세포 증식은 Rapa 처리된 MDOC와 공동 배양한 후 CD4-플러스 및 CD8-플러스 T 세포 집단 모두에서 감소했습니다. 인터루킨-10 처리 샘플은 24시간에 인터루킨-10 생산을 유의하게 증가시켰습니다. Dex로 처리된 MDOC는 인터루킨-10 생산을 유의하게 증가시켰지만 72시간 동안 휴식을 취한 후에만 가능했습니다. 덱사메타손의 전처리는 24시간에 LPS 치료 시 평균 TNF 알파 생성을 감소시켰습니다. PDL1 플러스 MDOC의 유의한 증가는 72시간에 Dex 플러스 LPS 및 Rapa 치료 그룹에서 관찰되었습니다. CD86 발현의 억제는 24시간 및 72시간 모두에서 모든 면역조절제 치료 그룹에서 관찰되었습니다. 면역조절제 처리된 MDOC는 CD4 플러스 T 세포 증식을 증가시키지 않았습니다.