August 15th, 2025
여기에서는 시간 경과에 따른 미토콘드리아 분열 및 융합 활동의 3차원 변화를 정량화하는 데 유용한 ImageJ 플러그인인 미토콘드리아 이벤트 로컬라이저(MEL)를 설명합니다. 또한 ImageJ에서 분석하기 전에 현미경 사진을 정리하는 데 유용한 이미지 처리 파이프라인에 대해서도 설명합니다.
우리 연구의 목적은 미토콘드리아 네트워크의 변화를 관찰하고 이러한 미토콘드리아 네트워크가 세포 상태에 반응하여 어떻게 변하는지 조사하는 것입니다. 우리는 Fiji 및 Python과 같은 오픈 소스 도구를 사용하여 기존 라이브러리를 사용자 정의 매크로 및 스크립트와 결합하여 복잡한 형광 현미경 데이터에서 미토콘드리아 형태 분석을 자동화합니다. 미토콘드리아 분열 및 융합의 역학을 3D로 국소화하여 설명하는 신뢰할 수 있는 정량적 데이터 및 지표를 달성하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
이러한 데이터 생성에 대한 표준화는 일반적으로 사용할 수 없습니다. 따라서 세포 특이적 분열 및 융합 빈도와 세포 내 국소화에 대한 지식은 제한적입니다. 우리는 미토콘드리아 핵분열 및 융합의 생명 검출을 사용 가능한 연구 지표에 추가했습니다.
그리고 이를 미토콘드리아 구조 수와 결합함으로써 미토콘드리아 네트워크 역학을 이해하기 위한 새로운 지표를 정의할 수 있었습니다. 우리의 발견을 통해 세포 특이적 분열 및 융합 매개변수를 특성화하고 미토콘드리아 시스템이 평형 상태인지 이동 중인지 처음으로 결정할 수 있습니다. 이는 건강 및 질병의 표현형에 대한 주요 오해를 방지하고 정확한 보고를 위한 명확한 프레임워크를 제공합니다.
시작하려면 ImageJ에서 원시 파일을 엽니다. 관심 영역의 가시성을 높이기 위해 색상 설정을 조정하되 아무 것도 설정하지 마십시오. 분석해야 하는 단일 셀의 수에 따라 이미지를 복제합니다.
시야에 여러 셀이 있는 경우 분석, 도구로 이동하여 동기화된 창 도구 및 자유형 그리기 도구를 사용하여 관심 셀 주위에 관심 영역을 그린 다음 편집을 선택하고 외부 지우기를 선택하여 선택한 셀을 분리합니다. 빨간색과 파란색 채널을 서로 분할하고 미토콘드리아 채널을 tif 파일로 저장합니다. 점 확산 함수 또는 PSF를 생성하려면 원시 이미지를 다시 엽니다.
그런 다음 플러그인을 선택한 다음 PSF 생성기를 선택하고 Born wolf 3D 광학 모델을 선택하여 PSF 생성기 플러그인을 엽니다. 이미지를 선택한 다음 정보 표시를 선택하거나 키보드에서 I를 눌러 Raw 이미지의 이미지 정보를 엽니다. 이미지 정보 창의 맨 아래로 스크롤합니다.
복셀 크기 및 깊이 옵션을 선택하고 파장을 568나노미터로 변경합니다. 픽셀 크기 XY를 166.1나노미터로, Z-스텝을 200나노미터로 설정합니다. 512 x 512의 이미지 해상도와 일치하도록 XYZ 크기를 설정하고 10개의 Z-슬라이스를 포함하도록 Z-스택을 구성합니다.
실행을 클릭합니다. PSF를 자체 폴더에 tif 파일로 저장합니다. 플러그인으로 이동하여 매크로를 선택한 다음 편집을 선택한 다음 Deconvolution_time_lapse_mine를 선택합니다.
ijm을 사용하여 디콘볼루션 매크로에 액세스할 수 있습니다. 필요에 따라 입력 및 출력 라인을 편집하고 실행을 눌러 매크로를 실행합니다. 이미지 대비 향상 및 흐림 처리를 위해 플러그인으로 이동하여 매크로를 선택한 다음 편집을 선택한 다음 전처리를 엽니다.
ijm을 사용하여 전처리 매크로에 액세스할 수 있습니다. 롤링 볼 반경을 6으로 설정하여 배경 빼기를 수행합니다. 반지름이 배율 계수의 1배로 설정되도록 시그마 필터 플러스를 설정합니다.
사용되는 픽셀 수는 2이고 최소 픽셀 비율은 0.2이므로 플러그인이 이상값을 인식하도록 설정됩니다. 블록 크기를 64로, 히스토그램 구간을 256으로, 최대 기울기를 2.5로, 감마를 0.8로 구성하여 CLAHE 설정을 조정한 후 실행을 클릭하십시오. 전처리를 사용하여 수정된 관심 파일을 엽니다.
ImageJ의 ijm 매크로. 플러그인(Plugins) 으로 이동하여 적응형 임계값(Adaptive Threshold) 을 선택합니다. 로컬 임계값을 가중 평균으로 설정하고 필요에 따라 픽셀 블록 크기를 조정합니다.
미리보기를 클릭하고 가능한 한 많은 미토콘드리아를 명확하게 포함하도록 블록 크기를 조정합니다. 불필요한 배경을 제거하기 위해 각 셀의 빼기 값을 수정하고 결과 현미경 사진을 기록해 둡니다. 시간을 최적화하려면 적용된 빼기 값에 따라 이미지를 파일로 정렬합니다.
이제 플러그인으로 이동하여 매크로를 선택하고 편집을 선택하고 임계값을 엽니다. 임계값 매크로에 액세스하기 위한 IJM입니다. 매크로 스크립트를 편집하여 올바른 입력 및 출력 경로, 블록 크기 및 빼기 값을 정의합니다.
실행을 클릭하여 매크로를 실행합니다. 동일한 치료 조건에 속하는 임계값 현미경 사진을 최대 10장까지 엽니다. 이미지(Image), 스택(Stacks), 도구(Stacks, Tools) 로 이동하여 연결 (Concatenate) 을 선택한 다음 OK.To 눌러 임계값 설정으로 남겨진 잔여 작은 점점을 제거하고 플러그인 (Plugins) 으로 이동한 다음 통합 이미지 필터 (Integral Image Filters) 로 이동한 다음 이상치 제거 (Remove Outlists) 를 선택합니다.
미리보기를 사용하여 X 및 Y 크기를 미세 조정하여 조각을 제거합니다. 연결된 파일을 TIF 파일로 저장합니다. 마지막으로 플러그인, 매크로, 편집, QuickTest_new.ijm으로 이동합니다.
적절한 디렉토리를 가리키도록 입력 및 출력 경로 라인을 편집하고 실행을 클릭하여 미토콘드리아 이벤트 현지화 또는 MEL 결과를 시각화합니다. 미토콘드리아 역학은 3D 및 2D 보기 모두에서 분열 사건을 표시하는 빨간색 점과 핵분열 사건을 표시하는 녹색 점으로 시간이 지남에 따라 추적되었습니다. 미토콘드리아 네트워크는 메트포르민 처리 세포에서 더 길고 상호 연결된 형태와 메트포르민 CCCP Baf 처리 세포에서 고도로 단편화된 네트워크로 시간이 지남에 따라 구조의 치료 특이적 차이를 보였습니다.
메트포르민 CCCP Baf 그룹은 대조군 또는 메트포르민 단독군보다 유의하게 더 높은 핵분열 및 융합 활성을 보였으며, 이는 미토콘드리아 리모델링의 증가를 시사합니다. 이 그룹은 또한 향상된 단편화와 일치하는 미토콘드리아 수가 상당히 높았습니다. 같은 그룹에서 미토콘드리아 부피가 크게 감소하여 핵분열로의 전환을 더욱 뒷받침했습니다.
그러나 미토콘드리아 수로 정규화했을 때 메트포르민 단독 그룹은 가장 높은 상대적 동적 활성을 나타냈으며, 이는 메트포르민 단독이 보다 활동적이고 효율적인 리모델링 네트워크를 촉진하는 반면 공동 치료는 광범위하지만 덜 효율적인 구조적 회전율을 유도한다는 것을 시사합니다.
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이 연구는 시간에 따른 미토콘드리아 분할 및 융합의 3D 변화를 정량화하기 위해 설계된 ImageJ 플러그인인 미토콘드리아 이벤트 로컬라이저(MEL)를 소개합니다. 또한 분석 전에 현미경 사진을 향상시키기 위한 이미지 처리 파이프라인을 설명합니다.
Quantitative, three-dimensional analysis of mitochondrial fission and fusion dynamics is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular stress and drug response. The described pipeline and MEL plugin enable standardized, reproducible measurement of mitochondrial network remodeling, directly supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enhances portfolio decision-making by clarifying cellular phenotypes in response to pharmaceutical intervention.
This pipeline integrates from early discovery imaging through lead identification and preclinical model validation, supporting hypothesis testing and mechanistic clarity at each stage.