개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

이 프로토콜의 전반적인 목표는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환 치료에서 면역 치료 유용성을 평가하기 위해 쥐 내성 수지상 세포를 개발하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 내성 수지상 세포를 개발하고 기능적으로 특성화하기 위한 표준화된 방법을 제공함으로써 내성 수지상 세포 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 성공적인 톨러겐 수지상 세포 발달과 기능적 톨러겐 수지상 세포 효능 테스트에 사용할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 중요합니다. 이들은 자가면역 질환에 대한 세포 면역 요법의 개발로 확장되는데, 이는 내성 수지상 세포가 내재적 면역 조절 기전의 적용을 받으면서 비정상적인 면역 반응을 재설정할 수 있기 때문입니다. 8주에서 10주 된 C57BL/6 마우스의 뒷다리 뼈를 채취한 후 표준 프로토콜에 따라 수술용 칼날과 집게를 사용하여 가능한 한 많은 조직을 절개하고 깨끗한 경골과 대퇴골을 70% 에탄올이 함유된 6cm 배양 접시에 넣습니다.

수술용 칼날로 뼈의 양쪽 끝을 잘라내고 23게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 3밀리리터의 PBS가 있는 첫 번째 뼈의 골수를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 씻어냅니다. 골수를 모두 채취한 후 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 5분 후, PBS 9ml로 용해를 중지하고 원심분리로 세포를 수집합니다.

백골수 세포 펠릿을 10ml의 배양 배지에 재현탁시키고 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과하여 새 튜브에 넣습니다. GM-CSF 및 IL-4가 보충된 배양 배지에서 10에서 밀리리터당 6번째 세포 농도의 1배로 세포를 조정합니다. 그리고 3밀리리터의 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 주입하여 섭씨 37도와 5%이산화탄소에서 3일 동안 배양합니다.

3일째에는 각 웰의 세포를 PBS 2밀리리터로 세척하고 부드럽게 소용돌이치면서 비부착성 세포를 제거합니다. 그런 다음 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 3ml의 신선 배양 배지를 세포에 공급하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 2일 후에 각 웰에 사이토카인이 보충된 3ml의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 문화 7일차에 접시를 얼음 위에 놓습니다.

10분 후, 각 웰의 배양 배지를 부드럽게 피펫팅하여 느슨하게 부착되고 미성숙한 골수 유래 수지상 세포를 현탁액으로 제거합니다. 그런 다음 원심분리를 통해 수집할 세포를 풀링하고 후속 다운스트림 분석을 위해 적절한 양의 신선한 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다. syngeneic T cell proliferation을 측정하려면 먼저 3ml 주사기 플런저의 뒤쪽 끝을 사용하여 8주에서 10주 된 OT2 C57BL/6 마우스의 비장을 40마이크로미터 세포 여과기로 으깨고 PBS로 여과기를 헹굽니다.

원심분리를 통해 풀링된 세포 현탁액을 펠렛화하고 펠릿을 400마이크로리터의 자기 세포 분류 버퍼와 100마이크로리터의 CD4 양성 T 세포 비오틴 항체 칵테일에 5분 동안 섭씨 4도에서 5분 동안 재현탁시킵니다. 배양이 끝나면 300마이크로리터의 분류 버퍼와 200마이크로리터의 항비오틴 비드를 세포에 추가하여 섭씨 4도의 배양으로 10분 동안 진행하고 마그네틱 비드 컬럼과 사전 분리 필터를 적절한 크기의 세포 분리 자석에 넣습니다. 컬럼을 3ml의 분류 버퍼로 헹구고 9ml의 분류 버퍼를 셀에 추가합니다.

원심분리 후 세포와 비드 펠릿을 3ml의 분류 완충액에 재현탁하고 세포 현탁액을 컬럼에 추가하여 적절한 용기에서 CD4 양성 T 세포 용출액을 수집합니다. 그런 다음 또 다른 3ml의 분류 버퍼로 컬럼을 세척하여 플로우스루를 수집하고 T 세포를 얼음 위에 놓습니다. syngeneic splenic pan dendritic cell isoly를 위해 8주에서 10주 된 C57BL/6 마우스의 비장을 6cm 배양 접시에 넣고 25게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 1ml의 Collagenase D 용액을 비장에 두 번 주입합니다.

그런 다음 가위를 사용하여 비장을 작은 조각으로 자르고 실온에서 25 분 동안 흔들어 조각을 배양합니다. 배양이 끝나면 500마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 조직 슬러리에 첨가하여 실온에서 최종 5분 배양을 합니다. 배양이 끝나면 3ml 주사기 플런저의 뒤쪽 끝을 사용하여 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 비장 슬러리를 으깨고 원심분리로 세포를 수집합니다.

펠릿을 350마이크로리터의 자기 세포 분류 버퍼, 50마이크로리터의 Fc 수용체 차단 시약, 100마이크로리터의 팬 수지상 세포 비오틴 항체 칵테일에 재현탁시켜 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포를 9ml의 분류 완충액으로 세척하고 방금 시연된 바와 같이 자기 비드 분류에 의한 splenic pan dendritic cell 집단의 분리를 위해 섭씨 4도에서 200마이크로리터의 항비오틴 비드와 함께 800μl의 새로운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 밀리리터 농도의 2배 10에서 5번째 수지상 세포로 재현탁시키고 섭씨 37도에서 1시간 동안 관심 트리테르페노이드의 적절한 실험 농도로 처리합니다.

배양의 마지막 3분의 1 동안, 섭씨 37도에서 15분 동안 1마이크로몰 CFSE에 1밀리리터당 7번째 세포 농도의 1배로 T 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 부피를 2배의 최종 농도로 재조정하십시오.10에서 밀리리터당 6번째 T 세포까지. 96-웰 플레이트의 각 웰에서 처리된 수지상 세포 100마이크로리터와 CFSE 표지 CD4 양성 T 세포 100마이크로리터를 공동 배양하고 세포에 1밀리리터당 100나노그램의 OVA 펩타이드 323-329를 첨가하여 배양 2-3일 후 유세포 분석으로 T 세포의 CFSE 강도를 측정합니다.

GM-CSF 및 IL-4가 있는 상태에서 완전한 배지에서 배양된 골수 전구 세포는 배양 6일 후에 미성숙 수지상 세포 형태를 나타냅니다. 미성숙한 7일차 골수 유래 수지상 세포를 분석한 결과, 대다수의 배양된 세포에서 특정 쥐 수지상 세포 마커인 CD11c의 강력한 발현이 밝혀졌습니다. LPS 유도 성숙 마커의 발현에 대한 영향이 부족함에도 불구하고, 골수 유래 수지상 세포는 LPS 자극 후에도 전염증성 유전자 발현의 현저한 감소와 향상된 항염증성 사이토카인 유전자 발현에 의해 입증된 바와 같이 CDDO-DFPA 치료에 대한 반응으로 내성 수지상 세포 프로파일을 나타냅니다.

또한, OVA가 CDDO-DFPA 처리된 수지상 세포에 의해 OVA가 제시되는 체외 공동 배양과 MOG 펄스 CDDO-DFPA 처리된 수지상 세포의 주입 후 실험적 자가면역 뇌척수염으로의 지연된 진행에 의해 입증된 생체 내 공동 배양에서 syngeneic OVA 특이적 T 세포 증식의 현저한 감소가 관찰되어 이러한 세포의 내성 표현형을 추가로 확인했습니다. 이 기술을 마스터하면 실험이 적절하게 수행되면 8일 이내에 내성 수지상 세포를 개발할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 내성 수지상 세포는 균질하지 않다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이들의 세포 표현형은 내성 유도에 사용되는 제제의 특성에 따라 달라집니다. 이 절차에 따라 상세한 유세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 내성 수지상 세포 유도 항원 특이적 T 세포 에너지 또는 세포사멸 또는 T 세포 분화 능력에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 알려진 제제를 사용하여 기능적으로 활성화된 내성 수지상 세포를 개발하는 방법 또는 이러한 세포를 유도하는 새로운 물질의 능력을 테스트하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.