Name: 교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 학습하세요 Clocks lifeline alignment 방법을 사용하여 세포 주기 동기화 시계열 데이터를 정렬하고 효모와 유동세포측정 데이터를 비교 분석하는 기술을. 이 방법은 전사체 및 단백질 동역학의 상호 실험 비교를 가능하게 합니다.

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S. Campione과 S. Haase는 국립 과학 재단 (DMS-1839288)과 국립 보건원 (5R01GM126555)의 자금 지원을 받았습니다. 또한 저자는 원고에 대한 의견과 프로토콜 베타 테스트에 대해 Huarui Zhou(Duke University)에게 감사를 표합니다. 또한 Java 코드에 도움을 준 Francis Motta(Florida Atlantic University)와 Joshua Robinson에게도 감사드립니다.

교차 실험 비교를 위한 동기화된 시계열 데이터 정렬Alignment of synchronized time-series data for cross-experiments

<ol><li>Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cyclins%3A+Cln3+may+be+an+upstream+activator+of+Cln1%2C+Cln2+and+other+cyclins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins.</a> EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).</li>
<li>Schwob, E., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLB5+and+CLB6%2C+a+new+pair+of+B+cyclins+involved+in+DNA+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).</li>
<li>Polymenis, M., Schmidt, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cell+division+to+cell+growth+by+translational+control+of+the+G1+cyclin+CLN3+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast.</a> Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).</li>
<li>Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+cell+cycle-regulated+genes+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+microarray+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).</li>
<li>Cho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transcriptional+analysis+of+the+mitotic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle.</a> Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).</li>
<li>Bar-Joseph, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+time+series+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Analyzing time series gene expression data.</a> Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).</li>
<li>Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Forkhead+transcription+factor+Hcm1+regulates+chromosome+segregation+genes+and+fills+the+S-phase+gap+in+the+transcriptional+circuitry+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle.</a> Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+control+of+cell-cycle+transcription+by+coupled+CDK+and+network+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators.</a> Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).</li>
<li>Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WHI1%2B+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+tethers+cell+division+to+cell+size+and+is+a+cyclin+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog.</a> EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).</li>
<li>Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+G1+and+G2+by+S-phase+cyclins+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).</li>
<li>Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+model+for+multi-marker+analysis+of+cell+cycle+progression+in+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments.</a> Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+inhibitor+Whi5+records+environmental+information+to+coordinate+growth+and+division+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast.</a> Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).</li>
<li>Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+molecular+noise+and+size+control+on+variability+in+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle.</a> Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+model+for+cell+cycle+distributions+in+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments.</a> Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).</li>
<li>Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+branching+process+model+for+flow+cytometry+and+budding+index+measurements+in+cell+synchrony+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Statistics%22%5BJournal%5D)">A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments.</a> Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).</li>
<li>Duan, F., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+loss+of+cell-cycle+synchrony+in+clustering+analysis+of+microarray+data+using+weights%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights.</a> Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+transcription+dynamics+during+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+and+arrest+of+the+budding+yeast+cell+cycle+using+chemical+and+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Haase, S. B., Reed, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+flow+cytometric+analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle.</a> Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).</li>
<li>Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+conservation+of+the+cell-cycle-regulated+transcriptional+program+in+the+fungal+pathogen%2C+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans.</a> PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).</li>
<li>Kelliher, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layers+of+regulation+of+cell-cycle+gene+expression+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).</li>
<li>Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JTK_CYCLE%3A+An+efficient+nonparametric+algorithm+for+detecting+rhythmic+components+in+genome-scale+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets.</a> Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).</li>
<li>Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+large-scale+biological+rhythm+studies%3A+A+comparison+of+algorithms+for+detecting+periodic+signals+in+biological+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data.</a> Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+oscillator+drives+the+blood+stage+cycle+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Science. 368 (6492), 754-759 (2020).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 논문은 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 실험의 데이터를 보다 정확하고 정량적으로 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 실험을 파라미터화하기 위해 신진 데이터 및 유세포 분석 DNA 함량 데이터와 같은 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하는 베이지안 추론 모델인 CLOCCS에서 학습된 매개변수를 활용합니다(14,15). CLOCCS는 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하여 각 실험에 대한 파라미터를 추론한 다음 공통 라이프라인 척도에 맞추는 데 사용합니다. 여러 동시성/릴리스 시계열 실험을 단일 라이프라인 정렬 시간 척도로 변환하면 이전에는 어렵거나 불가능했던 실험과 여러 반복 실험의 집계 간에 단계별 관련 비교가 가능합니다.
이 프로토콜의 중요한 단계에는 데이터 수집, CLOCCS 실행, 데이터 세트 정렬 및 데이터 세트 간 비교가 포함됩니다. 먼저 이 프로토콜에서...

세포주기가 진행됨에 따라 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 측정은 세포주기 진행을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위한 표준 방법입니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 동시성/릴리스 시계열 실험을 비교하는 기능은 이러한 동적 프로세스를 이해하는 데 매우 중요합니다. 결과를 확증하기 위해 반복 실험을 사용하면 결론의 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 또한 환경 조건, 돌연변이 간, 심지어 종 간의 비교를 통해 세포주기 조절에 대한 많은 새로운 통찰력을 발견 할 수 있습니다. 그러나 동시성으로부터의 회복 및 세포 주기 진행 속도의 실험 간 가변성은 복제물 간 또는 변경된 세포 주기 타이밍이 있는 실험 간에 시점 간 비교를 수행하는 능력을 손상시킵니다. 이러한 문제로 인해, 반복실험은 종종 전체 시계열(예: Spellman et al.4)에 포함되지 않습니다. 전체 시계열의 반복실험이 수집되면 데이터를 집계하여 분석할 수 없고 단일 반복이 분석에 사용되며 다른 반복실험은 종종 보충 수치로 강등됩니다(예: Orlando et al.8). 또한, 상이한 회복 또는 세포주기 진행 특성을 가진 실험 간의 비교는 어렵다. 관심 있는 사건과 세포 주기 랜드마크(예: 새싹 출현, S상 진입 또는 아나페이즈 시작) 사이의 더 작은 간격을 측정하면 이러한 랜드마크 이벤트를 추적하는 경우 오류를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다 1,2,3,9,10,11,12. 그러나 미묘하지만 중요한 차이는 이러한 임시 방법을 사용하여 감지되지 않거나 가려질 수 있습니다. 마지막으로, 단일 세포 분석은 동기화나 정렬에 의존하지 않고 세포 주기 진행을 분석할 수 있지만13, 단일 세포 연구에서 대규모 측정은 어렵고 비용이 많이 들 수 있습니다.
이러한 어려움을 극복하기 위해 우리는 동기화된 집단14,15에 대한 시계열 측정 분석을 돕기 위해 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) 모델을 개발했습니다. CLOCCS는 동기화된 세포가 동기화에서 해제되고 세포 주기를 통해 진행될 때 세포 주기 단계 전반에 걸쳐 동기화된 세포의 분포를 설명하는 유연한 수학적 모델입니다. 분지 과정 프레임워크를 통해 모델은 S. cerevisiae에서 관찰된 바와 같이 분열 후 모녀 세포의 비대칭 특성을 설명할 수 있으며 S. pombe와 같이 핵분열로 분열하는 유기체에 여전히 유용합니다. 이 모델은 다양한 측정 유형 세트에서 입력을 받아 셀 주기 단계를 지정할 수 있습니다. 그것은 시간 경과에 따른 발아 세포의 백분율 측정을 포함하는 발아 세포주기 단계 데이터를 수집 할 수 있으며, 발아되지 않은 G1 단계14,15 외부의 세포 수를 추정 할 수 있습니다. 이 모델은 또한 DNA 함량을 측정하는 유세포 분석 데이터를 수집할 수 있으므로 G1에서 S로, S에서 G2로, M에서 G1로 획기적인 전이를 평가할 수 있습니다15. 형광 형태학적 마커는 또한 세포 주기 단계를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 미오신 고리, 핵 및 방추극체(SPB)의 형광 표지는 세포 주기 단계를 결정하는 데 사용할 수 있으며 이들은 CLOCCS 모델11에 통합되었습니다. 그러나 이러한 측정은 이 프로토콜에서 설명되지 않습니다. 또한, septation index는 S. pombe14의 모델링 데이터를 위한 입력으로 사용되었습니다. 따라서 이 모델은 다양한 유기체의 세포 주기 분석에 사용할 수 있으며 추가로 확장할 수 있습니다.
CLOCCS는 입력 데이터에서 여러 매개변수(예: 신진 비율, DNA 함량)의 전체 베이지안 추론을 허용하는 매개변수 모델입니다. 이러한 매개변수에는 동기화로부터의 회복 시간, 세포 주기 기간의 길이(모녀 세포에 대해 별도로 추정됨) 및 각 시점에서 세포의 평균 세포 주기 위치가 포함됩니다. 이러한 매개변수는 모집단에서 평균 세포의 행동을 나타내므로 연구자는 각 시점을 생명선 지점으로 표현된 세포 주기 위치에 매핑할 수 있습니다. 라이프라인 포인트로의 변환은 CLOCCS 매개변수 lambda(λ) 및 mu0(μ0)14,15에 따라 달라집니다. 파라미터 λ는 모세포의 평균 세포 주기 주기에 상응한다. 그러나, 모녀 지연(14,15)으로 인해, 이것은 모녀 세포 모두를 포함하는 전체 집단의 평균 세포주기 기간이 아니다. CLOCCS는 모녀 지연에 해당하는 매개변수 델타(δ)를 추가로 추론하므로 전체 집단의 평균 세포 주기 기간을 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 각 실험은 셀 주기 동기화에서 해제된 후에 시작되기 때문에 동기화 방법에서 복구하는 데 필요한 시간은 CLOCCS 매개 변수μ 0으로 표시됩니다. CLOCCS는 입력 셀 사이클 위상 데이터에 모델을 피팅한 다음 랜덤 워크 마르코프 체인 몬테카를로 알고리즘14,15를 사용하여 이러한 매개변수를 추론합니다. 여러 실험을 공통 세포 주기 수명 주기 시간 척도에 매핑함으로써 회복 시간 또는 세포 주기 기간이 동일하지 않은 복제 또는 실험 간에 직접적인 단계별 비교를 수행할 수 있습니다 8,14,15.
동기화된 모집단이 시계열14,15,16,17 동안 어느 정도 동기화성을 잃기 때문에 동기화 손실률의 변동성은 실험 전반에 걸친 정량적 비교를 방해할 수도 있습니다. CLOCCS는 모집단의 위치와 분포의 분산을 식별하여 동시성 손실률의 차이를 설명합니다. 이 강력한 도구는 실험 전반에 걸쳐 구체적이고 상세한 비교를 가능하게 하여 복제물 간뿐만 아니라 환경 조건, 돌연변이 및 심지어 세포 주기 타이밍이 크게 다른 종 간에도 관련 비교를 직접 수행할 수 있는 기능을 제공합니다14,15.
이 논문에서는 CLOCCS를 사용하여 동기/릴리스 시계열 실험의 데이터를 피팅하여 매개변수를 추정하고, 데이터를 공통 라이프라인 척도에 매핑한 다음, 반복 또는 실험 간에 관련 비교를 수행하는 방법을 설명합니다. 라이프라인 정렬을 통해 이러한 실험에서 직접 상별 비교가 가능하므로 복제물의 집계 및 비교가 가능하며 회복 타이밍 및 세포 주기 기간이 다른 실험 간에 보다 관련성 높은 비교를 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr>고착 용액용 <td>PBS</td><td></td><td></td> 2개<td>. Leman 2014에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>정착 해결책을 위한</td> <td>4% 포름알데히드</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>100% 에탄올</td><td></td><td></td><td>유세포 분석 고정용. Haase 2002에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>CLOCCS</td><td></td><td></td><td>https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git</td></tr><tr><td>유세포</td><td></td><td></td><td>분석기 유세포 분석 프로토콜용.</td></tr><tr><td>Git</td><td></td><td></td><td>https://git-scm.com/</td></tr> <tr><td>Java 19</td><td></td><td></td><td>https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19</td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td>세포와 새싹을 세는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Miniconda</td><td></td><td></td><td>https://docs.conda.io/en/latest/</td></tr> <tr><td>프로테아제 솔루션</td><td></td><td></td><td>유세포 분석 프로토콜용. Haase 2002에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>RNAse: 유</td>세포 분석 프로토콜용 솔루션<td></td><td></td><td>. Haase 2002에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>유세포 분석용 염색. Haase 2002에 설명되어 있습니다.</td></tr><tr><td>트리스</td><td></td><td></td><td>pH 7.5</td></tr></tbody></table>

교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬

Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons

세포 주기를 조사하는 것은 종종 세포가 세포 주기를 통과할 때 시계열로 다양한 매개변수를 측정하기 위해 세포 집단을 동기화하는 데 달려 있습니다. 그러나 유사한 조건에서도 반복 실험은 동기화에서 회복하고 세포 주기를 통과하는 데 필요한 시간의 차이를 나타내므로 각 시점에서 직접적인 비교가 불가능합니다. 실험 전반에 걸쳐 동적 측정을 비교하는 문제는 돌연변이 집단 또는 동기 회복 시간 및/또는 세포 주기 기간에 영향을 미치는 대체 성장 조건에서 악화됩니다. 
우리는 이전에 세포의 동기 집단이 동기화에서 방출되고 세포 주기를 통해 진행되는 방식을 모니터링하는 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony)라는 파라메트릭 수학적 모델을 발표했습니다. 그런 다음 모델에서 학습된 매개 변수를 사용하여 동기화된 시계열 실험의 실험 시점을 정규화된 시간 척도(라이프라인 포인트)로 변환할 수 있습니다. lifeline scale은 실험 시작부터 경과 시간을 분 단위로 나타내는 대신 동기에서 세포 주기 진입까지의 진행을 나타내며 그 다음에는 세포 주기의 단계를 거칩니다. 라이프라인 포인트는 동기화된 모집단 내의 평균 세포 위상에 해당하기 때문에 이 정규화된 시간 척도를 통해 다양한 기간과 회복 시간을 가진 실험을 포함하여 실험 간에 직접 비교할 수 있습니다. 또한, 이 모델은 서로 다른 종(예: Saccharomyces cerevisiae 및 Schizosaccharomyces pombe) 간의 세포 주기 실험을 정렬하는 데 사용되어 세포 주기 측정을 직접 비교할 수 있어 진화적 유사점과 차이점을 밝힐 수 있습니다.

위의 프로토콜과 그림 1 의 워크플로우에 설명된 단계를 5개의 세포 주기 동기화 시계열 실험에 적용하여 서로 다른 동기화 방법(짝짓기 페로몬 및 원심 용출18)을 사용한 복제물과 염기서열 분석 플랫폼(RNA 시퀀싱[RNA-seq] 및 마이크로어레이) 간의 두 가지 대표적인 비교를 입증했습니다. S. cerevisiae를 사용하여 여러 실험을 수행하고, 각 실험에 대해 세포 주기 단계 및 실험 데이터를 수집하였다. 워크플로에는 CLOCCS를 사용하여 다양한 동기화/릴리스 시계열 실험을 매개 변수화하고, 이러한 매개 변수를 사용하여 실험을 일반적인 비교 가능한 라이프라인 척도에 맞춘 다음, 두 가지 대표 비교에 이러한 정렬된 실험을 사용하는 작업이 포함됩니다.
반복실험 전반에 걸친 대표적인 비교를 입증하기 위해 동일한 균주와 동일한 실험 조건에서 수행된 세 가지 실험(조건...

동기화된 시계열 실험 분석의 한 가지 과제는 실험이 종종 동기 및 세포 주기 기간으로부터의 회복 기간이 다르다는 것입니다. 따라서 서로 다른 실험의 측정값을 집계하여 분석하거나 쉽게 비교할 수 없습니다. 여기에서는 단계별 비교가 가능하도록 실험을 정렬하는 방법을 설명합니다.

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell ...

시계열 실험 분석의 주요 과제는 동기 및 세포주기 기간으로부터의 회복 기간이 종종 다르다는 것입니다. 따라서 서로 다른 실험의 측정값을 정렬 없이 집합적으로 쉽게 비교하거나 분석할 수 없습니다. 시계 라이프라인 정렬은 실험 간의 단계별 및 생물학적으로 관련된 비교와 이전에는 어렵거나 불가능했던 여러 반복 실험을 집계하는 방법입니다.이전에는 획기적인 사건을 추적하여 단계별 및 생물학적으로 관련된 비교가 이루어졌습니다. 그러나 이러한 임시 방법을 사용하면 미묘하지만 중요한 차이가 감지되지 않습니다. 시계열 실험 간의 비교는 동기화 회복 시간 또는 세포 주기 기간에 영향을 미치는 돌연변이 집단 또는 성장 조건과 같이 타이밍에 상당한 차이가 있는 실험 간에 특히 어렵습니다.클럭 라이프라인 정렬을 통해 이러한 경우 위상별 비교가 가능합니다. 우리는 시계를 사용하여 시계열 전사체 및 단백질체 데이터를 정렬하여 mRNA와 해당 단백질의 역학을 직접 비교할 수 있었습니다. 또한, 우리는 다양한 종에 걸친 시계열 실험을 정렬하여 세포 주기 진화 변화에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

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Biology

생물학

박테리아 세포의 동기화는 박테리아 세포주기와 발달에 대한 연구에 필수적입니다.  Caulobacter crescentus는 밀도 원심분리를 통해 동기화가 가능하여 박테리아 세포주기 연구를 위한 빠르고 강력한 도구를 제공합니다.  여기에서는 Caulobacter 세포의 동기화를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

의 동기화<em&gt; Caulobacter Crescentus</em&gt; 세균 세포주기의 조사에 대한

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

분석 초원 심 분리기 (AUC)은 샘플 셀이 샘플과 참조 버퍼와 실험을하는 동안을 보유하고 있으며 고진공 및 60,000 RPM으로 로터 속도 최대 노출됩니다. 이 동영상은 AUC 실험이 매우 중요한 구성 요소의 조립, 로딩 및 정렬에 필요한 세부 사항에 대한 엄격한 관심을 입증합니다.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

이노시톨 pyrophosphates 인간 pathologies에 중요한 역할 등 암, 당뇨병과 비만을 재생할 수 있지만, 행동의 정확한 메커니즘은 분쟁의 문제입니다. 상용 이노시톨 pyrophosphates의 부족 상세한 연구는 렌더링 문제. 여기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램을 생산하고 격리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

자궁 수축은 여성의 복지에 중요합니다. 그러나 병리학적으로 수축성이 증가하면 월경불순, 특히 젊은 여성에게 발생할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 월경경 치료에 사용될 수 있는 평활근 이완제의 효능의 빠른 평가를 허용하는 간단한 생체 내 준비를 기술한다.

마우스 생식 기관 자발적 운동성 및 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 자궁 운동 추적 알고리즘을 평가하기 위한 Ex Vivo 방법

학습하세요 Clocks lifeline alignment 방법을 사용하여 세포 주기 동기화 시계열 데이터를 정렬하고 효모와 유동세포측정 데이터를 비교 분석하는 기술을. 이 방법은 전사체 및 단백질 동역학의 상호 실험 비교를 가능하게 합니다.

교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬

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