이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

이 연구의 전반적인 목표는 in vitro에서 수지상 세포 생성을 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교하고 유세포 분석을 이미징하여 생성된 단핵구 유래 집단의 CT11c, CT14 세포 표면 발현을 특성화하는 것입니다. 이러한 단핵구 분리 프로토콜은 연구 및 임상 응용을 위한 인간 수지상 세포의 정제를 위한 신뢰할 수 있는 방법의 개발에 기여할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 주요 장점은 인간 단핵구의 분리와 생존 가능하고 기능적인 단핵구 유래 세포로의 분화를 용이하게 한다는 것입니다.

또한, 이번 연구는 단세포 이미징 유세포 분석법을 통해 단핵구 유래 수지상 세포의 특정 집단을 특성화한 최초의 연구입니다. 이 방법은 또한 다운스트림 연구 응용 분야를 위한 적절한 수율로 다른 희귀 세포를 분리하기 위한 대안으로 적용할 수 있습니다. 적절한 지침과 경험 없이 혈액 샘플을 안전하게 취급하는 것이 어려울 수 있으므로 이러한 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

혈액 샘플을 T75 플라스크에서 PBS와 1:1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 50ml 원심분리 튜브에 15ml의 밀도 구배 용액을 추가하고 구배 위에 25-30ml의 희석된 혈액을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 말초 혈액 단핵 세포를 적절하게 분리하려면 밀도 구배 용액에 혈액을 빠르지만 조심스럽게 그리고 층을 혼합하지 마십시오.

원심분리로 세포를 분리한 다음 백혈구 계면층을 새로운 50ml 원추형 튜브로 이식합니다. PBS에서 세포를 두 번 세척하고 최종 펠릿을 10ml의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액에 섭씨 4도에서 15분 동안 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 PBS에서 세포를 두 번 더 씻습니다.

부착 방법으로 단핵구를 분리하기 위해, 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 새로운 T75 플라스크에서 완전한 배지 10밀리리터당 생성된 PBMC 펠릿의 7개 세포에 10배를 5배 배양하고 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 배양이 끝나면 비부착성 부유 세포를 버리고 부착 세포를 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 인간 GMCSF 및 IL4가 보충된 완전한 세포 배양 배지를 부착 세포에 공급하고 5-7일 동안 배양기에 다시 넣습니다.

자기 분리에 의해 단핵구를 분리하기 위해, 밀도 구배 분리에 의해 PBMC를 수집한 후, 백혈구층을 5 밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮기고, PBS에 있는 세포를 밀리리터 당 5 곱 10 - 7 세포 농도로 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 밀리리터당 50마이크로리터의 인간 단핵구 농축 칵테일을 혼합하여 세포에 첨가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 칵테일과 함께 세포를 배양합니다. 그런 다음 세포 1밀리리터당 50마이크로리터의 자성 입자를 조심스럽게 혼합하고 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 배양합니다.

두 번째 배양이 끝나면 세포에 PBS를 추가하여 총 부피를 2포인트 5밀리리터까지 늘리고 2-3회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 폴리스티렌 튜브를 실온의 적절한 자기 장치에 넣습니다. 2분 30초 후, 튜브를 자석에 넣은 상태에서 정제된 단핵구 분획을 새로운 15ml 원추형 튜브에 디캔팅합니다.

그런 다음 방금 설명한 바와 같이 GMCSF 및 IL4가 보충된 정제된 단핵구와 완전한 세포 배양 배지를 5-7일 동안 배양합니다. 7일간의 분화 후, 단핵구 유래 수지상 세포의 6개 세포 분취량에 10회 1회 분주하여 적절한 수의 1포인트 5밀리리터 튜브에 투여하고, 각 샘플에 50마이크로리터의 열 비활성화 인간 혈청을 첨가하여 비특이적 발견을 차단합니다. 10분 후, 세포를 원심분리하고 펠릿을 적절한 형광 접합 1차 항체에 다시 현탁시켜 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 20분 동안

그런 다음 1 밀리리터의 PBS에 세포를 두 번 세척하고 6 개의 세포에 1 배의 10 번마다 100 마이크로 리터의 PBS에 펠릿을 재현 탁시킵니다. 분석 직전에 각 튜브에 1마이크로리터의 DAPI를 추가합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 single cell imaging 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다.

평균적으로 순응법(adherence method)에 의해 분리된 단핵구는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 집단의 약 6.2%를 차지하는 반면, 자기 분리에 의해 분리된 단핵구는 전체 PBMC의 최대 25%를 차지합니다. 두 방법 중 하나로 분리된 단핵구는 동일하게 생존할 수 있습니다. 두 가지 방법으로 정제된 단핵구와 구별된 MDDC는 먼저 전체 단일 세포의 DAPI 음성 또는 생존 세포를 기반으로 게이팅한 다음 각 세포 집단의 게이팅을 수행했습니다.

두 가지 분리 방법 모두 낮은 단일 CD14 양성 모집단을 산출했으며, 두 방법 모두 높은 총 CD11c 양성 모집단을 산출했습니다. 모든 CD11c 양성 세포에 대해 추가 표현형 분석이 수행되었으며 자기 분리가 이중 양성 CD11c 양성 CD14 양성 세포의 더 높은 비율을 제공하더라도 이러한 효과는 부착 방법과 비교할 때 유의하지 않았습니다. 이러한 이중 양성 CD11c 양성, CD14 양성 세포는 아직 CD14 단핵구 마커를 떨어뜨리지 않은 초기 단계의 분화된 MDDC일 수 있습니다.

단일 CD11c 양성 세포를 분석할 때 접착 방법은 CD11c 양성, CD14 음성 세포의 가장 높은 수율을 제공합니다. 이러한 단일 양성 세포는 후기 단계의 분화된 MDDC일 수 있습니다. 일단 숙달되면 접착 및 자기 분리 기술이 제대로 수행되면 각각 3-4시간 및 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 배지가 보충될 때 48시간마다 새로운 수지상 세포 분화 사이토카인이 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 혈액과 같은 생물학적 위험 액체로 작업하는 것은 매우 해로울 수 있으므로 이러한 절차를 수행할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비 및 폐기 방법을 사용해야 합니다. 이 연구는 면역학 분야의 연구자들이 치료 치료를 위해 인간 단핵구와 수지상 세포를 사용하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 다양한 단핵구 유래 세포 집단을 in vitro에서 생성하기 위해 인간 단핵구 분리를 최적화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.