Name: 개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 C57BL/6 마우스에서 내성 수지상 세포(TolDC)를 분리 배양하고 기능적으로 특성화하는 방법을. 이 표준화된 기술은 자가면역 질환 치료를 위한 세포 면역요법 연구에 활용됩니다.

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우리가 제공 하는 CDDO-DFPA Reata 제약 감사. 우리는 또한 제인이 Seidman의 자 소아 암 혁신 (John Letterio)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 국방부의 [W81XWH-12-1-0452];에 의해 지원 되었다 앤 지 파울러 사춘기와 젊은 성인 암 연구 이니셔티브 경우 종합 암 센터; 그리고 F.J. 칼라 재단에서 Hsi 주 웨이 대 한 칼라 대학원 학술 상.

모든 연구는 케이스 서쪽 예비 대학의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 골 수 유래 수지상 세포 (BMDCs) 준비
<ol><li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>CO2 챔버를 사용 하 여 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 경골 비 골 및 대 퇴 골 뼈 수술가 위를 사용 하 여 삭제할 및 70% 에탄올 10 cm 배양 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>외과 블레이드와 집게를 사용 하 여 조직 멀리 해 부 10 cm의 뚜껑에 가능한 만큼 요리 문화와 tibias 및 화관 6 cm 문화 접시에 70% 에탄올을 분리.</li>
	<li>외과 블레이드를 사용 하 여 tibias 화관의 양쪽 끝을 잘라. 23 G 바늘 3 ml 주사기에 3 mL PBS를 사용 하 여 12 ml PBS를 포함 하는 원뿔 튜브에 뼈의 한쪽 끝에서 골 수의 내용을 플러시합니다. 뼈의 양 끝에 대 한 3 배가이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 붉은 혈액 세포를 제거 하려면 5 분 동안 1 ml ACK lysing 버퍼 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>9 ml PBS ACK lysing 버퍼 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 희석에 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 ml 문화 매체 (RPMI 1640 플러스 L-글루타민, 10 %FBS, 1% 비 필수 아미노산 (100 배), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol, 및 5% 페니실린/스) resuspend. 참고: 내 수준 FBS에 EU/ml 미만 0.1을 수 있다.</li>
	<li>세포 현 탁 액 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 하 고 세포 현 탁 액의 20 µ l를 취할 trypan cytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하는 파란색의 80 µ l 믹스.</li>
	<li>1 x 106 셀/ml 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 셀 수를 조정 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀/ml의 3 ml 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 주위에서 한 마우스 골 수 세포는 3-5 107 셀, 그것 수 있는 수 배치 됨을 나타내는 2에서 3 6 잘 플레이트에 배.</li>
	<li>3 일에 각 음에 2 ml 신선한 PBS를 추가 각 우물에서 모든 3 ml 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 소용돌이 모든 비 부착 한 세포를 제거 수 있도록 접시.</li>
	<li>3 ml 신선한 문화 매체를 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4에 각 잘 바꿉니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어.</li>
	<li>5 일에 직접 각 잘에서 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml IL-4 다른 3 ml 신선한 문화 매체를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 세포를 품 어. 참고: 각 잘에서 총 볼륨은 이제 6 ml.</li>
	<li>7 일에 10 분 동안 얼음에 전체 접시를 넣어. 부드럽게 플라스틱에 서 스 펜 션에는 느슨하게 부착 BMDCs iDCs로 꺼내 려 각 잘 배양. 참고: 부착 세포는 판에 아직도 붙어있다. 낮은 온도 부드럽게 절차 추가 실험에 영향을 미칠 DC 활성화를 방지 하는.</li>
	<li>5 분 x 300g에 세포 현 탁 액을 원심 고 추가 실험에 대 한 신선한 문화 매체와 resuspend. 참고: BMDCs cytometry 여 CD11c 항 체 형광 표시로 확인할 수 있습니다 그리고 우리는 그림 1에서 추가 실험에 대 한 BMDCs의 제어 전략을 보였다.</li>
</ol>2. TolDC 유전자와 단백질 프로 파일 특징
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 와 CO2 배양 기에서 95% 습도에서 1 h 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시. 참고: CDDO-DFPA, 합성 triterpenoid-처럼-2 요소 (Nrf2) 유도 및 핵 요인-κB (NF κB) 억제제 핵 요소 (erythroid 파생 2) 이다. IDCs, IL-10, 비타민 D3, dexamethasone 베이 11-7085, 등에서 TolDCs의 유도 대 한 다른 에이전트를 적용 하 고 각 에이전트에 대 한 최적의 조건으로이 단계를 수정 합니다.</li>
	<li>잠복기 4-24 시간 mDCs (부 화 시간은 다르다 때문에 mRNA 나 단백질 측정)를 유도 하는 것에 대 한 10 또는 100 ng/ml의 LPS 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 플라스틱 각 잘에서 배양 하 고 세포 현 탁 액 1 ml 피 펫을 사용 하 여 수확. 셀과 상쾌한, 각각 수집 하 5 분에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
	<li>Cytometry 같은 물질로 ligands에 의해 셀 펠 릿에서 표면 ligands를 분석: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL, 또는 억제 ligands: PD L1, L2 PD, ILT3, ILT4.</li>
	<li>셀 펠 릿에서 RNA를 분리 하 고 RNA와 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)와 ELISA, cytokine 프로필 및 유전자와 단백질 수준에 대 한 표면에 뜨는 샘플을 각각 분석. 참고: 예를 들면, 선 동적인 cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, 일리노이-6, IL-12, 및 IL-23, 또는 항 염증 성 cytokines: IL-4, IL-10 일-15, TGF-β1, 및 호-1.</li>
</ol>3. TolDCs의 기능 평가 생체 외에서 그리고 Vivo에서
<ol><li>
T-세포 Syngeneic 확산 분석 실험
	<ol>
<li>압력가 마로 소독을 통해 모든 수술 기구를 소독 하 고 클래스 II 생물 안전 캐비닛 적절된 한 안전 절차에에서 실험을 수행 합니다.</li>
		<li>0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 500 ml PBS 2 mM EDTA 사용 하 여 MAC 버퍼를 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 필터링 하 여 버퍼를 소독. 참고: 다음 실험 기간 동안 얼음에 버퍼를 유지.</li>
		<li>CD4를+ T 세포, CO2 챔버를 사용 하 여 나이의 8-10 주 OT II T 세포 수용 체 (TCR) 유전자 변형 마우스를 안락사. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다.</li>
		<li>6 cm 문화 접시에 2 ml PBS와 함께 비장을 넣고 3 ml 주사기의 푸시 스틱의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장을 말하다.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 400 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>CD4의 100 μ 추가+ T 셀 비오 틴-항 체 칵테일 5 분 동안 4 ° C에서. 참고: 항 체 칵테일 CD4 제외 하 고 다른 셀 형식에 바인딩+ T 세포, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, 안티-MHC 종류 II, Ter-119, 그리고 TCRγ/δ.</li>
		<li>10 분 4 ° C에서 맥 버퍼의 300 μ와 반대로 Biotin 구슬 (자료 테이블)의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>강자성 분야 (자료 테이블)의 열으로 구성 하는 장소 및 사전 분리 필터는 자석에 함께 필드와 맥 버퍼의 3 ml와 함께 그것을 씻어.</li>
		<li>셀에 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 맥 버퍼의 9 ml를 추가 합니다.</li>
		<li>3 ml 맥 버퍼의 셀 펠 릿 resuspend 고 열에 적용 합니다. 수집 흐름-통해 포함 CD4+ T 세포.</li>
		<li>맥에서 버퍼의 또 다른 3 ml 열 세척 하 고 또한 흐름 통해 수집.</li>
		<li>비장 팬 Dc를, 안락사 C57BL/6 쥐 나이의 8-10 주 공동2 챔버를 사용 하 여. 해 보드에 마우스를 놓고 70% 에탄올으로 씻어. 복 부의 왼쪽에서 비장 수술가 위, 집게를 사용 하 여 격리 합니다. 콜라 D 솔루션의 2 개 ml를 포함 하는 6 cm 문화 접시에 비장을 넣어 (2 mg/ml 콜라 D 칼슘, 마그네슘을 포함 하는 HBSS에 용 해).</li>
		<li>두 번 1 ml 주사기와 25 G 바늘 비장에 콜라 D 솔루션의 1 ml를 주사. 작은 위 비장을 작은 조각으로 잘라.</li>
		<li>동요 하 고 25 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 실 온에서 0.5 M EDTA의 500 μ를 추가 합니다. 참고: 3.1.13-3.1.14에서 단계는 Dc의 수율을 높이기 위한 중요 합니다.</li>
		<li>이제 푸시 스틱 3 ml 주사기의 뒷면을 사용 하 여 40 μ m 셀 스 트레이너를 전달 하 여 비장 슬러리를 말하다 centrifuging 5 분에 대 한 300 x g에 의해 세포 현 탁 액을 수집 하.</li>
		<li>맥 버퍼, FcR 차단 시 약의 50 μ와 10 분 동안 4 ° C에서의 팬 수지상 세포 Biotin 항 체 칵테일 100 μ의 350 μ에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 항 체 DCs에 의해 표현 되지 않는다 항 원에 대 한 칵테일.</li>
		<li>5 분에 대 한 300 x g에서 맥 버퍼 및 원심 분리기의 9 ml를 추가 하 여 셀을 씻어.</li>
		<li>맥 버퍼의 800 μ에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분 4 ° C에서 안티 Biotin 구슬의 200 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Dc를 수집 하는 3.1.9-3.1.11에서 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>씻어 맥 버퍼의 또 다른 3 ml와 함께 열 두 번을 통해 흐름 또한 수집 합니다.</li>
		<li>2 x 105 Dc/ml 100-400 nM 37 ° C에서 1 시간 별도로, 라벨은 CD4+ CDDO-DFPA T 세포 (1 x 107/ml)의 유무에 15 분 동안 37 ° C에서 1 μ M CFSE와, PBS로 세척 2 x 106 T 셀/ml에서 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 하 고.</li>
		<li>다음으로 96 잘 접시에서 공동 CFSE 표시 된 CD4의 동일한 볼륨 처리 수지상 세포의 100 μ 문화+ T 세포, 1시 10분을 위의 단계에서 수집 된 둘 다 비율. 이제 보육의 2-3 일 후 잘 측정 CFSE 강도 cytometry에 의하여 T 세포의 당 100 ng/mL ovalbumin (OVA) 펩 티 드 323-329를 추가 합니다. 참고: 셀 숫자와 비율 Dc와 T의 세포 우리의 이전 작품37에서 최적화 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수동 유도 BMDCs를 주입 하 여 EAE Myelin Oligodendrocyte 당단백질 (MOG) (35-55)와 펄스
	<ol>
<li>1 시간 잠복기에 대 한 100-400 nM CDDO DFPA의 유무에서 문화 매체와 1 x 106 BMDCs/ml 6 잘 플레이트에 잘 당 2 ml 접시.</li>
		<li>추가 10 ng/ml LPS의 잠복기 24 시간.</li>
		<li>추가 100 μ g/ml 집 고 양이 (35-55)의 잠복기 4 시간.</li>
		<li>셀 펜션과 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기를 수확.</li>
		<li>PBS와 셀 펠 릿 resuspend 및 셀.</li>
		<li>피하 주사 200 μ 2 x 106 셀 8 10 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스 (100 μ 각 뒷 다리에).</li>
		<li>BMDC 주입 및 48의 날에 시간. 나중에, 200 주사 각 마우스에 백 일 해 독 소 (PTX)의 ng.</li>
		<li>반복 단계 3.2.6-3.2.7 4 연속적인 주 동안 매주 한 번 합니다.</li>
		<li>표준 기준37 (0.5-다리를 절 며 꼬리 끝, 1-다리를 절 며 꼬리, 2-보통 후방 사지 약점, 3 심각한 후방 사지 약점, 4 완전 한 뒷 다리 마비, 5 사지 또는 죽어가는 상태, 6-죽음)를 사용 하 여 매일 EAE의 임상 증상을 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

이 문서 사용할 수 있습니다. reproducibly iDCs를 생성 하 고 이후에 TolDCs로 그들을 분화 하는 효율적인 프로토콜을 설명 하 고 우리가 제안 하는이 TolDC를 유도 하기 위해 새로운 분자 대상 에이전트의 용량 평가에 적용할 수 있습니다. 표현 형입니다. 이 보고서에 설명 된 대로 우리는 우리가 먼저 표면 ligands의 TolDC 표현에 의해 분석 cytometry qRT-PCR과 ELISA로 측정 된 DC cytokine 프로필의 평가 다음 순서를 따라. 마지막으로, TolDCs의 immunoregulatory 함수는 그들의 용량을 줄이기 위해 T 세포 확산에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, MS의 전 임상 murine EAE 모델을 사용 하 여 면역을 억제 하기 위해 그들의 효능을 입증 함으로써 확인 되었다.
우리의 프로토콜 iDCs 생성 하 고 GM-CSF와 IL-4의 조합으로 murine 골 수 선구자에서 분화 했다. 다른 프로토콜...

모 수석 세포 (DCs)은 타고 난 면역 시스템의 필수적인 부분 및 처음 발견 되었고 기본 전문 항 원 제시 세포1로 1973 년에 랄 프 Steinman와 Zanvil Cohn에 의해 특징. Dc 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템22 차 림프 기관에 T 세포와 B 세포 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC) 통해 처리 항을 제시 하 여 면역 활성화에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 포유류 면역 시스템에서 Dc 골수성 Dc 및 plasmacytoid Dc (Pdc)3설명의 적어도 두 종류 있습니다. 기존의 DCs (cDCs)는 CD11c 표현의 특징이 며 골 조상 세포 또는 말 초 혈액 monocytes 사용 미 숙 Dc (iDCs) 체 외 로 분화 될 수 있다로 알려져 골수성 Dc granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF) 고 murine 또는 인간 종에서 각각4일 4.
'위험'을 활성화 신호, 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMP) 또는 손상에 관련 된 분자 패턴 (습기), 다양 한 패턴 인식 수용 체 바인딩를 통해 성숙한 Dc (mDCs)으로 면역성 Dc 향해 iDCs 성숙 드라이브 것 이다와 같은 DC 표면5. 면역성 Dc 더 프라임 naïve T 세포 확산 및 MHCII2, costimulatory ligands (CD80, CD86, CD40)6, cytokines, 및 다른 수용 성 중재자7의 upregulation 통해 감 별 법. 면역성 Dc에서 프로-염증 성 중재자 생산의 T 세포 중재 하는 cytokine 분화에 대 한 필수적입니다. 예를 들어 IFN-γ와 IL-12은 Th1 차별화8 및 일리노이-1, 필요 일리노이-6, 및 IL-23가 순진한 Th17 세포9으로 T 세포 양극 화 합니다. 성숙한 Dc 외국 항 원에 반응, 비록 자기 항 원에 의해 통제 DC 활성화 수 있습니다 허용 오차 제거 원인과 그 활성화 조직 파괴10 리드 autoreactive T 세포를 생성 하 여 자가 면역 질환의 개발 육성 .
최근 보고서 그들의 능력과 그들의 조직 microenvironment 내에서 다른 큐와 상호 작용 하는 다른 이펙터/억압 DC 하위 집합으로 구분 하 여 exemplified 하는 DC가 소성의 분명 한 증거 제공. 안티-염증 성 중재자, IL-1011, TGF-β12,13 호-1 등 tolerogenic Dc (TolDCs)를 유도 하 여 면역 억제에 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 이 TolDCs는 규정 하는 기능을 취득 하 고 T 세포 확산14억제. 또한, DCs에 의해 공동 자극의 부족 TolDCs에서 안티-염증 성 중재자의 생산 모두 규제 T 세포 (Tregs)의 감 응 작용을 하 고도 효과적으로 억제 하는 Th1과 Th17 차별화 및 확장15. 과거 2 년간, TolDCs의 치료 잠재력 보고 되었습니다 여러 수 사관. 이러한 연구에서 전 비보 의 자가 면역 질환16 의 다른 전 임상 모델에서 TolDCs 뿐만 아니라 ameliorated 병 적인 증상을 생성 하지만 환자17 면역 관용의 개발을 ,18. 흥미롭게도, 오늘 TolDCs 치료는 되었습니다 간주 대체 또는 대체 접근 방식으로 자가 면역 질환 등 여러 가지 임상 실험에 타입 1 당뇨병 mellitus19, 류 마티스 관절염20, 21, 다 발성 경화 증 (MS)22,,2324, 그리고 Crohn의 질병25.
다양 한 프로토콜을 TolDCs를 개발 하기 위해 고용 되어 있으며 여러 실험실 생성 및 TolDCs의 phenotypic 특성에 대 한 방법을 보고 있다. Reproducibly 조 혈 창시자에서 생체 외에서 TolDCs 생성 하 고 안정적으로는 tolerogenic 상태 vivo에서26,,2728,29에서 그들을 유지 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. iDCs 다양 한 immunomodulatory 약리학 대리인 또는 항 염증 성 cytokines에 노출에 의해 TolDCs로 변환할 수 있습니다. 예를 들어 비타민 d 3는 IL-10 생산을 증강 하 고 Dc에서 IL-12 분 비를 억제 하 고 그로 인하여 그들의 면역 기능30높일 수 알려져 유명한 약리 에이전트. 또한, Dc lipopolysaccharides (LPS) 등 강력한 염증 성 자극에 노출 되 면 dexamethasone31, rapamycin32, 코르 티 코 스테로이드33 등 여러 가지 약리 에이전트 표시 되었습니다 유도 하는 CD40, CD80 그리고 CD86, MHCII34의 DC 표면 식 줄여 TolDC 표현 형. IL-10과 TGF-β는 DC 내성35 와 이러한 cytokines의 둘 다에 수 반하는 노출 유도를 대부분 공부 항 염증 성 cytokines Dc36에서 tolerogenic 표현 형을 유도 하기 위해 표시 되었습니다.
DC phenotypic 표식으로 있다 보다는 기능적 특성에 의해 정의 됩니다 tolerogenic 이후 큰 TolDCs의 세포 및 기능 특성에 대 한 일관 된 방법을 개발 해야 합니다. 또한, 엄격 하 고 일관 된 프로토콜을 설정 해야 합니다 일관 된 평가 및 tolerogenic DC 형의 특성에 대 한 만약 우리가 효과적으로 그리고 reproducibly에서 TolDC 표현 형을 유도 하기 위해 새로운 에이전트의 능력을 비교 하는 실험실입니다. 여기 우리가 제공 상세한 프로토콜 단계별 방법 iDCs 마우스의 조 혈 창시자에서 분리 하 고 이후 TolDCs로 iDCs를 변환 하는 그들의 능력에 대 한 평가에서 새로운 에이전트의 효능을 분석 하는 강력한를 제공 하 TolDCs의 기능 그리고 phenotypic 특성 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 설명에는 그들의 표면 ligands, cytokine 단면도, 및 면역 기능에 생체 외에서TolDCs 하는 정교한 메서드가 포함 됩니다. 우리는 또한 MS, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)의 전 임상 모델에서 이러한 TolDCs의 잠재적인 치료 응용 프로그램을 탐색 하는 방법의 예를 제공 합니다. 이 설립된 프로토콜 조사 TolDCs의 유도 홍보 하기 위해 새로운 에이전트의 용량을 평가 하는 데 도움이 됩니다 그리고 TolDC 치료 개발의 범위를 확대 하기 위해 노력을 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>in house synthesis</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>마우스 GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>BMDC 차별화</td></tr><tr><td>마우스 IL-4</td><td>(주)페프로텍</td><td>214-14</td><td>BMDC 분화</td></tr><tr><td>지질다당류(LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>세포 배양</td></tr> <tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>백일해 독소 (PTX)</td><td>R& D 시스템</td><td>3097</td><td>EAE 유도</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) 펩타이드</td><td>21세기 사내 생화학</td><td>합성</td><td>EAE 유도</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>RPMI-1640 플러스 L-글루타민</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>40 &#956; m 세포 스트레이너</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>세포 분리</td></tr><tr><td>PE 결합 CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>PE 결합 CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>PE 결합 PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>APC 결합 MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>APC-conjugated CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>동형과 일치하는 PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>유세포 분석</td></tr><tr>APC <td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>와 일치하는 동형을 확인하십시오</td>.<td>130-091-836</td><td>유세포 분석</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>팬 수지상 세포 분리 키트</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>팬 수지상 세포 비오틴-항체 칵테일</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>CD4+ T 세포 분리 키트</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>CD4 + T 세포 비오틴-항체 칵테일</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>BMDC 분화</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>3 ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC 분화</td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>23G 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC 분화</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td>시그마 Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>오브알부민 (OVA) 펩타이드 323&ndash; 329</td><td>시그마 알드리치 Inc.</td><td>O1641</td><td>T 세포 증식 분석</td></tr><tr><td>마우스 IFN-&감마; TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>마우스 IL-12a TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>마우스 IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D 시스템</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>마우스 EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&알파; TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>마우스 TNF-&알파; Quantikine ELISA 키트</td><td>R& D 시스템</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>마우스 IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D 시스템</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>마우스 IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& D 시스템</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; TaqMan 프로브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxygenase 1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACS칼리버 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석</td></tr></tbody></table>

개발 및 murine tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

면역 체계는 외국 항 원에 대 한 조정 응답 사이 단단한 균형을 유지 하 여 운영 하 고 공생 생물에서 파생 된 항 원 뿐 아니라 자기 항 원에 대 한 응답 상태를 유지 하. 이 면역 항상성 장애 만성 염증 및 면역의 개발에 발생할 수 있습니다. 모 수석 세포 (DCs) 외국 항 원에 대 한 면역 반응 시작 naïve T 세포 활성화에 관련 된 타고 난 면역 계통의 전문 항 원 제시 세포 이다. 그러나, Dc T 세포 허용을 추진 하 고 유지 하 고 어느 면역 또는 만성 염증의 발전에 기여 하는 효과 기 세포를 억제 하는 TolDCs에 또한 분화 될 수 있습니다. TolDCs의 우리의 이해에 있는 최근 전진 그들의 분화 상태를 변조 하 여 DC 허용 오차를 얻을 수 있습니다 나왔다. 이 현상을 면역 관용에 휴식을 인해 발생 하는 수많은 면역 장애에 대 한 TolDC 요법 개발에 엄청난 성장을 주도하 고 있다. 전 임상 면역 murine 모델에서 성공적인 연구 자가 면역 질환의 치료에 TolDCs의 immunotherapeutic 유틸리티 유효성 검사 추가 있다. 오늘, TolDCs는 보호 면역을 그대로 하면서 병원 성 면역 응답을 대상으로 다양 한 면역 질환에서 면역 관용을 복원에 대 한 클리닉에서 유망한 immunotherapeutic 도구 되고있다. 전략의 배열을 TolDCs를 유도 하기 위해 여러 연구소에 의해 제안 되었습니다, 이러한 세포의 세포 고 기능 형 특성화에 없음 일관성. 이 프로토콜은 골 파생 Dc 큰 숫자, 합성 triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic와 TolDCs로 그들을 차별화 하는 데 사용 되는 독특한 방법의 개발에 대 한 단계별 가이드를 제공 합니다. 산 성-difluoro-틸-아 미드 (CDDO-DFPA), 그리고 TolDCs의 필수 분자 서명의 분석을 포함 하 여 그들의 표현 형을 확인 하는 데 사용 하는 기술. 마지막으로, 우리는 그들의 면역 반응에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 다 발성 경화 증의 전 임상 모델에서 테스트 하 여 TolDC 기능을 평가 하는 방법을 보여줍니다.

차별화와 BMDCs의 선택:
골 조상 세포는 7 일 (그림 1A)로 iDCs 분화 GM-CSF와 IL-4의 완전 한 RPMI 매체에 경작 했다. 하루에 1, 셀 크기에 작은 되었고 구형 형태를 보였다. 3 일에 신선한 매체의 교체 형태 클러스터 셀을 도움이 CD11c의 인구 증가 하기 전에 PBS로 세척+ 세포. 하루에 4, BMDCs 크기에서 확대 됐다 하 고 클러스터 형성을 시작. 준수 세포 또한 변환 하 고 길쭉한 모양으로 접시의 아래쪽에서 관찰 했다. 5 일에 BMDCs의 대형 크기의 클러스터 형성 된다. 6 일에 반 부착 및 부동 BMDCs의 많은 또한 관찰 되었다. BMDCs 제 7 일에 수확 되었고 cytometry murine Dc의 특정 마커로 ...

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환 치료에서 면역 치료 유용성을 평가하기 위해 쥐 내성 수지상 세포를 개발하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 내성 수지상 세포를 개발하고 기능적으로 특성화하기 위한 표준화된 방법을 제공함으로써 내성 수지상 세포 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 성공적인 톨러겐 수지상 세포 발달과 기능적 톨러겐 수지상 세포 효능 테스트에 사용할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 중요합니다. 이들은 자가면역 질환에 대한 세포 면역 요법의 개발로 확장되는데, 이는 내성 수지상 세포가 내재적 면역 조절 기전의 적용을 받으면서 비정상적인 면역 반응을 재설정할 수 있기 때문입니다. 8주에서 10주 된 C57BL/6 마우스의 뒷다리 뼈를 채취한 후 표준 프로토콜에 따라 수술용 칼날과 집게를 사용하여 가능한 한 많은 조직을 절개하고 깨끗한 경골과 대퇴골을 70% 에탄올이 함유된 6cm 배양 접시에 넣습니다.수술용 칼날로 뼈의 양쪽 끝을 잘라내고 23게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 3밀리리터의 PBS가 있는 첫 번째 뼈의 골수를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 씻어냅니다. 골수를 모두 채취한 후 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다. 5분 후, PBS 9ml로 용해를 중지하고 원심분리로 세포를 수집합니다.백골수 세포 펠릿을 10ml의 배양 배지에 재현탁시키고 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 여과하여 새 튜브에 넣습니다. GM-CSF 및 IL-4가 보충된 배양 배지에서 10에서 밀리리터당 6번째 세포 농도의 1배로 세포를 조정합니다. 그리고 3밀리리터의 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 주입하여 섭씨 37도와 5%이산화탄소에서 3일 동안 배양합니다.3일째에는 각 웰의 세포를 PBS 2밀리리터로 세척하고 부드럽게 소용돌이치면서 비부착성 세포를 제거합니다. 그런 다음 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 3ml의 신선 배양 배지를 세포에 공급하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 2일 후에 각 웰에 사이토카인이 보충된 3ml의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 문화 7일차에 접시를 얼음 위에 놓습니다.10분 후, 각 웰의 배양 배지를 부드럽게 피펫팅하여 느슨하게 부착되고 미성숙한 골수 유래 수지상 세포를 현탁액으로 제거합니다. 그런 다음 원심분리를 통해 수집할 세포를 풀링하

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

이 비디오는 인간 단핵구에서 미성숙, 성숙 및 내성 수지상 세포(DC)의 생성을 보여줍니다. 성장 인자와 사이토카인을 가진 단핵구의 배양은 미성숙 DC의 생산으로 이어집니다. 면역 조절 분자에 대한 반응으로 미성숙 DC는 내성 및 성숙 DC로 분화합니다.

단핵구에서 미성숙, 성숙 및 톨러겐 수지상 세포 생성

이 동영상은 면역조절 약리제를 사용하여 수지상 세포(DC)를 허용 DC(TolDC)로 변환하는 방법을 보여줍니다. 이 변환은 CD4+ T 세포에 대한 면역억제 효과를 통해 TolDC 기능을 평가하여 확인됩니다.

수지상 세포와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용에 대한 면역조절 약리학적 제제의 효과

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

미성숙 수지상 세포는 내성과 내성 사이의 균형을 조절하기 위해 내성 또는 성숙 수지상 세포로 선택적으로 분화될 수 있습니다. 이 연구는 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(moDC), 체외 내성 및 성숙한 moDC(대사 표현형이 다른 moDC)를 생성하는 방법을 제시합니다.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

학습하세요 C57BL/6 마우스에서 내성 수지상 세포(TolDC)를 분리 배양하고 기능적으로 특성화하는 방법을. 이 표준화된 기술은 자가면역 질환 치료를 위한 세포 면역요법 연구에 활용됩니다.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

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