Name: 이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 인간 단핵구 격리 방법을 비교하여 수지상 세포를 생성하고 이미징 유동 세포 계측법으로 세포 표면 마커를 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 면역학 연구와 임상 응용에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism)의 지원을 받아 K99/R00 AA021264상을 수상했습니다. 스타트업 패키지의 일환으로 면역학과, 신경면역 약리학 연구소, Herbert Wertheim 의과대학 및 FIU(연구 및 경제 개발국)로부터 추가 실험실 지원을 받았습니다. Gianna Casteleiro는 NIH/NIGMS R25 GM061347의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

전체 인간의 혈액 연구를 검토하고, IRB 프로토콜 승인 번호의 IRB-13-0440 FIU의 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다. 인간 leukopaks 마이애미, 플로리다의 지역 사회 혈액 은행에서 구입 하였다. 표준 밀도 그라데이션 기법에 의해 PBMC를 1. 분리 <ol><li> T75 플라스크에 1 배 - 인산 완충 생리 식염수와 혈액의 1 희석 : 1을 수행합니다. </li><li> 피펫 (15) 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액의 ml를 조심스럽게 층 -이 그라데이션을 통해 희석 된 혈액 (25 ~ 30 ㎖ / 튜브). </li><li> 1의 가속과 0의 감속 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 계면 층 (백혈구)를 수집하여 PBS로 두 번 (1080 XG에서 3 분) 세포를 세척 하였다. 때마다 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 암모늄, 염화 칼륨, 용균 (ACK) 완충액으로 세포를 치료 (적혈구를 용해시키기 위해). 버퍼와 10 ML을 추가4 ℃에서 15 분 동안 cubate. </li><li> 1,080 XG에서 3 분 동안, PBS로 두 번 원심 분리기 세포를 씻고마다 상층 액을 버린다. </li><li> PBMC를을 포함하는 펠렛을 저장합니다. </li><li> 선택의 단핵 세포 정제 방법으로 진행합니다. </li></ol> 준수 방법 2. 단핵구 정화 <ol><li> L 글루타민 하였다 (300 mg / ㎖)을 포함한 전체 세포 배양 배지를 준비 페니실린 (50 U / ㎖) -streptomycin (50 μg의 / ml) 및 10 % 소 태아 혈청. </li><li> 이 PBMC를 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 완전 배지 10 ㎖ 당 5 × 107 세포의 농도에서 T75 플라스크에 이들을 배양하여 약 2 시간 동안 부착 할 수있다. </li><li> 배양 후, 배양 플라스크에서 비 부착 떠있는 세포를 제거하고 부드럽게 PBS로 두 번 부착 세포를 씻는다. </li><li> 인간 과립구 macr 2 μL / mL로 보충 된 완전 세포 배양 배지에서 부착 세포를 부화ophage 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨 4 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다. </li><li> 매체의 절반을 변경하고 사이토 카인마다 48 시간을 보충. </li><li> MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다. </li></ol> 자기 분리 방법 3. 단핵구 정화 <ol><li> 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 붓고 세포 / ml의 농도로 PBS 버퍼에 일시 중지 다시 표준 밀도 구배 기법으로부터 PBMC를 수집. </li><li> 50 μL / ㎖의 세포를 사용하여 인간 단핵 세포 농축 칵테일을 추가 잘 혼합하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 50 μL / ml의 세포를 사용하여 자성 입자를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 5 분간 배양한다. </li><li> , PBS 완충액을 첨가하여 2.5 ml의 총 부피까지 세포 현탁액을 가지고 다운이 닫 피펫 팅하여 잘 혼합하고 - 3 회. </li><li> 자기 장치에 캡없이 폴리스티렌 튜브를 삽입하고이 동안 실온에서 방치0.5 분. </li><li> 배양 후와 하나의 연속 동작으로, 자석을 선택하고 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 원하는 정제 단핵 세포 분획을 붓는다. </li><li> 전체 세포 배양 인간 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)을 2 μL / mL로 보충 된 배지 4 인터루킨에 부착 세포를 부화 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다. </li><li> 모든 48 시간은 매체의 절반을 변경 5 분 동안 1,080 XG에 스핀 다운 및 새로운 미디어 (CRPMI) 및 사이토 카인과 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다. </li></ol> 4. 트리 판 블루 제외 생존 분석 참고 : PBMC를, 단핵구 및 MDDCs의 세포 수율과 생존을 얻기 위해이 기술을 사용합니다. <ol><li> 표준 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크하고 PBS를 이용하여 세포 펠렛의 세척을 수행 수확 세포. 펠렛의 크기에 따라 재펠렛을 용해 PBS 5 내지 10 ml의 정지. </li><li> 희석 된 세포 펠렛과 트리 판 블루 시약 1 희석 마이크로 원심 분리 튜브에 1을 수행한다. </li><li> 이 믹스에서 셀에 나누어지는 10 μl의 슬라이드를 계산하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 결과를 참조하십시오. 자동 세포 계수기를 사용할 수없는 경우 유사한 세포 수는 혈구 또는 수동 계수기를 사용하여 가능하다. </li></ol> 5. MTT 분석 <ol><li> 웰 96 웰 플레이트의 각으로 완전한 미디어 4 × 10 100분의 4 μL의 농도로 플레이트 세포. 세포는 문화에 적응하기위한 24 시간을 허용합니다. </li><li> 품어 각각 0 (0 일), 36 (3 일), 84 (7 일) 시간에 측정을 수행합니다. </li><li> 원하는 배양 완료시, 미디어를 제거하고 혼자 PBS 100 ㎕로 교체합니다. </li><li> 준비 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) - 다이 메틸 10 ㎖를 첨가하여 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 용액 (MTT) (5 ㎎ / ㎖)도데 실 황산나트륨 1g을 (SDS)에 일 설폭 사이드 (DMSO). </li><li> 각 웰에 MTT 용액 10 μL (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 추가 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 부화 후, PBS와 회심 MTT 혼합물 (노란색 컬러 솔루션)를 포함 상층 액을 제거합니다. </li><li> 각 웰에 SDS-DMSO 용액 100 μl를 추가하고 하나의 추가 시간 동안 배양한다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol> 6. 세포 표면 이미징 유동 세포 계측법에 의해 염색 분석 <ol><li> 정제 단핵 세포에서 분화 7 일 후, 1.5 ml의 튜브의 해당 번호로 단핵구 유래 수지상 세포의 1 × 6 전지 씩 분배. </li><li> 불 활성화 열 50 μL (HI) 인간 혈청을 사용하여 차단하는 세포에 의해 세포 표면의 얼룩을 시작, 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 원심 분리기 세포 5 분 720 XG에는, 상층 액을 버린다. </li><li> PELLE 셀t는 각각의 형광 색소 - 컨쥬 게이트 된 항체 (예, 항 중 CD11c 또는 항 CD14)를 첨가하고, 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 그들은 보상을 위해 필요하기 때문에 별도의 튜브에서) 하나의 형광 색소 묻은 샘플 / ㎖를 준비합니다. </li><li> 배양 후, 5 분 동안 720 XG에서 PBS 버퍼와 원심 분리기 1 ㎖ 때마다 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 빛으로부터 보호 셀을 유지하는 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 / 100 ㎕의 농도로 PBS 완충액에 재현 정지. </li><li> 생존 세포의 게이트하기 위해, 종래 제조업체의 지시에 따라 악기 계측법 단세포 촬상 흐름 세포를 취득하여 각 튜브에 DAPI 1 μL를 추가한다. </li></ol> 7. 통계 분석 <ol><li> 입력 스프레드 시트에있는 모든 데이터. </li><li> 학생의 t-시험 및 / 또는 편도 적절한 ANOVA를 사용하여 결과를 비교한다. </li><li> 페이지의 경우 &lt;0.05 통계적으로 유의 한 것으로 차이를 고려한다. </리&gt; </ol>

<ol><li>Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+maturation+and+antigen+presenting+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Imunol%22%5BJournal%5D)">Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells.</a> Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of Dendritic Cells.</a> Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Kaouther, M., Ridha, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Graft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Graft Tolerance.</a> ISRN Pharmacol. , (2011).</li>
<li>Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+the+principal+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> J Exp Med. 157, 613-627 (1983).</li>
<li>Nair, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-directed+inhibition+of+DC-SIGN+by+dendritic+cells%3A+Prospects+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy.</a> AAPS J. 7, E572-E578 (2005).</li>
<li>Agudelo, M., et al. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgudelo%2C+M+%22Dendritic+Cells%3A+Types%2C+Life+Cycles+and+Biological+Functions%22">Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions</a>. , Nova Publishers. 167-177 (2010).</li>
<li>Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dendritic+cell-tumor+fusion+cells+on+cancer+vaccines+-+past+progress+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies.</a> Immunotherapy. , (2015).</li>
<li>Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+tissue+specific+tolerance+in+autoimmune+disease+with+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells.</a> Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).</li>
<li>Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+dendritic+cell+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy.</a> Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).</li>
<li>Zwolak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+dendritic+cells+in+alcoholic+and+autoimmune+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders.</a> Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).</li>
<li>Agudelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+functional+role+of+cannabinoid+genes+in+alcohol+users%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users.</a> Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).</li>
<li>Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+Versus+Cannabinoids%3A+A+Review+of+Their+Opposite+Neuro-Immunomodulatory+Effects+and+Future+Therapeutic+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alcohol+Drug+Depend%22%5BJournal%5D)">Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials.</a> J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).</li>
<li>Boukli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+ER+Stress%2C+the+Unfolded+Protein+Response%2C+and+Pro-+and+Anti-Apoptotic+Protein+Fingerprints+in+Human+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+Treated+With+Alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).</li>
<li>Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+Modulates+DC-SIGN+Expression+by+Mature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).</li>
<li>Napuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Enhances+HIV-1+Infectivity+in+Monocyte+Derived+Dendritic+Cells+by+Suppressing+microRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155.</a> PLoS ONE. 8, e83682(2013).</li>
<li>Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methamphetamine+on+expression+of+HIV+coreceptors+and+CC-chemokines+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells.</a> Life Sciences. 88, 987-994 (2011).</li>
<li>Nair, M. P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Modulates+Dendritic+Cell-Specific+C+Type+Intercellular+Adhesion+Molecule-3-Grabbing+Nonintegrin+Expression+by+Dendritic+Cells+in+HIV-1+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients.</a> J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).</li>
<li>Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+methamphetamine+%28METH%29-induced+differential+protein+expression+by+immature+dendritic+cells+%28IDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC).</a> Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).</li>
<li>Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells.+Enrichment+and+characterization+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood.</a> J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).</li>
<li>Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mac-1+and+p150%2C95+beta+2+integrins+bind+denatured+proteins+to+mediate+leukocyte+cell-substrate+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion.</a> Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).</li>
<li>Delirezh, N., Shojaeefar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+between+flask+adherent+and+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells.</a> Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).</li>
<li>Lehner, M., Holter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-Free+Purification+of+Monocytes+for+Dendritic+Cell+Generation+via+Discontinuous+Density+Gradient+Centrifugation+Based+on+Diluted+Ficoll-Paque+Plus%3Csup%3E%C2%AE%3C%2Fsup%3E%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®.</a> Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).</li>
<li>Van Brussel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting%3A+An+effective+approach+to+study+dendritic+cell+subsets+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques.</a> J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).</li>
<li>Mucci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methodological+approach+for+the+generation+of+humandendritic+cells+from+monocytes+affects+the+maturation+state+of+the+resultant+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells.</a> Biologicals. 37, 288-296 (2009).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuan%2C+N+%22The+American+Association+of+Immunologists+%28AAI%29%22">The American Association of Immunologists (AAI)</a>. , AAI. Miami Beach, FL. (2007).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+dendritic+cell+progenitors+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.</a> J Exp Med. 180, 83-93 (1994).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+and+monocyte+adherence+techniques+for+in+vitro+generation+of+immature+dendritic+cells%3A+an+Egyptian+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial.</a> Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).</li>
<li>Curry, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurry%2C+CV+%22Differential+Blood+Count%22">Differential Blood Count</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview">http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview</a> (2015).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).</li>
<li>Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cell+Cultures+Is+Caused+by+Progenitor+Cells+Capable+of+Myeloid+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation.</a> Blood. 92, 1598-1607 (1998).</li>
<li>Ardeshna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+proliferate+and+are+not+susceptible+to+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction.</a> Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).</li>
<li>Chapuis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).</li>
<li>Zhou, L. J., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B+blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

모든 저자는 경쟁하는 금전적 이해관계를 공개하지 않습니다.

단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 22,30,31를 포함한다. 비교 2 대안 방법에 의해 음성 선별 된 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 농축 키트 (26)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 분리 방법의 장점은, 원하지 않는 셀이며표지와 표적 세포를 자유롭게 열 직접 항체로 세포를 표적으로하지 않고도 새로운 튜브 속으로 주입하면서 자석을 이용하여 분리된다. 상관없이 단...

수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV 6,7 암 (8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 9 및 알레르기 반응 (10). 수지상은 또한 알코올 의존 11-14, 13, 15, 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다. 지금까지 DC가 체외의 생성에 대한 확립 된 방법 중 일부는 (22) 자기 활성 셀 정렬, 형광 활성화 된 셀 정렬로 단핵 세포 (21, 22)의 플라스틱이나 유리 준수, 밀도 기울기 원심 분리 (23), 특정 마커 기반의 분리 구성 24, 덱스 트란 코팅 자성 나노 입자 (25), 및 완전 자동화 된 음의 셀 선택 (26)를 사용하여 고순도 단핵 세포의 신속한 분리를 사용하여 CD14 +의 단핵 세포의 긍정적 인 선택. 그러나 선택의 가장 좋은 방법은 논란이 남아있다. 따라서, DC 생성 기술을 개선하기 위해 다양한 방법이있는 개발되어왔다이러한 세포의 순도가 크게 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 정제하여 27 CD34 + 조상 세포 및 단핵 세포의 분화에 의해 증가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDCs)을 생성하는 광범위하게 사용되는 대중적인 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 조사하는 것이다. 접착력 방법은 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않고 신속하고 간단한 방법이다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 (28)를 포함한다. 접착력 방법의 대체 방법은 특별히 음성 선별 (26)에 의해 한 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여, 총 한 PBMC로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 절차를 수행하는 동안, 원치 않는 세포는 테트라와 제거를 대상으로항체 복합체 및 덱스 트란 코팅 된 자성 입자. 이 분리 방법의 장점은 원치 않는 표지화 된 세포가 표적 세포를 자유롭게 열 필요없이 새로운 튜브 속으로 주입 될 수 있지만 자석을 이용하여 분리되어 있다는 것이다. 지금까지 고유 한 세포 인구 레이블을 수있는 특정 단일 클론 항체의 가용성, 자기 분리 기술은 추가 방법,하지만 면역학 분야의 희귀 세포의 분리에 대한 필요성 단순히되고있다. 예를 들면, 자기 셀과 같은 기술 연구 및 임상 응용 22,29 새로운 방법의 개발을 용이 한 시판 상자성 나노 입자-MACS 선별. 또한, 단핵구의 부착 및 MACS 기술 방법에서 DC 생성을 비교하는 최근의 연구 조사는 단핵 세포 22,30 분리 MACS를 사용하여 더 높은 DC 순도 및 생존 능력을 증명하고있다. 본 연구의 선물상업용 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여 접착 한) 단핵 세포 분리 및 2) 단핵 세포 분리 음성 선별 기준 : PBMC를 분리 인간 단핵구로부터 수지상 세포의 생성에 대한 두 가지 방법의 비교. 이 연구는 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리 할 수있는 음의 선택 자기 분리 절차는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성하는 보여주는 증거를 제공합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 그것은 동시에 증식과의 CD11c로 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 입증 때문에 전체적으로 현재 연구 + 위에서 언급 한 선행 연구와 다르다자신의 가능성을 손상시키지 않고 문화 7 일 후에 MDDCs (&gt; 70 %). 또한, 현재의 방법은 유동 세포 계측법 촬상 다를은 CD11c / CD14 MDDCs는 인구의 처음 특성을 제공한다. 수지상은 면역학 분야의 연구에 관한 초점 역할 때문에 이들이 유도 된 어떤 방법은 시험관 내에서 이들을 분리하고 배양하기 위해 사용되는 방법을 고려하면 요약하면, 다른 파라미터가 고려되어야한다. 따라서 본 연구는 두 가지 단핵구 분리 방법 및 방법이 방법은 차등 결국 수지상 세포 생존, 증식 및 단핵구의 표현형에 영향을 생존 및 수율에 영향을 통찰력을 제공하는 것을 목적으로한다. 이러한 발견은 면역학 분야에 크게 기여하고 DC 분리, 정제 및 특성에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>반드시 RT</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep 완충액</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 단핵구 농축 키트</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-덱스트란</td><td>시그마 Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 스테인(0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 다중 모드 리더</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT 나트륨 염 생물 시약(XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 생물 시약(DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>페나 진 메토 설페이트 (DMSO)</td> <td>시그마 Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>비활성화 (HI) 인간 혈청</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 유세포 분석기</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis 유세포 분석기</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

수지상 세포(DC)는 림프구 반응, 숙주 방어 메커니즘 및 염증의 발병에 중요한 역할을 하는 면역 체계의 항원 제시 세포입니다. DC의 분리 및 연구는 독특한 특징 때문에 생물학 연구에서 중요했습니다. DC는 면역 체계의 필수 핵심 매개체이지만 혈액에서는 매우 드물며 전체 혈액 단핵 세포의 약 0.1 - 1%를 차지합니다. 따라서 분리 방법의 대안은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 분리된 단핵구와 DC의 분화에 의존합니다. 단순성, 경제성, 고순도 및 높은 세포 수율을 결합한 적절한 분리 기술의 활용을 반드시 고려해야 합니다. 현재 연구에서는 DC 생성을 위한 두 가지 고유한 방법을 비교합니다. 단핵구는 자기 분리 절차를 사용하여 부착 또는 음성 농축에 의해 선택된 후 IL-4 및 GM-CSF를 사용하여 DC로 분화되었습니다. 단핵구 및 MDDC 생존율, 증식 및 표현형은 이미징 유세포 분석을 통한 생존능 염료, MTT 분석 및 CD11c/CD14 표면 마커 분석을 사용하여 평가되었습니다. 자기 분리 방법은 접착 방법과 비교할 때 더 높은 증식 능력을 가진 단핵구의 비율이 훨씬 더 높았지만, 이번 연구 결과는 배양에서 7일 후에 생존 가능한 CD11c+ MDDC로 증식 및 분화할 수 있는 단핵구를 동시에 생성하는 두 기술의 능력을 입증했습니다. 두 방법 모두 70%> CD11c+ MDDC를 산출했습니다. 따라서 우리의 결과는 인간 DC의 격리 및 특성화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 데 기여하는 통찰력을 제공합니다.

<html> 자기 분리에 의해 단핵구의 수율은 준수 방법에 의해 단핵구 수익률에 높은를 비교한다 PBMC를하고 단핵 세포의 분리 분리의 날에 트리 판 블루 배제 법에 의해 그림 1 표시 PBMC와 단핵구 세포 수에 제시된 데이터. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를의 최대 25 %를 차지하면서 평균적으로 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 PBMC를 약 6.2 %를 차지했다. 통계 분석은 자기 분리에 의해 산출 단핵 세포의 비율이 상당히 높은 (≥ 4 배)이었다 것으로 나타났습니다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법 (0.0005 ≤ p)를 비교했을 때 단핵구 수율의 유의 한 차이를 보였다 -test 학생의 t을 사용하...

이 연구는 체외 수지상 세포(DC)를 얻기 위한 두 가지 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교합니다. 단핵구는 부착에 의해 선택되거나 자기 분리에 의해 음적으로 강화됩니다. MDDC 생존력, 증식 및 CD11c/CD14 표면 마커 발현과 함께 단핵구 수율 및 생존율을 두 방법 간에 비교합니다.

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

본 연구의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro) 수지상 세포 생성을 위한 두 가지 서로 다른 인간 단핵구 분리 방법을 비교하고, 이미징 유세포 분석법을 통해 결과로 얻은 단핵구 유래 집단의 CT11c, CT14 세포 표면 발현을 특성화하는 것입니다. 이러한 단핵구 분리 프로토콜은 연구 및 임상 응용을 위한 인간 수지상 세포 정제의 신뢰할 수 있는 방법 개발에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜들의 주요 장점은 인간 단핵구의 분리와 이를 생존 가능하고 기능적인 단핵구 유래 세포로 분화시키는 것을 용이하게 한다는 점입니다.또한, 본 연구는 단일 세포 이미징 유세포 분석법을 통해 단구 유래 수지상 세포의 특정 집단을 특성화한 첫 번째 연구입니다. 이 방법은 후속 연구 응용 분야에서 적절한 수율로 다른 희귀 세포를 분리하기 위한 대안으로도 적용될 수 있습니다. 적절한 지침과 경험 없이는 혈액 샘플을 안전하게 취급하는 것이 어려울 수 있으므로, 이러한 방법들에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.먼저 T75 플라스크에서 혈액 샘플을 PBS와 1:1 비율로 희석합니다. 그다음, 50 mL 원심분리 튜브에 밀도 구배 용액 15 mL를 넣고, 희석된 혈액 25~30 mL를 구배 층 위에 조심스럽게 층을 이뤄 붓습니다. 말초혈액 단핵구(PBMC)를 적절하게 분리하기 위해서는 층이 섞이지 않도록 주의하면서 혈액을 밀도 구배 용액 위에 빠르게 부어야 합니다.원심분리를 통해 세포를 분리한 다음, 백혈구 인터페이스 층을 새로운 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. PBS로 세포를 2회 세척하고, 최종 펠릿을 10 milliliters의 ammonium chloride potassium 용해 버퍼에 현탁하여 4 degrees celsius에서 15분 동안 둡니다. 그 후 PBS로 세포를 2회 더 세척합니다.부착법을 통해 단핵구를 분리하려면, 새로운 T75 플라스크에 완전 배지 10 milliliters당 결과물인 PBMC 펠릿의 세포 5 × 10⁷개를 넣고, 습윤 배양기 내 37 °C 및 5 % CO₂ 조건에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양 종료 후, 부착되지 않고 떠 있는 세포들은 제거하고 부착된 세포들을 PBS로 2회 조심스럽게 세척합니다. 그 후, human GMCSF와 IL4가 첨가된 완전 세포 배양 배지를 부착 세포에 공급하고 배양기를 통해 5~7일 동안 배양하십시오.자기 분리법으로 단핵구를 분리하려면, 밀도 구배 분리로 PBMC를 수집한 후 백혈구 층을 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮기고 5 × 10⁷ cells/mL 농도의 PBS에 세포를 재부유시킵니다. 다음으로, 세포 1 mL당 50 µL의 human monocyte enrichment cocktail을 첨가하여 혼합하고 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 세포 1 mL당 50 µL의 자기 입자를 첨가하여 조심스럽게 혼합하고 4 °C에서 5분 동안 배양합니다.두 번째 배양이 끝나면, PBS를 세포에 추가하여 총 부피를 2.5 mL로 맞추고 피펫팅을 2~3회 수행하여 혼합합니다. 그런 다음 폴리스티렌 튜브를 상온의 적절한 자성 장치에 놓습니다. 2.5분 후, 튜브를 자석에 둔 상태에서 정제된 단핵구 분획을 새로운 15 mL 원뿔형 튜브에 따릅니다.그 다음, 방금 시연한 것과 같이 정제된 단핵구(monocytes)를 GMCSF와 IL4가 보충된 완전 세포 배양 배지에서 5~7일 동안 배양합니다. 7일간의 분화 후, 단핵구 유래 수지상 세포를 1×10⁶ 세포씩 적절한 수의 1.5 mL 튜브에 분주하고, 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 샘플에 열 불활성화된 인간 혈청 50 µL를 첨가합니다. 10분 후, 세포를 원심 분리하고 펠렛을 적절한 형광 접합 1차 항체에 현탁하여 4 °C에서 빛을 차단한 상태로 20분 동안 반응시킵니다.그 다음 1 mL의 PBS로 세포를 2회 세척하고, 세포 $1 \times 10^6$개당 100 µL의 PBS로 펠릿을 재현탁합니다. 분석 직전에 각 튜브에 1 µL의 DAPI를 추가합니다. 그런 다음, 제조사의 지침에 따라 싱글 셀 이미징 유세포 분석기로 샘플을 측정합니다.평균적으로 부착법으로 분리된 단핵구는 전체 말초혈액 단핵구(PBMC) 집단의 약 6.2%를 차지하는 반면, 자기 분리법으로 분리된 단핵구는 전체 PBMC의 최대 25%까지 차지합니다. 두 방법으로 분리된 단핵구의 생존율은 동일합니다. 두 방법으로 정제된 단핵구로부터 분화된 MDDC는 먼저 전체 단일 세포 중 DAPI 음성 또는 생존 세포를 기준으로 게이팅한 후, 각 세포 집단을 순차적으로 게이팅하였습니다.두 분리 방법 모두 낮은 비율의 단일 CD14 양성 군을 생성하였으며, 두 방법 모두 높은 비율의 전체 CD11c 양성 군을 생성하였습니다. 모든 CD11c 양성 세포를 대상으로 추가적인 표현형 분석을 수행하였으며, 자성 분리법이 CD11c 양성 및 CD14 양성인 이중 양성 세포의 비율을 더 높게 나타냈으나, 부착법과 비교했을 때 이 효과는 유의미하지 않았습니다. 이러한 CD11c 양성, CD14 양성 이중 양성 세포는 아직 CD14 단구 마커가 소실되지 않은 초기 단계의 분화된 MDDC일 가능성이 있습니다.단일 CD11c 양성 세포를 분석했을 때, 부착법이 CD11c 양성 및 CD14 음성 세포를 가장 높게 수득하였습니다. 이러한 단일 양성 세포들은 분화 후기 단계의 MDDC일 수 있습니다. 숙달된 후 적절하게 수행한다면, 부착법과 자성 분리법은 각각 3~4시간과 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 배지를 보충할 때마다 48시간마다 신선한 수지상 세포 분화 사이토카인을 준비해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 혈액과 같은 생물학적 위험 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이러한 절차를 수행할 때는 항상 적절한 개인 보호 장구와 폐기 방법을 사용해야 합니다. 본 연구는 면역학 분야의 연구자들이 치료법으로 인간 단핵구와 수지상 세포의 활용 가능성을 탐색할 수 있는 길을 열어줍니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 인비트로(in vitro)에서 다양한 단핵구 유래 세포군을 생성하기 위해 인간 단핵구 분리 과정을 최적화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

학습하세요 인간 단핵구 격리 방법을 비교하여 수지상 세포를 생성하고 이미징 유동 세포 계측법으로 세포 표면 마커를 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 면역학 연구와 임상 응용에 활용됩니다.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

더 많은 동영상 탐색