버딩 효모에 Replicative 수명 측정

출아 효모 Croce Visi는 노화 생물학 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 본 논문에서는 효모 모세포의 복제 수명을 측정하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 안녕하세요, 저는 워싱턴 대학교 생화학과의 Brian Kennedy 연구실 소속 Kristen Steffen입니다.

오늘은 효모 모세포의 복제 수명을 측정하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 효모 세포의 수명에 영향을 미치는 유전자를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.

복제 수명 실험 및 수명 분석을 위한 효모 세포 준비를 위해, 이를 수행할 고체 YEPD 플레이트를 준비해야 합니다. 적절한 무균 조작법을 사용하여 이 YEPD 한천 플레이트를 준비하십시오. 수명 실험에서 분석할 4~5개 균주마다 최소 2개의 플레이트를 준비하십시오.

이 플레이트들은 수명 실험 최소 2일 전에 준비해야 하며, 수명 분석을 시작하기 전에 완전히 건조시켜야 합니다. 플레이트를 부은 후 4~5일 이내에 실험을 진행하지 않을 경우, 건조를 방지하기 위해 파라필름이나 비닐로 감싸 냉장 인큐베이터에 보관해야 합니다. 냉동 보관된 효모 균주를 꺼내 단일 콜로니가 형성되도록 스트리킹합니다.

YEPD 한천 배지 플레이트에 도말합니다. 플레이트를 동일한 크기의 부채꼴 모양으로 분할하여 하나의 YEPD 플레이트에 최대 6종의 균주를 쉽게 도말할 수 있습니다. 세포를 30 °C에서 이틀 동안 배양합니다.

배양 후, 인큐베이터에서 세포를 꺼내 단일 콜로니의 세포를 새로운 YEPD 플레이트에 패치합니다. 이때 분석 대상 균주들을 코팅하여 복제 수명 실험이 블라인드로 수행되도록 해야 합니다. 즉, 분석자가 개별 균주의 정체를 알 수 없도록 합니다.

다음으로, 패치 처리된 코팅 세포를 다음 날 저녁까지 30 °C에서 배양합니다. 세포를 꺼내어 각 코팅 균주로부터 새로운 YEPD 플레이트에 세포를 가볍게 패치합니다. 이 플레이트들은 복제 수명 측정을 위한 실험 플레이트로 사용됩니다.

분석 세포들은 YEPD 플레이트의 왼쪽 가장자리를 따라 수직선으로 패치해야 합니다. 하나의 신선한 YEPD 플레이트에 너무 많은 세포를 옮기지 마십시오. 이는 하룻밤 배양하는 동안 세포가 너무 두껍게 성장하게 하여 복제 수명에 영향을 줄 수 있으므로, 플레이트당 약 3~5개의 패치를 만드는 것이 최적입니다.

각 패치당 20개의 세포에 대해 복제 수명 분석을 수행한다고 가정하면, 이제 수명 실험 설정이 모두 완료되었으며 벤치 탑에서 하룻밤 동안 배양하기만 하면 됩니다. 그 후 내일부터 플레이트 위에 효모 세포를 배치하고 복제 수명 분석을 위한 처녀 딸세포를 얻기 위해 미세 절단을 시작할 수 있습니다.

효모에 적합한 미세 해부 장치가 장착된 현미경을 사용하십시오. 첫 번째 패치 균주에서 약 50개의 세포를 패치된 세포로부터 떨어진 플레이트 상의 위치로 옮깁니다. 현미경 스테이지에 눈금이 있는 경우, 이 눈금을 사용하여 이후 반복 과정에서 세포를 쉽게 찾을 수 있도록 할 수 있습니다.

때때로 세포가 바늘에 달라붙을 수 있으며, 이는 세포가 부적절한 시점에 배출될 경우 문제가 될 수 있습니다. 바늘이 깨끗하고 세포가 없는 상태인지 확인하려면, 바늘을 한천 표면에 반복적으로 접촉시키십시오. 그 다음, 바늘을 한천 표면으로 강하게 밀어 넣어 한천에 구멍을 만드십시오.

이 구멍은 이후의 박리 및 도터 세포 제거 반복 과정에서 플레이트 상의 방향을 잡기 위한 표식 역할을 합니다. 구멍 안에 효모 세포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 세포가 성장하여 구멍 바로 위에 콜로니를 형성하게 됩니다. 개별 효모 세포를 수직으로 정렬하여 각 세포 위치 사이에 바늘 지름의 1~3배 간격을 두고 20개의 위치에 균등하게 배치하십시오.

몇 개의 세포마다 하나가 아닌 두 개의 세포를 라인의 동일한 위치에 나란히 배치하십시오. 이는 처녀 딸세포(virgin daughter cell) 선택 과정에서 중복성을 확보하기 위함입니다. 전이된 세포 중 하나가 라인의 10번째와 11번째 위치 사이에서 분열하지 않을 경우, 한천(agar)에 7~8개의 구멍을 가로 방향으로 연속하여 만드십시오.

이는 이후의 해부 및 딸세포 제거 과정에서 플레이트 상의 방향을 잡기 위한 표식 역할을 합니다. 다시 한번, 구멍 안에 효모 세포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 세포가 들어가면 증식하여 콜로니를 형성하게 됩니다. 플레이트의 각 패치에 대해 이 절차를 반복하여, 동일한 축을 따라 세포들을 계속해서 수직으로 배열하십시오.

AER에 구멍을 낼 때, 첫 번째 패치에는 한 개의 구멍을, 두 번째 패치에는 두 개의 구멍을 내는 것과 같이 생성하는 구멍의 수가 패치 번호와 일치하도록 하는 것이 중요합니다. 각 패치에 대해 세포 배열을 완료한 후, 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 30 °C에서 약 2시간 동안 배양하십시오. 이 시점부터는 해부 과정을 제외하고 모든 플레이트를 파라필름으로 밀봉해야 함을 유념하십시오.

건조를 방지하기 위해 각 플레이트마다 이 절차를 반복하십시오. 실험에서 수명 분석을 위해서는 각 세포가 처녀 딸세포로 시작하는지 확인하는 것이 중요합니다.

이를 위해 먼저 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 어레이 세포의 대부분이 세포 분열을 거쳤는지 확인합니다. 여기에 준비된 것은 이전에 정렬된 세포들이며, 인큐베이터에서 2시간이 지난 후 분열이 시작된 것을 볼 수 있습니다. 이제 몸체에 붙어 있는 더 큰 모세포와 처녀 딸세포가 생성되었으며, 이 처녀 딸세포가 수명 측정의 시작점으로 사용될 세포입니다.

세포 분열이 완료될 때까지 추가 시간이 필요한 경우, 플레이트를 배양기로 다시 옮깁니다. 첫 번째 어레이 세포부터 시작하여, 부착된 세포 위에 바늘을 살짝 올려 모세포로부터 딸세포를 분리합니다.

바늘이 세포 위에 놓여 있을 때 현미경 베이스의 측면을 가볍게 두드리는 것이 도움이 될 때가 있습니다. 다음으로 분리된 딸세포를 모세포가 있던 수직 세포 배열의 위치에 배치하고, 기존의 모세포와 추가적인 딸세포들은 일시적으로 옆으로 이동시킵니다. 배열 내의 각 세포에 대해 이 단계들을 반복하십시오.

세포 분열에 실패한 경우, 테스트 세포 옆에 위치한 여분 세포 중 하나에서 딸세포를 가져오십시오. 작업이 완료되면 수명 측정 플레이트의 각 패치당 수직으로 정렬된 20개의 딸세포가 확보되어야 합니다. 모든 모세포와 추가 딸세포를 한곳에 모아 패치 근처의 graveyard라고 불리는 구역으로 옮기십시오.

마이크로 콜로니의 형성과 국소 영양분의 고갈을 방지하기 위해, 수명 분석 대상 세포로부터 원치 않는 세포들을 멀리 떨어뜨려 유지하는 것이 중요합니다. 세포가 분리되면 플레이트를 제거하고 약 30 °C에서 두 시간 동안 배양하십시오. 실험에 사용되는 각 플레이트에 대해 이 단계를 반복하십시오.

개별 세포의 복제 능력을 측정하려면 수명 데이터 시트를 준비해야 합니다. 수명 데이터 시트는 각 행이 개별 모세포에 해당하고 각 열이 연령 지점에 해당하는 간단한 그리드 형태일 수 있습니다. 분석할 균주 수에 맞춰 각 데이터 시트에 라벨을 붙이십시오.

먼저 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 대부분의 어레이 세포가 적어도 한 번의 세포 분열을 거쳤는지 확인하십시오. 세포 분열이 완료되기 위해 추가 시간이 필요한 경우, 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣으십시오. 첫 번째 플레이트의 첫 번째 어레이 세포부터 시작하여, 모세포와 딸세포(들)를 시각적으로 관찰하여 발생한 세포 분열 횟수를 결정하십시오.

세포 배열의 특징적인 패턴을 바탕으로 모세포가 생성한 딸세포의 수를 결정하는 것은 일반적으로 쉽습니다. 이 경우에는 두 개의 세포가 있으며 크기가 동일하고 둘 다 모세포보다 작기 때문에 생성된 세포 수를 매우 쉽게 확인할 수 있습니다. 수명 기록지의 적절한 칸에 모세포가 생성한 딸세포의 수를 기록하십시오.

다음으로, 이전에 설명한 대로 바늘을 부착된 세포 위에 살짝 올려놓고 바늘이 세포에 닿아 있는 상태에서 현미경 베이스의 측면을 가볍게 두드려 모세포에서 딸세포를 분리합니다. 모세포는 수직선상의 원래 위치에 유지하고, 분리된 딸세포는 일시적으로 옆으로 옮깁니다. 어레이의 각 세포에 대해 이 단계를 반복합니다.

마지막으로 폐기된 모든 딸세포를 수집하여 원래 패치 근처에 위치한 graveyard로 옮깁니다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 30 °C에서 2~3시간 동안 배양합니다. 딸세포 폐기와 배양 과정을 반복합니다.

실험의 각 플레이트별 단계입니다. 모든 모세포가 분열을 멈출 때까지 이 전체 과정을 반복하십시오. 모세포가 노화됨에 따라 세포 주기 진행 속도가 느려지므로, 이후 연령 지점 사이에는 플레이트를 더 오랜 시간 동안 배양하는 것이 바람직하며, 플레이트를 4 °C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.

복제 수명 실험을 통해 생성된 원시 데이터는 각 연령 지점마다 각 모세포에서 생성된 딸세포의 수에 해당하는 숫자 목록입니다. 여기에서 보는 바와 같이, 기록지의 각 행을 합산하여 각 모세포의 복제 수명을 구할 수 있습니다.

동일한 실험군 내 다른 세포들의 데이터를 통합하여 생존 곡선을 생성하고 통계 계산을 수행할 수 있습니다. 곡선은 대략적으로 Gompertz-Makeam 역학(kinetics)과 일치해야 하며, 초기 사망률이 낮고 이후 생존율이 상대적으로 빠르게 감소하다가 고령에서 곡선이 평탄해지는 시그모이드(sigmoidal) 형태를 나타내야 합니다. 지금까지 효모 복제 수명 실험을 수행하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포는 저온 상태가 아닐 때 계속해서 분열한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 다음 날 아침에 계수해야 할 딸세포가 너무 많아지지 않도록 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 이것으로 모두 끝났습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.