발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

우리는 분열하는 세포들이 유사분열 과정에서 염색체를 충실히 전달하는 방식을 연구하며, 정확한 염색체 분리를 보장하는 분자 기계와 메커니즘에 초점을 맞춥니다. 세포를 동기화하여 세포 주기에 따라 변화하는 분자 과정을 연구합니다. 이러한 방법이 없으면 주요 변화가 동기화되지 않은 세포 집단 안에 숨겨질 수 있습니다.

다른 동기화 방법과 비교할 때, BAR1 돌연변이체에서의 알파 인자 정지는 더 깨끗하고 가역적인 G1 정지를 제공하여 전체 효모 배양이 주기를 동기화적으로 진행하는 과정을 추적할 수 있게 합니다. 저희 연구는 세포 주기 전반에 걸쳐 단백질의 동적 위치와 활성 변화를 밝혀내어 염색체 분리와 방추체 유지와 같은 주요 유사분열 과정을 밝힙니다. 우선, 효모를 25밀리리터의 YPAD 배지에 접종하고, 하룻밤 배양하여 0.5에서 2.0 사이의 600나노미터 광학 밀도에 도달합니다.

효모 세포를 0.5 광밀도 600나노미터로 희석합니다. 최종 농도는 밀리리터당 1마이크로그램에 도달하기 위해 알파 인자를 추가합니다. 알파 인자 추가 후 2.5시간에서 3.5시간 후, 현미경으로 비출아가 된 슈무드 세포의 비율을 세어 세포 정지 상태를 평가합니다.

그 후 3,000g 원심분리기에서 23도 섭씨에서 3분에서 5분 동안 배양물을 돌립니다. 알파 인자를 제거하기 위해 상정액을 조심스럽게 부어내세요. 세포 펠릿을 1%디메틸 설폭사이드가 포함된 25밀리리터 YPAD에 재현탁하여 세포를 세척합니다.

세포 펠릿을 새 튜브로 옮기고 두 번 더 세척하여 총 세 번의 세척을 통해 남은 알파 인자를 제거합니다. 다음으로 세척된 셀에 YPAD를 추가하여 최종 부피를 25밀리리터로 만들고, 현탁액을 새 플라스크로 옮겨 추가 배양 또는 사용하세요. 방출 직후 0분 시점 샘플을 수집하고 고정하세요.

방출 후 60분에 세포 집단의 동기화를 현미경으로 평가합니다. 원한다면 방출 후 60분 후에 알파 인자를 다시 1 마이크로그램/밀리리터 농도로 추가하여 다음 세포 주기로의 진행을 차단할 수 있습니다. 15분마다, 최대 180분마다 또는 필요한 만큼 시점 샘플을 계속 채취하세요.

효모 세포를 고정하려면 최대 속도로 1밀리리터 배양물을 1분간 원심분리합니다. 상정액을 완전히 흡인하세요. 그 후 500마이크로리터의 고정액에 다시 부유시키고 23도 섭씨에서 2분에서 15분간 배양합니다.

고정된 세포를 원심분리한 후, 상청액을 흡인한 후 pH 6.4에서 0.1몰 인산칼륨 완충제 500마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 영상 촬영 전, 고정된 셀을 최대 속도로 1분간 23도 섭씨에서 원심분리합니다. 상청액을 흡취한 후, 10에서 100마이크로리터의 트리톤, DAPI, 소르비톨 용액에 펠릿을 재현탁합니다.

염색된 셀 현탁액을 약 0.8마이크로리터 피펫으로 깨끗한 커버슬립 중앙에 직접 주입합니다. 피펫 팁을 사용해 방울을 약 1제곱센티미터 크기의 원형 영역으로 부드럽게 펴 펴 놓으세요. 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 올려놓으세요.

킴와이프를 사용해 커버슬립 가장자리를 부드럽게 눌러 샘플을 고르게 뿌리세요. 그 후 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 샘플을 고정하세요. 준비된 슬라이드를 60배 배율, 1.42 수치 구경 오일 이머징 대물렌즈, 빨강, 초록, 파랑, 원빨강 레이저 및 필터 세트가 장착된 현미경에 가져가세요.

현미경을 커버슬립에 붙인 효모 세포에 집중하세요. 초점이 맞춰진 후에는 각 형광 채널의 노출 설정을 최소 3:1의 신호 대 잡음비로 조정합니다. 획득 설정을 조정하여 각 슬라이스를 0.2마이크로미터 간격으로 배치하여 총 2에서 4마이크로미터의 z-깊이를 커버하는 14장에서 20장의 z-스택 이미지를 수집합니다.

후처리 모듈이 장착된 현미경에서는 각 z-스택 이미지에 대해 디컨볼루션과 빠른 투사 옵션을 선택하세요. 샘플의 z-스택을 획득하여 각 실험 조건이나 시점별로 약 100개에서 200개의 효모 세포를 기록할 수 있을 만큼 충분한 이미지를 캡처합니다. 분석을 위해 ImageJ 소프트웨어에서 투사 이미지를 열어보세요.

각 형광 채널의 밝기와 대비를 조절하여 가시성을 높이세요. 세포 주기 진행을 분석하기 위해 각 시점별로 100개의 세포를 세고, 하나 또는 두 개의 핵을 포함하도록 분류합니다. Stu2-GFP 지점을 나타내는 셀의 비율을 계산하려면 모든 이미지에서 녹색 채널 밝기 설정을 표준화하세요.

Stu2-GFP 지점이 Spc110-mCherry 지점과 함께 동위치하는 세포를 키네토코어 위치에서 양성으로 나타냅니다. 다음으로, 단백질 펀크타의 강도를 정량화하기 위해 자유손 선택 도구를 사용해 신호 주변의 관심 영역을 그려보세요. 선택지는 T를 누르거나 ROI 매니저 메뉴에서 선택하여 관심 지역 관리자에 추가하세요.

ROI 매니저에서 측정을 클릭하여 펀크타 강도를 계산하세요. 시간에 따른 변화를 시각화하기 위해, 각 시점별로 평균 강도와 95% 신뢰구간을 그려보세요. 각 질환마다 약 100개의 세포를 세세요.

G1 정지 세포에서 Stu2-GFP는 단일 방추극 근위 지점에 국소화되었으며, 세포질 미세소관을 따라 추가 분산 신호를 보냈다. 방출 60분 후, Stu2-GFP는 Spc110-mCherry가 표시한 중복된 스핀들 폴 옆에 위치한 두 개의 펀크타로 국소화되었습니다. 90분경, 후기 단계에서 Stu2-GFP는 방추극 근처와 단일 축을 아우르는 미세소관 양쪽에서 모두 나타났다.

유사분열 종료 후 120분에 Stu2-GFP가 세포질 내 유상미세관에 다시 나타났습니다. 정량화 결과, 방추분열 극 근처의 Stu2-GFP 강도는 초기 유사분열 동안 증가하여 전기 전에는 최고조에 달하고 이후 감소하는 것으로 나타났습니다. 쌍핵세포의 비율은 약 90분에 정점을 찍었으며, 이는 동기화된 전단계(anaphase) 진입을 나타냈음을 나타낸다.