단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

우리는 번역 후 변형을 위한 전역 염색질 이질성을 연구하기 위한 자동화 다중화 방법을 통해 단일 세포 프로테오믹스를 발전시키고 있습니다. 이 프로토콜이 어려운 점은 피코그램 규모의 프로테옴 준비, 다중화 표지, 그리고 복잡한 조합적 변형 히스톤 펩타이드 해독 때문입니다. 우선, 얼음처럼 차가운 PBS에서 최종 농도인 200에서 500 세포/마이크로리터당 G2/C3A 간세포암 세포를 재구성합니다.

각 노즐의 펄스 폭과 구동 전압을 제조사에서 제공하는 값으로 설정하세요. 최대 흡입 효율을 위해 두 노즐 간의 Z 오프셋 차이가 50마이크로미터 미만이어야 합니다. 각 노즐의 최적 접촉 위치를 파악하고 노즐 설정 탭의 Z 높이 측정값을 비교하세요.

튜플렉스 다중화 방식에서는 후드의 슬라이드 홀더에 단일 슬라이드를 올린 후 악기로 옮깁니다. 피펫을 사용해 LCMS 등급 DMSO 150마이크로리터를 새로운 PCR 튜브에 할당합니다. 세척 스테이션 2번 위치에 튜브 캡을 계기 문 쪽으로 놓으세요.

DMSO 런을 시작하세요. DMSO를 흡인한 후 한 번 안정적인 드롭을 얻으세요. PDC 투명도의 변화를 주목하세요.

전압을 올리기 위해 필요할 수도 있습니다. 안정성을 확인하려면 드롭 볼륨 체크를 수행하세요. 헤드 카메라 마법사 설정을 수행해 카메라를 정렬하세요.

DMSO를 배포하면 노즐을 자동으로 세척하고 모든 슬라이드에 걸쳐 이미지를 캡처하여 품질 관리를 할 수 있습니다. 이 이미지를 검토하여 모든 슬라이드에서 균일한 DMSO 방울이 있는지 확인하고, 누락되거나 목표에서 벗어난 방울이 있는지 확인하세요. 셀 서스펜션을 흡인한 후, 한 모듈에서 셀을 열고 백그라운드 캡처를 수행한 후 매핑 루틴을 실행하여 배출 구역을 정의합니다.

분석을 실행한 후 입자를 게이트하여 크기와 신장에 따라 셀을 선택하세요. 이제 신선한 소화 마스터 믹스를 LCMS 등급의 물에 준비하세요. 진공 펌프로 얼음 위에 10분간 용액을 제거하세요.

소화 혼합물을 슬라이드에 분배한 후, 기기가 자동으로 노즐을 세척하고 모든 슬라이드를 촬영하게 합니다. 각 방울이 소화 혼합물을 균일하게 받는지 확인하기 위해 이미지를 검토하세요. 소화를 위해 실온에서 하룻밤 배양하세요.

증발 작업을 시작하고 하룻밤 소화한 후, 이미지를 점검하세요. 물방울이 충분히 마르면 흐름을 멈추세요. 아니면 계속을 클릭하고 5분 더 말리세요.

라벨링을 위해서는 먼저 다중화 히스톤 유도체를 위한 스톡 용액을 준비합니다. 디스펜스 후에는 노즐을 자동으로 세척하고 모든 슬라이드를 촬영하게 하세요. 이미지를 검토하여 모든 슬라이드에 고르게 분포하고 방울 위치가 정확한지 확인하세요.

배양이 완료된 후에는 소환을 위해 하이드록실아민 용액을 분사합니다. 샘플을 받으려면 메인 탭에서 런을 선택한 후 런 탭에서 런을 시작하세요. 픽업이 끝난 후에는 이미지를 검토해 오류가 있는지 확인하세요.

픽업이 끝나면 픽업 플레이트에서 커버를 제거하세요. 그 후 진공 농축기에서 저온으로 건조합니다. 데이터 수집을 위해서는 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 프로그래밍하세요.

MS 2 실험은 50 질량 과충전, 고에너지 충돌 해리율 27%, 자동 이득 제어 목표 1000%의 격리 창을 포함하도록 설정하세요. 플레이트를 고무 밀봉 매트로 덮고 자동 샘플러 안에 넣으세요. 원시 파일을 얻은 후 크로마토그램을 간단히 확인한 후 EpiProfile 버전 2.1에서 원시 데이터를 실행합니다. 정규화된 히스톤 PTM 풍부도의 출력 표를 검토하고 이를 사용하여 후속 분석에 활용하세요.

처음 20종의 히스톤 H3 펩티도폼을 정량화하여, 대조군과 부티산나트륨 처리 조건에서의 상대적 풍부도를 보여주었습니다. H3 K9 아세틸화와 H3 K 14 아세틸화 모두 부티르산나트륨 처리 후 상대적으로 더 높은 양을 보였다. 반면 H3 K9 아세틸화는 처리된 세포에서 K14 아세틸화가 더욱 풍부하게 나타났습니다.

부티산나트륨 처리 후 총 아세틸화 수치가 증가했으며, 처리 세포는 단일 세포 수준에서 포착된 더 높은 이질성을 반영한 대조군에 비해 더 넓은 오차 분포를 보였습니다. 단일 및 동반 히스톤 변형의 정량화 결과, 조합적 아세틸화 상태가 부티르산나트륨에 의해 가장 강하게 영향을 받는다는 것이 밝혀졌습니다. 부티르산나트륨 처리 세포의 더 넓은 분산은 구형 내 개별 세포 간 생물학적 이질성이 증가함을 나타냈다.

이 프로토콜은 과학자들이 단일 세포 용액에서 염색질 상태를 연구할 수 있게 하여 후생유전학 연구의 격차를 해소합니다. 이 워크플로우는 고처리량 샘플 준비, 샘플 다중화, 편향 없는 질량분석법을 통해 민감하고 정량적인 단일 세포 후생유전학 데이터를 모두 생성할 수 있습니다. 향후 연구에서는 염색질의 조절이 암, 대사 질환, 노화 등 질병 상태를 어떻게 변화시키는지 탐구할 예정입니다.