RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

이 절차의 전반적인 목표는 RNA 염기서열분석 기술을 사용하여 마우스 EML 세포 자가 재생 및 분화의 잠재적인 핵심 조절자를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 표면 마커를 기반으로 계통 음성 CD 34 양성 및 계통 음성 CD 34 음성 EML 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 mRNA를 분리하고, mRNA를 cDNA로 변환하고, 염기서열분석을 위해 라이브러리를 준비하는 것입니다.

다음으로, DNA 라이브러리는 고처리량 염기서열분석을 거칩니다. 마지막 단계는 염기서열분석 결과를 분석하고 차등적으로 발현된 전사 인자를 찾는 것입니다. 궁극적으로, RNA 염기서열분석 기술은 계통 음성 CD 34 양성 및 계통 음성 CD 34 음성 EML 세포에서 차등적으로 발현된 전사 인자를 표시하는 데 사용됩니다.

마이크로레이와 같은 다른 G 발현 프롤렌 방법에 비해 RNA 염기서열분석의 주요 장점은 감도, 정확도 및 동적 범위가 더 높고 기존 유전자 주석 정보에 의존하지 않는다는 것입니다. 이 방법은 세포 자가 재생 및 분화를 조절하는 주요 전사 요인이 무엇인지와 같은 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 혈액 질환 치료로 확장되는데, 이는 조혈 전구 세포를 제어하는 핵심 조절자에 대한 더 나은 이해, 자가 재생 및 분화가 효과적인 치료법의 개발로 이어질 수 있기 때문입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 염기서열분석 분석을 위해 다양한 생물정보학 도구가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 줄기세포 인자 수집을 위한 아기 햄스터 신장 또는 BHK 세포는 25제곱센티미터에 10%FBS를 함유한 dmem 배지, 섭씨 37도의 플라스크 및 5%CO2에서 배양합니다. 세포가 80-90% confluence trypsin eyes에 도달하고 실온에서 5분 동안 200Gs에서 원심분리하여 수집하면 snat를 버리고 10ml의 신선한 BHK 세포 배양 배지에 세포 팔레트를 재현탁합니다.

2ml의 세포 현탁액을 새로운 75제곱센티미터 플라스크 앱으로 옮기고 48ml의 새로운 BHK 세포 배양액을 추가합니다. 플라스크 배양에 매체. 이틀 동안 BHK 세포.

이틀 후, 배양 배지를 수집하여 포인트 45 마이크로미터 필터를 통과시킵니다. 매체를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 마우스 적혈구, 골수성 및 림프구 또는 EML 세포는 섭씨 37도 및 5%CO2에서 BHK 세포 배양 배지를 포함하는 EML 염기성 배지에서 현탁액으로 배양됩니다.

EML 셀을 밀리리터당 600, 000개 미만의 피크 밀도로 낮은 셀 밀도로 유지합니다. 2-3일마다 1-5번의 비율로 세포를 부드럽게 분할하되 10세대 이상 보존하지 않으면 혈통 양성 세포가 고갈됩니다. 200Gs에서 5분 동안 원심분리하여 EML 세포를 수확합니다.

PBS로 세포를 한 번 세척하고 상층액을 버린 후 다시 원심분리합니다. PBS에서 세포를 다시 현탁시키고 혈구 분석기로 세포를 계수합니다. 세포의 수는 후속 단계에서 항체 농도를 결정하는 데 필요합니다.

제조사의 지침에 따라 계통 항체 칵테일과 자기 활성화 세포 분류 시스템을 사용하여 계통 음성 또는 라인 음성 세포를 분리합니다. 이 절차를 시작하려면 5분 동안 200Gs에서 lin 음성 세포를 스핀다운합니다. PBS로 세포 펠릿을 재현탁하고 혈구 분석기로 세포를 계수합니다.

팩스 버퍼로 셀을 두 번 씻습니다. 두 번째 세척 후 200Gs에서 5분 동안 세포를 펠렛화합니다. 5개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 각각 1, 2, 3, 4, 5라는 숫자를 붙입니다.

적절한 양의 facts buffer로 세포를 100마이크로리터당 100만 개의 세포 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 5개의 마이크로 원심분리 튜브 각각에 분취합니다. 1 마이크로 그램의 안티 마우스 CD 34 FE 항체를 튜브 1과 튜브 2에 추가합니다.

튜브를 부드럽게 섞어 모든 튜브를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 25마이크로그램의 PE 접합 항산화체, 1개의 항체 및 20마이크로리터의 PC 접합 계통을 추가합니다. 칵테일 항체를 2 1 개, 25 마이크로 그램의 PE 접합 안티카 1 항체를 튜브 3 및 20 마이크로 리터의 PC 접합 계통에 추가합니다.

튜브 4에 대한 칵테일 항체. 튜브를 부드럽게 섞고 어둠 속에서 추가로 30분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다. 30분 후 모든 튜브에 300마이크로리터의 팩스 버퍼를 추가하고 5분 동안 200Gs에서 셀을 스핀다운합니다.

최종 세척 후 500마이크로리터의 팩스 버퍼로 셀을 세 번 세척합니다. Resus는 각 세포 펠릿을 500 마이크로 리터의 팩스 버퍼에 현탁시키고 형광 활성화 세포 분류에 의해 튜브 1에서 lin negative SCA positive CD 34 positive 및 lin negative SCA negative CD 34 negative cell을 분리합니다. 트리올을 사용하여 lin negative CD 34 positive 및 lin negative CD 34 negative cell에서 total RNA를 추출하고 deoxyribo nuclease one을 사용하여 오염된 DNA를 제거합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 무결성 번호 또는 RIN이 9보다 큰 RNA 샘플만 mRNA 추출 및 후속 라이브러리 구축 절차에 사용되는 제조업체의 지침에 따라 바이오분석기를 사용하여 전체 RNA의 품질을 평가합니다. 이 그림은 RIN이 9.4인 고품질 RNA 샘플의 결과를 보여줍니다. 여기에 사용된 라이브러리 구성 프로토콜은 Illumina RNA 염기서열분석 플랫폼에 특이적이며 RNA 시료 전처리 키트를 활용합니다.

이 비디오에는 선택한 단계만 표시되므로 제조업체에서 제공한 지침을 따릅니다. oligo DT 마그네틱 비드를 사용하여 poly MNA를 긍정적으로 선택하는 것으로 시작합니다. 다음으로, poly mRNA를 단편화하고 무작위 프라이머를 사용하여 역전사를 수행하여 mRNA를 CD NA로 변환합니다. 이어서, 합성된 두 번째 가닥 CD NA를 사용하여 이중 가닥 DNA를 생성합니다.

다음으로, 3개의 프라임 돌출부를 제거하고 5개의 프라임 돌출부를 DNA 중합효소 선좌화로 채웁니다. CD NA 단편에 대한 3개의 프라임 말단은 서로 결찰합니다. 염기서열분석을 위해 multiplex indexing adapter를 double stranded CD NA의 양쪽 끝에 추가합니다.

마지막으로, 분광 광도계를 사용하여 단편에 대한 CD NA의 농축을 위한 PCR을 수행하여 증폭된 DNA의 흡광도 2개 80에 대한 흡광도 2개를 측정합니다. 라이브러리의 농도에 대한 정보를 얻으려면 라이브러리 품질을 평가하고 바이오분석기를 사용하여 DNA 단편의 크기 범위를 측정합니다. RNA 염기서열분석 데이터 분석 방법은 동반 프로토콜인 Text에서 확인할 수 있으며, 다운스트림 분석을 위한 데이터 파일 처리, 새로운 전사체 검출 및 발현 수준 평가, 차등 발현 유전자 검출 및 차등 발현 전사 인자 식별을 포함합니다.

계통 음성 EML 세포를 항 CD 34, 안티카 원 및 계통 칵테일 항체 및 린 음성 두개골 양성 CD 34 양성 및 린 음성 sca로 염색 하였다. Negative CD 34개의 음성 세포는 형광 활성화 세포 분류만을 사용하여 분리되었습니다. SCA 1 및 CD 34 발현 분석을 위해 Lin 음성 세포를 게이트했습니다.

라이브러리 구축이 완료되었을 때 두 개의 EML 세포 집단이 관찰되었습니다. 라이브러리에 있는 DNA 단편의 크기는 바이오분석기를 사용하여 확인하였다. 이 대표적인 데이터는 양질의 라이브러리를 보여주지만 단편 크기는 약 300개의 염기쌍에서 최고조에 달합니다.

D-E-S-E-Q 알고리즘은 전사 인자(transcription factor)가 황산염 측정에 중요하기 때문에 차등적으로 발현된 전사 인자에 초점을 맞춘 차등 발현 분석에 사용되었습니다. lin negative CD 34 positive와 lin negative CD 34 negative 사이에서 1.5배 이상 변하는 전사 인자(transcription factor)가 발견되었으며 이 히트 맵에 표시되어 있습니다. 특히, lin negative CD 34 positive cell에서 TCF seven의 상대적 발현 수준은 lin negative CD 34 negative cells보다 100배 이상 높습니다.

따라서 TCF seven은 EML 세포의 자가 재생 및 분화 조절에서 그 기능을 확인하기 위해 추가 염색질 면역침전 및 염기서열분석 및 기능 테스트를 위해 선택되었습니다. 일단 마스터하면 RNA 라이브러리는 며칠 안에 완료할 수 있으며 개발 후 적절하게 수행하면 전체 절차를 약 한 달 내에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 B 세포 및 악성 B 세포와 같은 다양한 세포 유형과 조직 간의 유전자 발현을 차별화하여 연구하고자 하는 연구자들에게 길을 열었습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 전체 RNA 아픈 절차의 기초이기 때문에 높은 CAR TRNA를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 EML 세포 재생 및 분화를 제어하는 주요 조절 인자를 식별하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.