Name: 단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 학습하세요 단일 세포 히스톤 번역 변형 분석을 위한 자동화된 다중화 샘플 준비 방법을. Hep G2/C3A 세포를 이용한 이 프로토콜은 염색질 이질성을 고감도로 정량 분석하여 후성유전학 연구의 재현성과 효율성을 크게 향상시킵니다.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리관</td><td>바이오-래드</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & 마이크로; L 와이드 보어 피펫 팁</td><td>피셔 사이언티브</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & 마이크로; L 와이드 보어 피펫 팁</td><td>피셔 사이언티브</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384웰 PCR 플레이트 Lo Bind &nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>96웰 진공 매니폴드</td><td>밀리포어</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, 옵티마 LC-MS/MS 등급</td><td>피셔 사이언티브</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>접착식 PCR 플레이트 포일</td><td>써모피셔</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>무수성 아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티브</td><td>AA42311AK</td><td>라벨 재고 용액 대용량</td></tr><tr><td>Arg-C 울트라, 질량 사양 등급</td><td>프로메가</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물에 사용해</td><td>코닝</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>셀렌비알(CellenVIAL)</td><td>스키니온</td><td>/</td><td>카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다</td></tr><tr><td>DMSO, 무수성</td><td>써모피셔</td><td>D12345</td><td>라벨 스톡 솔루션</td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>둘벡코의 변형 독수리 미디엄 (DMEM)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>개미산</td><td>열학</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>개미산 98% &ndash; LC-MS 리크로푸르에 100% 동의합니다</td><td>시그마</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS)</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (울트라 퓨어)</td><td>써모피셔</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티브</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>피셔 사이언티브</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>하이드록실아민 용액은 H2O 내 50&nbsp;wt. %</td><td>시그마</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>n-도데실-베타-말토사이드(DDM) 세제</td><td>피셔 사이언티브</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>오비트랩 익스플로리스 480 질량분석기</td><td>써모피셔</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 16% 수용액 EM 등급</td><td>전자현미경 과학</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (타입 2 코팅)</td><td>스키니온</td><td>/</td><td>카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>피셔 사이언티브</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10배, pH 7.4, RNase 무첨가</td><td>써모피셔</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>피어스 디메틸설폭사이드(DMSO), LC-MS 등급</td><td>써모피셔</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>피펫 건</td><td>에펜도르프</td><td>Z666467 (밀리포어 시그마)</td><td></td></tr><tr><td>프로피온 무수물과 Ge; 99%</td><td>시그마</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>프로피온 무수물-d10 &ge; 98 원자 % D, 그리고 ge; 99% (CP)</td><td>시그마</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>열학</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>SciCHIP H1 코팅 유리 슬라이드</td><td>스키니온</td><td>/</td><td>카탈로그 번호에는 인용문이 포함되어 있습니다</td></tr><tr><td>SpeedVac 진공 집중기 (96웰 플레이트)</td><td>열학</td><td>15308325</td><td>천재 SPD1010</td></tr><tr><td>멸균 후드</td><td>열학</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청 피펫</td><td>피셔 사이언티브</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 그린 데드 셀 스테인, 유세포검사용</td><td>써모피셔</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 효소 (1X), 페놀 레드 없음</td><td>써모피셔</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>소용돌이</td><td>시그마</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>물욕</td><td>피셔 사이언티브</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hptm2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

저희 시스템을 이용한 단일 세포 히스톤 단백질체학 워크플로우의 적용을 시연하기 위해, 5 mM 부티산나트륨으로 처리된 HepG2/C3A 세포의 구형체를 24시간 동안 분석했습니다. LC-MS/MS 획득 후, 원시 데이터를 EpiProfile으로 처리하여 경(프로피온 무수물) 및 무(프로피온 무수물-d10) 표지가 모두 이루어졌으며, 펩타이드와 히스톤 표지의 풍부도를 나타내는 정규화된 데이터를 얻었습니다. 이후 QuantQC R 패키지를 사용해 액체 핸들러의 획득 메타데이터를 EpiProfile 출력에 매핑하여 각 세포의 펩타이드 함량과 관련 풍부도 정보를 얻었고, 단일 세포의 최소 50%에서 일관되게 검출되지 않은 펩티도폼을 필터링하고, 단일 세포 강도 신호가 빈 세포의 150% 신호보다 크지 않은 펩티도폼은 제외했습니다. 데이터는 이후 log(1+x) 변환을 통해 정규화되어 후속 분석에 사용되는 결과 표를 얻었는데, 이 표는 다양한 펩티도폼이 나타난 열과 각 개별 셀별로 식별된 펩티도폼의 풍부도를 포함한 열로 구성되어 있습니다...

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

이 문서의 목적은 acetylated 히스톤 잔류물의 정량화와 H3 및 H4 히스톤의 효율적인 정화를 종합적이 고 체계적인 가이드를 제공 하는 것입니다.

H3 및 H4 히스톤 단백질 및 세포와 뇌 조직 Acetylated 히스톤 부호의 부 량의 정화

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

이 연구는 고립된 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용하여 전역 히스톤 변형의 정량화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 작업에는 데이터 수집에 사용된 미세아교세포 격리 프로토콜도 포함되어 있습니다.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

최근 인간 스핀들린 가족 구성원 4(SPIN4)에서 유전적 변이가 발견되었으며, 이는 새로운 발달 장애인 골 과다증식 환자들입니다. 뉴클레오좀 내에서 SPIN4 결합 기질로서 변형된 히스톤을 생화학적 동정하는 프로토콜과 새로운 결과가 제시되었습니다.

펩타이드 배열과 천연 뉴클레오좀 풀다운을 통해 인간 스핀들린 가족 4(SPIN4)의 결합 기질로서 변형된 히스톤의 식별

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 단일 세포 히스톤 번역 변형 분석을 위한 자동화된 다중화 샘플 준비 방법을. Hep G2/C3A 세포를 이용한 이 프로토콜은 염색질 이질성을 고감도로 정량 분석하여 후성유전학 연구의 재현성과 효율성을 크게 향상시킵니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

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