Stereo-seq 를 통한 종에 구애받지 않는 전사체의 포괄적인 공간 프로파일링
2025년 10월 31일
이 기사에서는 조직 구조를 보존하면서 다양한 전사체의 고해상도 매핑을 가능하게 하는 Stereo-seq를 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 숙주, 바이러스, 진균 및 마이크로바이옴 RNA의 포괄적인 공간 전사체 프로파일링을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.
저희 연구는 난소 종양 미세환경을 상세히 특성화하여 예측 및 치료 바이오마커를 규명하는 데 중점을 둡니다. 예를 들어, 우리는 항암제 반응과 항암제 저항성을 예측할 수 있는 마커나 2차 치료법을 위한 새로운 치료 표적을 찾고자 합니다. 실험적 도전 과제로는 샘플 취급, 샘플 품질 평가, 샘플 처리 시간 등이 포함됩니다.
데이터 분석 측면에서는 다른 단일 셀 프로세스와 유사한 데이터의 희소성, 특히 반복적인 영역의 매핑 문제 등이 도전 과제로 존재합니다. 스테레오 시퀀싱 N-칩을 포장에서 제거한 후, 칩 식별 번호를 기록합니다. N-칩 표면을 만지지 않고 100% 에탄올로 유리 슬라이드를 세척하세요.
마이크로 피펫을 사용해 스테레오 시퀀싱 N-칩 가장자리에 자외선 경화 세라믹 수지 10마이크로리터를 조심스럽게 발라. 밀폐된 폼 면봉을 사용해 과도한 수지를 제거하고, 칩 가장자리 주변에 얇은 선만 남기세요. 슬라이드를 자외선 경화 장치에 넣어 칩 표면이 닿지 않도록 하세요.
이제 수지 코팅 칩을 불투명 마스크 위에 올려 405나노미터 자외선광원에 올려 슬라이드 뒷면을 밝히고 5분간 경화시킵니다. 경화 후에는 밀봉된 폼 면봉을 100% 분자등급 에탄올, 70% 에탄올, 마지막으로 뉴클레아제가 없는 물에 담가 레진 주변을 청소합니다. 칩을 50밀리리터 원뿔형 튜브를 사용해 신선한 뉴클레아제가 없는 물에 세 번 담가.
압축 공기를 사용해 약 60도에서 80도 각도로 전체 공기의 힘으로 칩을 말리고, 약 5센티미터 거리에서 대각선으로 표면을 가로질러 이동시킵니다. 다음으로, 칩 표면 전체에 150마이크로리터의 폴리-L-라이신 용액을 고르게 바르고, 칩을 상온에서 10분간 배양합니다. 그 다음 칩에서 폴리-L-라이신 용액을 제거하세요.
두 번째 세척 후에는 칩 표면에 닿지 않고 슬라이드 가장자리를 조심스럽게 건조하세요. 앞서 보인 것처럼 압축 공기를 사용해 칩을 단단히 건조하세요. FFPE 조직을 절절로 절단할 때는 칩을 직접 만지지 말고, 조직으로 칩의 80%만 덮으세요.
SSC 버퍼에서 2마이크로리터의 단일 가닥 DNA 염색액을 준비하기 위해, 큐비트 단일 가닥 DNA 시약을 5X SSC 버퍼로 희석합니다. 리보뉴클레아제 억제제 1에서 20 희석, 단일 가닥 DNA 용액 1에서 200 희석, 나머지 부피에 5X SSC 완충액을 사용하여 염색 용액의 마스터 믹스를 만듭니다. 각 칩에 150마이크로리터의 염색액을 넣고 실온에서 5분간 어두운 환경에서 배양합니다.
그 후 피펫으로 각 칩 모서리에 있는 착색액을 부드럽게 제거하세요. 칩을 0.1X SSC 버퍼로 두 번 10초에서 15초 정도 세척한 후, 슬라이드 가장자리를 조심스럽게 건조시킵니다. 슬라이드에 약 3에서 5마이크로리터의 글리세롤을 추가하여 장착하세요.
슬라이드 위 약 1cm 지점에서 커버슬립을 내려 수평을 유지하고 칩 표면에 닿지 않도록 하세요. 광시야 현미경을 사용해 단일 가닥 DNA 염색 조직의 형광 이미지를 촬영하여 이미지 타일 간 10% 중복을 보장합니다. ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 획득한 이미지를 스티치하여 먼저 이론적 겹침을 이용해 근사적인 타일 위치를 생성하고, 그 다음 픽셀 매칭 계산 겹침을 적용하여 타일링을 미세 조정합니다.
스티치된 이미지를 StereoMap 소프트웨어에서 처리하고, 이미지 품질 관리가 통과되었는지 확인한 후 계속 진행하세요. 스테레오 시퀀싱 슬라이드를 0.1X SSC 버퍼 30밀리리터에 담가서 커버슬립이 분리될 때까지 보관하세요. FFPE 가교 시약이 실온에 있는지 확인하고 입자 여부를 검사하세요.
열사이클러를 켜고 평형 상태를 위해 30도, 30분 부화를 위해 95도, 4도에서 무한 유지로 설정하세요. 카세트 가스켓을 조립하고 스테레오 시퀀싱 칩 슬라이드를 카세트에 넣으세요. 그 다음 스테레오 시퀀싱 슬라이드 카세트의 웰에 FFPE 탈가교 시약을 넣고, 카세트에 밀봉 테이프를 붙인 후 밀봉 상태를 확인하세요.
30분간 95도에서 잠복을 시작하세요. 10분 후, 25밀리리터의 메탄올을 50밀리리터 용기에 넣어 20도 냉동고에 넣고, 슬라이드당 약 1밀리리터를 준비해 나중에 사용할 준비를 합니다. 열사이클러에서 칩을 제거한 후, 슬라이드 카세트를 작업대로 옮기고 밀봉 테이프를 떼어내세요.
피펫을 사용해 카세트에서 FFPE 탈가교 시약을 제거하고 버립니다. 시약이 완전히 제거되면 카세트와 개스킷을 분리하여 버리세요. 멸균 후드 아래에서 슬라이드 가장자리를 건조시키고, 필요하면 새로운 실리콘 챔버를 설치하세요.
20도 냉동고에서 500마이크로리터의 차가운 메탄올을 추가하여 전체 구간을 물에 잠기게 하세요. 사용 전에 37도 드라이블록에 PR 용액을 10분간 예열하세요. 고정 후 연기 후드에서 슬라이드에 남은 메탄올을 닦아내고 칩에 남아 있는 메탄올이 증발할 때까지 기다립니다.
새 카세트 엔드 가스켓을 조립하세요. 증발이 완료되면 스테레오 시퀀싱 칩 슬라이드를 카세트에 넣습니다. 칩에 200마이크로리터의 예열된 투과성 시약을 추가하세요.
스테레오 시퀀싱 슬라이드 카세트에 밀봉 테이프를 붙이고 단단히 밀봉하세요. 역전사를 수행한 후 여기 표시된 단계에 따라 CDNA 방출 및 정제를 수행합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 37도까지 예열하세요.
칩의 밀봉을 제거하세요. 조직 위에서 긁거나 만지지 않고 각 모서리와 칩 중앙을 힘차게 피펫으로 바르세요. 칩에서 제공되는 모든 무료 DNA 방출 혼합물을 수집하여 1.5밀리리터 또는 2.0밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다.
칩 표면에 미리 가열된 무핵효소 물 350마이크로리터를 직접 첨가하세요. 작은 피펫으로 힘차게 피펫을 사용하며, 끝을 각도로 기울여 조직에 닿거나 칩을 긁지 않고 강한 힘을 가하세요. 워시와 이전에 수집한 400마이크로리터의 무료 DNA 방출 혼합물과 결합하여 단일 칩의 물질만 결합되도록 합니다.
칩 위에 뉴클레아제가 없는 물 100마이크로리터를 넣으세요. 스테레오 시퀀싱 슬라이드를 밀봉하고 프로토콜 종료 시까지 냉장고에 보관하세요. FFPE 절편에서 SAW 파이프라인을 이용한 단일 세포 분할이 이루어져 tRNA, TRDMT1과 같은 비폴리아데닐화 RNA로 매핑할 수 있었습니다.
독점 소프트웨어 StereoMap을 이용한 인터랙티브 공간 시각화는 조직의 확대된 영역에 다양한 색상으로 클러스터가 표시된 가상적 세포 유형을 보여주었습니다. 비폴리아데닐화 RNA TRDMT1의 전체 조직 발현을 StereoPi를 사용해 시각화하였다. 프로토콜의 적응은 지방 및 취약한 조직의 전사 체공간 프로파일링에서 발생했던 문제를 해결하여, 조직 부착력, RNA 접근성, 그리고 이러한 어려운 조직 유형에서의 스테레오 시퀀스 처리 능력을 개선했습니다.
스테레오-시퀀스는 현재 다른 공간 전사체 방법보다 500나노미터 해상도를 제공하며, 이는 2마이크론에 비해 높은 해상도입니다. 또한 미생물군, 바이러스, 비다아데닐화 전사체 연구에 필요한 편향 없는 포획을 제공합니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 기사는 Stereo-seq을 사용하여 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직 절편에서 숙주, 바이러스, 곰팡이 및 마이크로바이옴 RNA의 종합적인 공간 전사체 프로파일링을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 조직 구조를 보존하면서 다양한 전사체의 고해상도 매핑을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 전사체학
배경
- 난소 종양 미세환경의 특성화.
- 예측 및 치료 바이오마커의 식별.
- 샘플 처리 및 품질 평가의 문제점.
- 데이터 희소성으로 인한 데이터 분석 문제.
연구 목적
- 화학 요법 반응 및 내성을 예측하는 마커를 찾기 위함.
- 2차 치료를 위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위함.
- 종양 미세환경에 대한 이해를 향상시키기 위함.
사용된 방법
- Stereo-sequencing N-Chip 프로토콜.
- 샘플 처리 및 품질 평가 기술.
- 희소성 및 매핑을 고려한 데이터 분석 방법.
- 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직 절편의 사용.
주요 결과
- 다양한 전사체의 성공적인 매핑.
- 분석 중 조직 구조의 보존.
- 치료 반응에 대한 잠재적 바이오마커의 식별.
- 전사체학에서의 데이터 분석 문제에 대한 통찰력.
결론
- 이 프로토콜은 RNA의 종합적인 프로파일링을 가능하게 합니다.
- 고해상도 매핑은 바이오마커 발견에 도움이 될 수 있습니다.
- 실험 과제에 대응하는 것이 성공에 중요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Stereo-seq enables comprehensive spatial transcriptomic profiling of both host and non-host RNA species in FFPE tissues, addressing a critical gap in unbiased, high-resolution mapping of cellular and microbial transcriptomes. This capability supports predictive confidence in target validation and biomarker discovery, particularly in complex tissue microenvironments such as tumors. The method's species-agnostic approach enhances portfolio decision-making by revealing intra- and inter-actome interactions relevant to therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of transcriptomic heterogeneity within disease-relevant tissues.
- Supports identification of predictive and therapeutic biomarkers by mapping cell-type and pathogen interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking through unbiased detection of coding and non-coding RNAs, including microbial and viral species.
- Improves predictive confidence for target selection in complex microenvironments.
Screening & Assay Development
- Prepares validated spatial transcriptomic maps for downstream functional screening workflows.
- Standardizes assay outputs with subcellular resolution and quantitative spatial data.
- Enables reproducible detection of diverse RNA species, supporting robust assay development.
- Provides high-content data for reliable compound evaluation in tissue context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial transcriptomic data with translational biomarker strategies in oncology and infectious disease models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by capturing host-pathogen and cell-cell interactions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing tissue-specific transcriptomic signatures.
- Enhances predictive de-risking for late-stage biological risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
Stereo-seq integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, species-agnostic transcriptomic profiling from FFPE tissues, supporting both early discovery and translational research inflection points.
- Discovery Biology: Provides hypothesis testing and pathway clarification through unbiased RNA detection at subcellular resolution.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spatial transcriptomic outputs for assay readiness.
- Analytics: Generates high-content spatial data enabling comparative analysis of cell types and microbial loads.
- Translational Research: Connects spatial transcriptomic signatures to preclinical biomarker validation and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling across diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes spatial transcriptomic workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spatial transcriptomics and FFPE tissue handling.
- Demands advanced imaging, sequencing, and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be needed for fatty or fragile tissues to ensure RNA accessibility and tissue adhesion.
- Careful contamination control is essential to distinguish true tissue signals from environmental artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:58
Stereo-Seq Random Oligonucleotide Capture Chip (N-Chip) Preparation
3:06
Nuclear Imaging and ssDNA Staining of the FFPE Tissue Sections
5:08
Decrosslinking Process of the Stained FFPE Sections
7:43
Collection of the cDNA Release Mix
8:56
Results
9:36
Conclusion
