버딩 효모에 Replicative 수명 측정

싹트는 효모 Croce Visi는 노화의 생물학을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이 기사에서는 효모 세포의 복제 수명을 측정하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 생화학과 브라이언 케네디 연구실의 크리스틴 스테픈입니다.

오늘은 효모 모세포의 복제 수명을 측정하는 절차를 소개해 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 효모 세포의 수명에 영향을 미치는 유전자를 연구합니다. 시작하겠습니다.

복제 수명 실험과 수명 분석을 위한 효모 세포 준비를 위해서는 이를 위해 고체 YEPD 플레이트를 준비해야 합니다. 적절한 멸균 기술을 사용하여 이러한 YEPD 한천 플레이트를 준비하십시오. 수명 실험에서 분석할 4-5개의 균주마다 최소 2개의 플레이트를 준비합니다.

이 플레이트는 수명 실험 최소 2일 전에 준비해야 하며 수명 분석을 시작하기 전에 건조해야 합니다. 플레이트를 붓은 후 4-5일 이내에 실험이 이루어지지 않으면 파라 필름이나 플라스틱으로 싸서 냉장 인큐베이터에 넣어 건조를 방지해야 합니다. 얼어붙은 주식에서 효모 균주를 제거하고 단일 군체를 위한 줄무늬를 만듭니다.

YEPD 한천 플레이트에. 플레이트를 동일한 크기의 파이 모양의 쐐기로 분할하여 동일한 YEPD 플레이트에 최대 6개의 균주를 쉽게 줄무늬를 만들 수 있습니다. 세포를 섭씨 30도에서 이틀 동안 배양합니다.

배양 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 단일 콜로니의 세포를 새로운 YEPD 플레이트에 패치합니다. 이때, 복제수명 실험이 블라인드로 수행될 수 있도록 분석할 균주를 코팅해야 합니다. 해부기가 개별 균주의 정체를 알지 못하는 경우. 체인.

다음으로, 패치된 코팅된 세포를 다음 저녁까지 섭씨 30도에서 배양합니다. 세포를 제거하고 코팅된 각 균주의 세포를 새 YEPD 플레이트에 가볍게 패치합니다. 이것들은 복제 수명에 사용되는 실험용 플레이트로 사용될 것입니다.

분석 셀은 YEPD 플레이트의 왼쪽에 있는 수직선을 따라 패치해야 합니다. 하나의 새로운 YEPD 플레이트에 너무 많은 세포를 옮기지 마십시오. 이것은 하룻밤 배양 동안 세포의 두꺼운 성장을 유발하고 복제 수명에 영향을 미치기 때문에 플레이트당 약 3-5개의 패치가 최적입니다.

각 패치에서 20개의 세포에 대해 복제 수명 분석이 수행된다고 가정하면 이제 수명 실험이 모두 설정되었으며 벤치 탑에서 하룻밤 동안 배양하기만 하면 됩니다. 그리고 내일 우리는 마이크로 해부를 시작하여 효모 세포를 플레이트에 배치하고 처녀 딸 세포를 얻을 수 있습니다. 복제 수명 분석용.

효모에 적합한 미세 해부 장치가 장착된 현미경을 사용하십시오. 첫 번째 패치 균주로부터 약 50개의 세포를 패치된 세포의 원위부 플레이트의 위치로 이동시킵니다. 현미경 스테이지의 등급이 매겨진 경우, 이러한 그라데이션을 사용하여 후속 반복 작업 중에 세포를 쉽게 찾을 수 있습니다.

때때로 세포가 바늘에 끼일 수 있는데, 이는 잘못된 시간에 나오면 문제가 될 수 있습니다. 바늘이 깨끗하고 세포가 없는지 확인하려면 한천 표면에 반복적으로 만지십시오. 그런 다음 한천 표면을 통해 바늘을 밀어 한천에 구멍을 만듭니다.

이 구멍은 해부 및 점 세포 제거의 후속 반복 동안 플레이트에서 방향을 잡는 마커 역할을 합니다. 구멍에 효모 세포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 자라서 구멍 바로 위에 군체를 형성합니다. 개별 효모 세포를 20개의 균일한 간격으로 정렬하고 각 세포 위치 사이에 1-3개의 바늘 직경을 갖습니다.

몇 개의 셀마다 두 개의 셀을 하나가 아닌 줄의 동일한 위치에 나란히 놓습니다. 이것은 virgin daughter cell 선택 중에 중복을 허용합니다. 옮겨진 셀 중 하나가 라인의 10번째와 11번째 위치 사이에서 분할되지 않으면 한천에 7-8개의 수평 직렬 구멍을 만듭니다.

이것은 후속 해부 및 딸 세포 제거 중에 플레이트에서 방향을 잡는 마커 역할을 합니다. 다시 말하지만, 구멍에 효모 세포가 들어가지 않도록 주의해야 하며, 그렇지 않으면 효모 세포가 자라서 군체를 형성할 것입니다. 플레이트의 각 패치에 대해 이 절차를 반복하여 동일한 축을 따라 셀을 수직으로 계속 배열합니다.

AER에서 구멍을 만들 때 생성된 구멍의 수가 패치 번호와 일치하도록 하여 첫 번째 패치에 대해 하나의 구멍이 있고 두 번째 패치에 대해 두 개의 구멍이 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 각 패치에 세포가 배열되면 플레이트를 파라몰딩하고 약 2시간 동안 섭씨 30도에서 배양합니다. 이 시점부터 해부를 받을 때를 제외한 모든 판은 파라 필름으로 촬영되어야 한다는 것을 기억하십시오.

건조를 방지하려면 각 플레이트에 대해 이 절차를 반복하십시오. 실험에서. 수명 분석을 위해서는 각 세포가 처녀 딸 세포로 시작하는지 확인하는 것이 중요합니다.

이를 위해 먼저 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 대부분의 어레이 셀이 세포 분열을 거쳤는지 확인합니다. 여기 있는 것은 이전에 정렬된 세포들인데, 인큐베이터에서 2시간 후에 분열하기 시작한 것을 볼 수 있습니다. 그리고 이제 우리는 모세포, 즉 몸에 붙어 있는 더 큰 세포인 처녀딸세포를 가지고 있으며, 그 처녀딸세포는 수명을 시작하는 데 사용될 세포입니다.

세포 분열을 완료하는 데 추가 시간이 필요한 경우 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 첫 번째 배열 셀부터 시작합니다. 바늘을 사용하여 부착된 세포 위에 바늘을 부드럽게 올려 놓아 모세포에서 딸 세포를 분리합니다.

바늘이 세포에 놓여 있는 동안 현미경 베이스의 측면을 두드리는 것이 때때로 도움이 됩니다. 다음으로, 분리된 딸 세포를 세포의 수직 라인에 배치하여 모 세포와 추가 딸 세포를 교체하고 일시적으로 옆으로 이동시킵니다. 각 배열 셀에 대해 이 단계를 반복합니다.

셀이 분열하지 않으면 테스트 셀 옆에 위치한 중복 셀 중 하나에서 딸 셀을 가져옵니다. 완료되면 수명 플레이트에 수직으로 정렬된 각 패치에 대해 20개의 딸 세포가 있어야 합니다. 모든 모세포와 여분의 딸세포를 한 무더기로 모아 무덤이라고 불리는 패치 근처의 영역으로 다시 옮깁니다.

수명 분석을 받는 세포에서 원치 않는 세포를 멀리 떨어뜨려 미세 군집의 형성과 국소 영양소의 고갈을 방지하는 것이 중요합니다. 세포가 분리되면 플레이트에서 파라를 추출하고 약 2시간 동안 섭씨 30도에서 배양합니다. 실험의 각 플레이트에 대해 이 단계를 반복합니다.

개별 세포의 복제 능력을 측정하려면 수명 데이터 시트를 준비해야 합니다. 수명 데이터 시트는 각 행이 개별 모세포에 해당하고 각 열은 연령 포인트에 해당하는 간단한 그리드일 수 있습니다. 분석할 균주의 수에 따라 각 데이터 시트에 레이블을 지정해야 합니다.

먼저 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 대부분의 어레이 세포가 하나 이상의 세포 분열을 거쳤는지 확인합니다. 세포 분열을 완료하는 데 추가 시간이 필요한 경우 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 첫 번째 플레이트의 첫 번째 어레이 셀부터 시작하여 엄마와 딸, 세포 또는 세포를 육안으로 관찰하여 발생한 세포 분열의 수를 확인합니다.

일반적으로 세포 배열의 특징적인 패턴에 기초하여 어머니가 얼마나 많은 딸 세포를 생산했는지 결정하는 것은 쉽습니다. 이것은 얼마나 많은 세포를 생산했는지 확인하는 것이 정말 간단합니다 왜냐하면 거기에 두 개의 세포가 있고 같은 크기이고 둘 다 어머니보다 작기 때문입니다. 모 세포가 생산하는 딸 세포의 수를 수명 점수 시트의 해당 상자에 기록하십시오.

다음으로, 바늘이 세포에 놓여 있는 동안 바늘을 부착된 세포 위에 부드럽게 놓고 현미경 베이스의 측면을 두드려 앞에서 설명한 대로 바늘을 사용하여 모 세포에서 딸 세포를 분리합니다. 모세포를 수직선의 위치에 유지하고 딸세포를 일시적으로 옆으로 이동시킵니다. 각 배열 셀에 대해 이 단계를 반복합니다.

마지막으로 버려진 딸 세포를 모두 모아 원래 패치 근처에 있는 묘지로 이동합니다. 파라는 플레이트를 필름으로 촬영하고 섭씨 30도에서 2-3시간 동안 배양합니다. 딸 세포를 버리고 배양하는 것을 반복합니다.

실험의 각 플레이트에 대한 단계. 모든 모세포가 분열을 멈출 때까지 이 전체 절차를 반복합니다. 모 세포가 노화됨에 따라 세포주기 진행이 느려지고 나중에 나이 포인트 사이에 더 오랜 기간 동안 플레이트를 배양하는 것이 바람직할 것이며, 플레이트는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배치 될 수 있습니다.

복제 수명 실험에 의해 생성된 원시 데이터는 각 연령 지점에서 각 모 세포가 생성한 딸 세포에 해당하는 숫자 목록입니다. 여기에서 볼 수 있듯이. 점수 시트의 각 행을 합산하여 각 모세포의 복제 수명을 구합니다.

동일한 실험 그룹의 다른 세포의 데이터를 풀링하여 생존 곡선을 생성하고 통계적 계산을 수행할 수 있습니다. 곡선은 Gomperts Mac am kinetics와 대략 일치해야 하며, 초기 사망률이 낮은 시그모이드 모양을 보이며, 그 다음에는 상대적으로 급격한 생존율 감소와 후기 연령에서 곡선이 평평해집니다. 지금까지 효모 복제 수명 실험을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 세포는 추위가 아닐 때마다 계속 분열한다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 따라서 아침에 셀 수 없을 정도로 많은 딸 세포가 생기지 않도록 밤새 플레이트를 4도에 두는 것을 잊지 마십시오. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.