혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

우리는 혈전증의 생체역학적 특성을 적절히 포착하고 인간의 전혈전 이상도 감지할 수 있는 새로운 방법을 개발했습니다. 먼저, 실리콘 웨이퍼를 사용해 설계에 따라 표준 포토리소그래피를 통해 SU8 포토레지스트 마스터 몰드를 제작하고, 마스터 몰드를 15센티미터 페트리 접시 바닥에 테이프로 고정하세요. 폴리디메틸실록산(PDMS) 혼합물은 실리콘 엘라스토머 키트의 프리폴리머 베이스와 경화제를 10:1 무게 비율로 혼합하여 준비합니다.

PDMS 혼합물을 마스터 몰드에 부어주세요. 그 다음 PDMS 혼합물이 담긴 플레이트를 진공 건조기에 넣어 기소 제거합니다. PDMS 혼합물을 75도(섭씨)로 설정한 인큐베이터에 2시간 동안 열로 경화합니다.

샘플을 인큐베이터에서 꺼낸 후, 마스터 몰드에서 경화된 PDMS를 조심스럽게 절단하여 경화된 PDMS를 개별 칩 단위로 분할합니다. 프로브 바늘을 사용해 지정된 위치에 구멍을 뚫어 입구와 출구를 만듭니다. 화학 후드에서는 75% 에탄올 습윤 작업 물티슈를 사용해 유리 슬라이드를 청소하고 건조시키세요.

다음으로 고주파 발생기를 사용해 유리 슬라이드를 30초, PDMS 칩을 20초 처리합니다. 각 칩을 유리 슬라이드와 정렬한 후, 칩을 유리 슬라이드 표면에 부드럽게 눌러 결합하세요. 이제 기기들을 150도 오븐에 넣어 15분간 열접속을 합니다.

접지 후에는 상온에서 먼지 없는 상태로 보관하세요. 그 후 집게를 사용해 프로브 바늘의 플라스틱 부분을 제거하고 금속 튜브를 90도로 구부려 마이크로플루이딕 장치를 위한 커넥터를 만듭니다. Alexa Fluor로 섬유소 원액 결합 반응과 필요한 항체를 설정한 후, 정제 컬럼을 1,100G에서 2분간 원심분리하여 저장 버퍼를 제거합니다.

흐름을 버린 후, 반응 용액을 호환되는 수집 바이알에 장착된 정제 컬럼에 적재하고 원심분리기에서 1,100 G에서 5분간 필요한 혼합물을 수확합니다. 분광광도계를 사용하여 단백질과 염료 신호의 흡광도를 측정합니다. 단백질 농도와 형광 대 단백질 몰 비율을 계산하세요.

염료는 어두운 곳에서 섭씨 4도 정도로 보관하세요. 타이로드 완충제에 헤파린을 최종 농도인 10밀리리터당 0.32 단위 1밀리리터로 투여한 후, pH 7.4에서 500마이크로리터의 타이로드 완충제를 흡인하여 주사기를 준비합니다. 헤파린 함유 주사기에서 정맥천자를 통해 혈액을 채취한 후, 15밀리리터 원심분리관에 옮겨 37도에서 유지합니다.

폰 빌레브란트 인자 단량체를 PBS에서 밀리터당 2마이크로그램으로 희석합니다. 희석된 폰 빌레브란트 인자 단량체로 마이크로플루이딕 장치를 미리 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양하세요. 이제 형광 센서 세트 1 또는 세트 2로 혈액 샘플을 실온에서 10분간 배양합니다.

다음으로, 입구 및 출구 커넥터와 튜빙이 있는 마이크로플루이딕 장치를 연결합니다. 입구 커넥터의 다른 쪽 끝을 PBS가 들어있는 튜브에 연결하고, 다른 쪽 끝은 주사기에 연결하세요. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고, 마이크로플루이딕 장치를 역현미경에 장착하세요.

현미경 스테이지를 수동으로 조작하여 협착 부위를 찾으세요. 주사기 펌프를 이용해 분당 0.5밀리리터의 유량으로 마이크로유체 채널과 튜빙에 PBS를 채웁니다. 협착 부위 주변에 기포가 없는지 기기를 점검하세요.

흡입 튜브를 혈액 샘플에 연결하고, 주사기 펌프를 이용해 분당 0.018밀리리터의 유량으로 마이크로플루이딕 채널을 통해 혈액 샘플을 주입합니다. 역현미경에서는 소프트웨어에서 각 형광 채널의 노출 시간과 게인을 설정하세요. 네 개의 채널을 번갈아 가며 한 번에 한 개의 플루오로-4를 각각시켜 실시간 다색 형광 영상을 수행합니다.

초점면을 혈전 부위에 맞추고 협착 부위에 15분에서 30분간 형광 신호를 기록하세요. 데이터 분석을 위해서는 ImageJ 버전 1.53을 사용하여 데이터 파일을 엽니다. SZ 22 Fit C 채널을 사용해 혈전의 윤곽을 식별하세요.

그 다음 폴리곤 선택을 사용해 혈전의 영역을 대략적으로 선택합니다. 각 채널마다 이미지를 선택한 후 조정(Adjust)을 선택한 후 임계값을 선택해 배경 신호를 제거하세요. 마지막으로, '분석'을 선택하고 '측정'을 선택하여 혈전 내 면적과 평균 신호 강도를 측정합니다.

대표적인 스냅샷은 건강한 혈액에서 혈전이 형성되었고, 혈소판, 피브리노겐, 폰 빌레브랜드 인자, P-셀렉틴은 센서 세트 1을 사용해 시각화되었고, 혈소판, 인산티딜세린, E-양성 인테린 알파 IIb 베타 3, 활성화된 인테그린 알파 IIb 베타 3은 센서 세트 2로 시각화됨을 보여주었다. 단일 형광 채널 이미지를 처리하여 혈전 영역을 선택하고 배경 신호를 제거한 후 신호 영역과 평균 밝기를 측정하여 정량적 분석을 가능하게 했습니다. 형광 신호 강도의 지속적 분석은 혈전 형성 중 혈소판 축적에 대한 신호 대 시간 곡선을 생성하였습니다.

각 시점에 대해 센서 세트 1의 4개 바이오마커와 센서 세트 2의 4개의 바이오마커에 대한 총 신호 강도를 얻었습니다. 혈전 크기를 계산하고 7차원 혈전 프로파일을 생성했습니다. 현재 인간 환자의 혈전 전생 경향을 평가할 수 있는 바이오어세이가 없으며, 저희 연구는 이 공백을 메우려 노력하고 있습니다.

혈액 샘플의 생체역학적 활성을 감지함으로써, 저희 검사는 피험자의 전혈전 특성을 포괄적으로 평가할 수 있습니다. 저희 분석법은 환자의 혈전증 경향을 감지하는 임상 검사로 개발될 수 있으며, 차세대 항혈전제를 선별하는 데에도 활용될 수 있습니다.