Name: 정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 학습하세요 항체를 이용한 다중 번역 후 수정 동시 농축 및 데이터 독립적 취득 질량 분석법으로 아세틸화와 석시닐화를 정량화하고 부위를 특정하는 방법을. 이 기법은 소량 샘플로도 높은 재현성을 제공합니다.

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우리는 벅 연구소 (1S10 OD016281)에서 트리플 TOF 시스템에 대한 NIH 공유 계측 보조금의 지원을 인정합니다. 이 작품은 또한 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (R01 AI108255 b.S.) 및 당뇨병과 소화 및 신장 질환의 국립 연구소 (에릭 베르딘에 R24 DK085610;; R01 DK090242에서 에릭 괴츠만까지). X.X.는 국립 보건원 (NIH 교부금 T32GM8806, 주디스 캄피시 및 리사 엘러비)의 보조금으로 지원되었으며, N.B.는 글렌 의학 연구 재단의 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Christensen, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+Protein+Acetylation%3A+An+Elegant+Mechanism+for+Bacteria+to+Dynamically+Regulate+Metabolic+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational Protein Acetylation: An Elegant Mechanism for Bacteria to Dynamically Regulate Metabolic Functions.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1604(2019).</li>
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<li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms.</a> Genes and Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li>
<li>Mocciaro, A., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+regulatory+mechanisms+in+ubiquitin-dependent+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging regulatory mechanisms in ubiquitin-dependent cell cycle control.</a> Journal of Cell Sciences. 125 (Pt 2), 255-263 (2012).</li>
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<li>McManus, F. P., Lamoliatte, F., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cross+talk+between+SUMOylation+and+ubiquitylation+using+a+sequential+peptide+immunopurification+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification of cross talk between SUMOylation and ubiquitylation using a sequential peptide immunopurification approach.</a> Nature Protocols. 12 (11), 2342-2358 (2017).</li>
<li>Venne, A. S., Kollipara, L., Zahedi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+level+of+complexity%3A+crosstalk+of+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 513-524 (2014).</li>
<li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+analysis+of+post-translational+modifications+by+serial+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2013).</li>
<li>Basisty, N., Meyer, J. G., Wei, L., Gibson, B. W., Schilling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+the+Acetylome+and+Succinylome+by+%27One-Pot%27+Affinity+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of the Acetylome and Succinylome by 'One-Pot' Affinity Enrichment.</a> Proteomics. 18 (17), e1800123(2018).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+UCP1+and+Mitochondrial+Metabolism+in+Brown+Adipose+Tissue+by+Reversible+Succinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of UCP1 and Mitochondrial Metabolism in Brown Adipose Tissue by Reversible Succinylation.</a> Molecular Cell. 74 (4), 844-857 (2019).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+of+the+lysine+acetylome+in+mitochondria+identifies+substrates+of+SIRT3+in+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics of the lysine acetylome in mitochondria identifies substrates of SIRT3 in metabolic pathways.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110 (16), 6601-6606 (2013).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT5+regulates+the+mitochondrial+lysine+succinylome+and+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">SIRT5 regulates the mitochondrial lysine succinylome and metabolic networks.</a> Cell Metabolism. 18 (6), 920-933 (2013).</li>
<li>Carrico, C., Meyer, J. G., He, W., Gibson, B. W., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Acylome+Emerges%3A+Proteomics%2C+Regulation+by+Sirtuins%2C+and+Metabolic+and+Disease+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Acylome Emerges: Proteomics, Regulation by Sirtuins, and Metabolic and Disease Implications.</a> Cell Metabolism. 27 (3), 497-512 (2018).</li>
<li>Sadhukhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics-assisted+proteomics+identifies+succinylation+and+SIRT5+as+important+regulators+of+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Metabolomics-assisted proteomics identifies succinylation and SIRT5 as important regulators of cardiac function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 113 (16), 4320-4325 (2016).</li>
<li>Collins, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+assessment+of+reproducibility%2C+qualitative+and+quantitative+performance+of+SWATH-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry.</a> Nature Communications. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+High-Quality+SWATH%28%28R%29%29+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF%28%28R%29%29+Mass+Spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of High-Quality SWATH((R)) Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF((R)) Mass Spectrometers.</a> Methods in Molecular Biology. 1550, 223-233 (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 PTM 누토크를 보다 효과적으로 이해하기 위해 동시에 다중 PTM 농축을 위한 새로운 기술을 설명합니다. 이 목표에 도달하는 대안적인 방법은 엄청나게 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 경향이 있으며,11,13을성공시키기 위해서는 다량의 단백질이 필요합니다. 이 프로토콜은 실험의 전반적인 효율성을 향상시키기 위해 한 번에 두 개의 PTM에 대한 항체 컨쥬게이션 비드의 인큐베이션을 포함하는 다중 PTM 농축 워크플로우를 제시한다. 이 방법은 또한 스펙트럼 라이브러리 생성 및 DIA MS 획득을 위한 DDA의 사용을 수반하여 단편 이온22,23으로부터의감소된 간섭으로 존재하는 펩티드를 검출하고 정량화한다. MS 데이터베이스 검색 엔진과 같은 소프트웨어 프로그램은 DDA 획득에서 데이터를 분석하고 정량화하는 데 사용되는 반면, 정량적 프로테오믹스소프트웨어(24)와 특정 DIA 정량 분석소프트웨어(25)는 DIA 획득에 의해 생성된 복잡한 스펙트럼을 해석하는 데 필요합니다.
이 프로토콜에는 신중하게 따라야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 프로토콜의 주요 목표는 여러 PTM을 동시에 풍부하게 하는 것이므로, 항체-친화성 농축 단계(섹션 2)는 실험의 성공에 매우 중요하다. 구슬에 세서를 수행 할 때, 구슬중 어느 것도 실수로 흡인되지 않도록할 필요가있다. 트립신(step 1.8)으로 소화되기 전에 우레아 농도를 1M로 희석하는 것도 필요하다. 단백질 용해화를 위한 프로토콜의 초기에 8M 우레아가 요구되더라도, 1 M 이상의 우레아 농도는 트립신의 효소 활성을 억제한다. 또한 프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 pH를 일관되게 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 소화하기 전에 특히 중요합니다. 시료 및 트립신 용액의 pH가 인큐베이션 전에 적절히 중화되지 않으면, 많은 절단 부위가 누락될 수 있는 비효율적인 소화를 초래할 수 있으며, 이로 인해 펩티드 식별이 감소할 수 있다.
샘플을 준비할 때 프로토콜을 약간 수정하면 도움이 될 수 있습니다. 1 mg의 시작 물질로부터 조달된 단백질 용해물의 경우, 각 PTM 스캔 튜브에 제공된 항체 비드의 분기가 비용 효율적인 대안으로 사용될 수 있다. 사용되는 항체 비드의 양이 비례적으로 증가하는 한 더 많은 양의 시작 물질을 더 나은 결과를 위해 사용될 수 있습니다. 워크플로우를 향상시킬 수 있는 또 다른 수정사항은 트립신 이외에 다른 프로테아제로 샘플을 소화하는 것입니다. 이 수정은 단백질 잔기의 증가한 엄호를 제공하는 펩티드 에 있는 더 많은 가변성 귀착될 것입니다. 필요는 없지만, 트립신은 높은 절단 특이성26으로인해 PTM 분석에 사용되는 효소 중 하나가 되는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 한계는 연구 중인 PTM이 동시에14를농축하기 위해 유사한 화학을 가질 필요가 있다는 것입니다. 상이한 항체-컨쥬게이션 비드에 대한 절차는 유사한 용출 조건을 포함하는 유사한 용매 및 용액을 활용하며, 바람직하게는 동일한 공급업체로부터 유사해야 한다. 이러한 이유로, 여기서 설명된 방법은 일관되게 아세틸화 및 간결화를 예로 사용하며, 둘 다 항체 접합비(Cell Signaling Technology, Inc.)를 사용한다. 이 방법은 이론적으로 모든 수의 PTM에 적용될 수 있지만, 이 점에서 프로토콜의 정확한 한계를 평가하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다. 더욱이, 이것은 항체 기반 농축 방법이므로, 상기 방법은 PTM 부위의 상대적 정량화만을 제공할 수 있다.
기존 다중 PTM 보강 방법과 비교하여 이 워크플로는 보다 실현 가능하고 비용 효율적인 대안입니다. 이 실험에서, 이 방법의 효능은 개별 또는 직렬 농축과 같은 대체 방법과 매우 잘 비교된다는 것이 관찰되었다. 도 2B는 변형된 펩티드 피크 영역에 대한 중앙값 CV가 단일 PTM 농축물 및 직렬 PTM 농축물(13)에 비해 단일 포트 방식에서 실제로 감소되었다는 것을 보여준다. 우리는 또한 아세틸화 또는 간결화에 대한 사이트 수준의 정량화를 평가하는 실험 결과를 분석했습니다. 또한, 스피어맨 상관분석(그림 2C,D)은단일 PTM 농축 워크플로우와 유사하게 원팟 PTM 농축이 수행된다는 것을 입증하였다. 이것은 또한 펩티드- 및 단편 수준 상관관계에 대해서도 마찬가지였다. 한 포트와 직렬 PTM 농축을 비교할 때 세 가지 상관 관계에 대해 동일한 관찰이 유지되었습니다.
이 프로토콜을 통해 연구자들은 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 빠르고 비용 효율적인 방식으로 만들 수 있습니다. 워크플로의 DIA 구성 요소는 현장 현지화에 대한 정보를 제공하고 PTM의 낮은 사이트 점유와 같은 문제를 극복하기 때문에 연구원이 PTM에 대해 더 많이 이해할 수 있게 해줍니다. 후속 실험은 이 방법을 사용하여 동시에 보강될 수 있는 PTM 수의 상한을 평가하기 위해 수행될 수 있습니다. 이 워크플로의 향후 개선에는 사이트 지역화 및 PTM 사이트 점유 분석을 더욱 자동화하기 위한 고급 소프트웨어 플랫폼 개발이 포함될 수 있습니다.

번역 후 변형의 무수한 동적으로 활성에 대한 효과를 통해 단백질과 경로를 조절1,신호2,회전율3,4. 예를 들어, 단백질 키나아제는 인산염기5의첨가에 의해 활성화 또는 비활성화되고, 히스톤 아세틸화 및 기타 변형은 염색질 구조를 변화시키고 전사 조절메커니즘으로작용하는 메커니즘을 제공한다6,7. 최근 몇 년 동안, 증거는 여러 PTM이 콘서트에서 작동하거나 단백질 기능 또는활성을조절하기 위해 경쟁8,9,10,11탑재하고있다. 따라서 PTM 크로스토크를 이해하는 것은 PTM 연구에서 새로운 필요성입니다. 그러나 PTM 사이트를 식별하고 정량화하는 대부분의 proteomic 워크플로는 여러 수정의 상호 작용이 아니라 단일 수정에 중점을 둡니다. 기재된 워크플로우는 다중 상이한 PTM에 의해 수정되는 특정 단백질 변형 "핫스팟" 및 라이신 잔류물의 상관관계를 나타냅니다.
여러 PTM을 동시에 연구하는 실행 가능한 방법에 대한 과학계의 필요성이 증가하고있습니다 12. 전 세계적으로 PTM의 여러 유형의 사이트를 식별하고 정량화하는 대부분의 방법은12,13에필요한 조직의 높은 비용과 양으로 인해 도전적이다. 다중 PTM 농축 실험은 시료 전처리, 데이터 수집 및 데이터 분석 측면에서 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라, 이러한 연구는 전형적으로 크고 종종 금지되는 양의 단백질11을필요로 한다. 여기에 설명된 프로토콜은 여러 PTM의 동시 보강 및 분석을 위한 프로토콜로, 이러한 여러 장벽을 해결하고 다양한 PTM14간의 대규모 PTM 프로파일링 및 평가를 가능하게 합니다. 이 한 냄비 워크플로우는 생물 의학 연구원이 전 세계적으로 여러 PTM을 프로파일화하고, 공동 변형 된 펩티드를 식별하고, 효율적이고 비용 효율적인 방법으로 PTM 누토크를 연구할 수있는 실용적인 방법을설명합니다 14,15.
여기에서, 이 방법은 50 년 전에16년 이상 처음으로 공부된 미토콘드리아 단백질 acylation를 검토하여 전시됩니다. 특히 리신아세틸화(17) 및 간시닐레이션(18)에 집중하며, 단백질에 대한 이러한 변형의 공동 발생을 포함하고 펩티드 수준에서도 공동 변형한다. 이 연구는 sirtuin 5 (SIRT5) 녹아웃 마우스 모델을 사용하기 때문에, 아세틸화 및 침전 부위의 농축에 초점을 맞추기 위해 선택되었다. 이 결정은 succinylation 사이트가 SIRT5 desuccinylase의 표적이기 때문에 이렇게 KO 마우스에 있는 중요한 upregulation를 보여주기 위하여 예상되기 때문에, 그(것)들을 이 경우에 가장 관련성 이 PTM 만들기. 두 PTM은 최근 Carrico et al.19에의해 요약된 바와 같이 생물학적으로 관련이 있습니다. 일반적으로, 아세틸화는 유전자 발현 및 대사에 중요한 효과를 나타내며, 간결화는 심장 대사 및 기능20을조절하는 것으로 보고되었다.
기재된 프로토콜은 적은 양의 단백질 입력 물질(예를 들어, 1 mg의 단백질 용해)으로 수행될 수 있으며 샘플 처리, MS 수집 및 데이터 분석에 소요되는 시간을 감소시킴으로써 실험의 총 기간을 감소시킨다. 워크플로는 그림 1에제공됩니다. 우리는 또한 더 낮은 양의 시작 물질을 사용했습니다 (단백질 용해액의 100 μg까지, 그에 따라 사용되는 비드의 양을 축소), 이는 예상대로, 확인 된 아실화 펩티드의 전반적인 수율을 감소; 그러나, 그것은 여전히 매우 가치있는 결과와 정량화 된 수화물 펩티드를 제공합니다.
소위 하향식 또는 중간 하향 식 워크플로우는 일반적으로 단백질 분해 소화 접근법을 사용하지 않지만 (따라서 하나의 단백질 내에서 여러 PTM의 연결을 유지), 이 프로토콜은 PTM 식별 및 정량화를위한 추가 깊이와 감도를 얻기 위해 펩티드 기반 친화 강화 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다(그림 1). 또한, 이 펩타이드 중심 워크플로우는 1) 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위한 데이터 의존적 수집(DDA) 및 2) 데이터 독립적 수집(DIA)을 포함한 최신 질량 분석 방법을 활용하여 라벨 없는 워크플로우에서 정확한 PTM 정량화를 제공합니다.
DIA 워크플로우는 샘플링된 m/z 범위21내의 모든 펩티드 신호를 포괄적으로 단편화하여 일반적인 DDA 스캔 방식의 샘플링 스토시시티를 극복합니다. 이 기능은 또한 펩티드 내에서 변형되는 특정 단편 이온에 관한 정보를 얻는 것이 더 쉽기 때문에 사이트 국소화 측면에서 매우 유용합니다. 또한 DIA 워크플로우를 통해 동일한 전구체 이온을 가진 경미한 PTM-펩타이드 이소폼을 식별하고 정량화할 수 있습니다. DIA 방법은 또한 항상 포괄적으로 측정되는 특정 상응하는 단편 이온에 기초하여 펩티드 내의 특정 PTM 부위 국소화를 결정할 수 있다. 그러나 DDA 접근 방식은 종종 동일한 전구체 이온에 대해 MS/MS의 다중 샘플링을 제외하는 "동적 배제" 기능을 사용하므로 사소한 PTM 이소폼이 누락됩니다.
여기에 설명된 동시 보강 전략은 여러 PTM의 글로벌 프로파일링 및 정량화, PTM 누화 검사, 번역 후 수정의 동적 상호 작용 이해의 이점을 제공하는 연구에 이상적입니다. 하나의 결합된 워크플로우에서 다중 농축 PTM의 식별은 단백질화 펩타이드를 함유하는 PTM의 글로벌, 직렬 또는 병렬 농축, 또는 본래 단백질의 분석에 의해 대체로 설명되었습니다. 아세틸화 및 간화의 연속 농축과 직접 비교하여, 원팟 방법론의 효율은 매우 유사한 것으로 확립되었다14. 이러한 대체 프로토콜은 상당한 양의 시작 재료와 시간이 필요하며 엄청나게 비쌀 수 있습니다. 대조적으로, 원팟 프로토콜은 후속 분석 및 식별을 통해 하나 이상의 PTM을 농축하는 저렴하고 효율적인 방법을 제공한다.
마우스 간 조직은 SIRT5 녹아웃 마우스로부터 수득되고 여기에서 시작 물질로서 사용된다. 이 프로토콜은 또한 상이한 조직 또는 세포 배양 실험으로부터단백질 용해를 위해 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 조직 또는 세포 배양 펠릿으로부터 수득된 단백질 리세이트에 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1 M 트리에틸암모늄 바이오카보네이트 완충액 (TEAB)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>36XL66</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode, Denville, NJ, USA</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>C18 pre-column chip (200 &micro; m x 6mm ChromXP C18-CL 칩, 3um, 120A)</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td><td>5015841</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL 칩(75 &micro; m x 15cm ChromXP, 3 &마이크로; m, 300 &Aring;)</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td><td>804-00001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock)</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F0507-500ML</td><td></td></tr><tr><td>인덱스 머무름 시간(iRT) 정규화 펩타이드 표준</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드(IAA)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>mapDIA</td><td></td><td>웹 링크</td><td>소프트웨어 DIA 데이터 세트의 간섭 제거를 위한</td></tr> 소프트웨어 <tr><td>메탄올, 버딕 및 잭슨 LC-MS 등급</td><td>Burdick 및 Jackson, 미국 미시건주 머스키건</td><td>BJLC230-4</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 1 초순수 디스펜서</td><td>VWR International, Radnor, PA, USA</td><td>89204-088</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td></td>의 mProphet <td>Skyline에 통합</td><td>FDR 평가를 위한 통합 통계 알고리즘</td></tr><tr><td>Oasis HLB SPE 카트리지</td><td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td><td>WAT094225</td><td>단백질 용해물 탈염용 카트리지, 최대 50mg 재료</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 Life</td><td>Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot 5.0 - 'MS database search engine'SCIEX</td><td>, Framingham, MA, USA</td><td>소프트웨어 다운로드 SCIEX</td><td>MS 데이터베이스 검색 엔진</td></tr><tr><td>PTMScan 숙시닐-라이신 모티프 [Succ-K] Kit #13764</td><td>세포 신호 전달 Technology</td><td>13764</td><td>antibody beads for affinity enrichment</td></tr><tr><td>PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13416</td><td>항체 beads for affinity enrichment</td></tr><tr><td>Sequencing-grade lyophilized trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Skyline - 'Quantitative Proteomics Software'MacCoss</td> <td>lab (academic)</td><td>오픈 소스 소프트웨어</td><td>정량 단백질체학 소프트웨어(학술)</td></tr><tr><td>Spectronaut - 'DIA 정량 분석 소프트웨어'</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td><td>Sw-3001</td><td>DIA 정량 분석 소프트웨어/PTM 사이트 현지화</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>SPD131DDA-115</td><td>기기</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>85300</td><td>조직의 효율적인 용해를 위한 기기</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T6508-1L</td><td></td></tr><tr><td>TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight(QqTOF) 질량 분석기</td><td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td> 견<td>적당</td><td>고해상도 질량 분석기</td></tr><tr><td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC 시스템</td><td>SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td><td>모델 #845</td><td>크로마토그래피 분리 시스템</td></tr><tr><td></td><td>Urea Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>Water, Burdick and Jackson LC-MS</td><td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td><td>600-30-76</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18 Pipette Tips, P10</td><td>Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL</td><td>ZTC18S096</td><td>펩타이드 혼합물의 탈염을 위한 C-18 수지 적재 팁</td></tr></tbody></table>

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

단백질의 여러 번역 후 수정 (PTM)을 공부하는 것은 PTM 누화를 이해하고 단백질 기능에 대한 보다 전체적인 통찰력을 얻는 중요한 단계입니다. 다중 PTM 농축 연구의 중요성에도 불구하고, PTM의 여러 글로벌 단백질 분석을 수행하는 데 필요한 비용, 시간 및 대량 단백질 수량으로 인해 한 번에 하나 이상의 PTM을 조사하는 연구는 거의 없습니다. 이 프로토콜에 자세히 설명된 "원 포트" 선호도 농축은 적은 양의 시료를 함유하는 리신 잔류물을 함유하는 펩티드의 동시 식별 및 정량화를 허용함으로써 이러한 장벽을 극복합니다. 입력. 이 프로토콜은 SIRT5 녹아웃 마우스의 마우스 간에서 단백질 용해물 의 준비, 트립신 소화의 성능, PTM에 대한 농축, 데이터 독립적 인 수집 (DIA) 워크플로우를 사용하여 질량 분광 분석의 성능을 포함한다. 이 워크플로우를 통해 동일한 샘플에서 두 개의 PTM을 동시에 보강할 수 있으므로 많은 양의 샘플없이 PTM 누화를 연구할 수 있는 실용적인 도구를 제공하며 샘플 준비, 데이터 처리에 필요한 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 인수 및 분석. 워크플로의 DIA 구성 요소는 포괄적인 PTM 관련 정보를 제공합니다. DIA는 서로 다른 PTM 지역화 이소폼을 구별하기 위해 계산적으로 해독할 수 있는 포괄적인 조각 이온 세트를 제공하기 때문에 PTM 사이트 지역화를 연구할 때 특히 중요합니다.

그림 1은 마우스 간에서 조직을 수확하고, 트립신으로 단백질 용해물을 소화하기 위해 1 mg의 단백질을 사용하고, 항체 컨쥬게이트 비드로 펩타이드를 배양하고, MS에서 샘플을 획득하고, 마지막으로 다양한 정량적 프로테오믹스 소프트웨어 패키지(학술 및 상업용)를 사용하여 데이터의 DIA/SWATH 분석을 수행하는 것을 포함한 워크플로우의 일반적인 다이어그램을 보여줍니다.
그림 2A는 현재 다중 PTM 농축 연구에 사용되는 대체 방법과 비교하여 워크플로우의 타임라인과 필요한 샘플 및 단백질의 양을 보여줍니다. 원 팟 방법은 이러한 대체 방법과 마찬가지로 샘플 수의 절반만큼 많은 시간과 절반으로 수행 할 수 있습니다. 2개의 단일 PTM 농축 방법에 비해, 1-pot 프로토콜은 또한 단백질의 절반 양을 필요로 한다.
이 프로토콜은 실현 가능하고 비용 효율적인 대안으로 나타났습니다. 도 2B는 변형된 펩티드 영역에 대한 변이(CV)의 중간 계수가 단일 PTM 및 직렬 PTM 농축물보다 원팟 방식에서 더 낮았다는 것을 나타낸다. 도 2C,D는 1포트 PTM 및 단일 PTM 농축 방법을 비교하는 동안 두 수정에 대한 사이트 수준 정량화의 상관 관계 간에 주목할 만한 차이가 없음을 보여줍니다. 이것은 또한 펩티드 수준 및 단편 수준 상관관계에 대해서도 마찬가지였다. 한 냄비 와 직렬 PTM 농축물을 비교할 때 세 상관 관계 모두에 대해 동일한 관찰이 유지되었습니다. 모든 기본 MS 원시 데이터 및 처리 된 엑셀 결과 시트는 Basisty 등14에 의해 최근 보고서와 관련된 사용할 수 있으며 MassIVE (MSV00081906) 및 ProteomeXchange (PXD008640)에서 다운로드 할 수 있습니다.
일반적으로 항체 농축 전략은 잠재적 인 에피토프 폐색 또는 제한된 특이성과 같은 특정 한계를 나타낼 수 있지만,이 연구에서 사용되는 항체는 독립적으로 생성 된 클론의 혼합물이므로 더 넓은 범위를 제공합니다. 특이성.
실험 결과는 PTM 누토크를 감지하고 평가할 수 있는 가능성을 문서화합니다. 도 3은 성공적인 농축으로부터의 데이터를 표시하고 PTM 누토크를 시각화하는 다중 및 상이한 아실 변형을 포함하는 펩티드에 대한 예를 도시한다. 도3A는 하나의 리신 잔기 상에서 아세틸화되고 다른 쪽에서 간결화된 펩티드를 나타내고, 도 3B는 두 라이신모두에서 동일한 펩티드를 증액된 동일한 펩티드를 나타낸다. 이것은 동일한 리신 잔류물이 두 아실레이션 그룹으로 수정될 수 있음을 보여 주며, 해당 사이트에서 발생하는 누화의 가능성이 있다. 도 4는 7.1-7.3 절에 기재된 바와 같이 확인된 라이신 잔기의 수를 표시하여 두 가지 수정을 모두 수행하고, 또한 가능한 PTM 크로스토크를 가리킨다.
그림 5에서 알 수 있듯이, 정량적 프로테오믹스 소프트웨어로 DIA PTM 데이터 세트를 처리하면 어떤 특정 라이신 잔류물이 수정되는지 정확히 파악할 수 있습니다. 이는 가능한 PTM 크로스토크를 측정하기 위한 모든 분석을 위한 필수적인 단계인 사이트 지역화라는 개념입니다. 그림 5는 8.1-8.3 절(구체적으로 단계 8.3.2 및 8.3.3)에 설명된 대로 시각화및 평가될 수 있는 각각에 대한 확인 및 반박 이온과 함께 두 개의 잠재적 인 이소폼을 표시합니다. 이 정보를 바탕으로 원래 샘플에 있는 두 개의 등소폼 중 어느 것이 존재할지 자신 있게 식별할 수 있었습니다. 확인된 이소폼 KQYGEAFEKacR의 MS/MS 스펙트럼은 42 m/z(아세틸 기의 증분 질량)에 의해 이동된 아세틸화된 리신 잔류물을 함유하는 y 이온(y2-y5)이개질된 펩티드에서 특이적 리신 잔류물을 확인했음을 명확하게 입증한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig1.jpg"> 그림 1: PTM의 원포트 보강을 위한 일반적인 워크플로우입니다. 조직(여기, 간)은 SIRT5 KO 및 야생형(WT) 마우스로부터 수확되고, 단백질은 용해되고, 펩티드로 트립신 소화되고, 탈염된다. 펩티드는 그런 다음 succinyl- 및 아세틸 항체 구슬의 조합으로 면역 affinity에 의해 농축됩니다. 병렬 MS 워크플로우는 1) 전체 용해 단백질 발현 변화(단백질 정규화를 위한) 및 2) 아실 함유 펩티드를 아실 함유 펩티드(DDA-MS) 및 부위 국소화를 모두 측정한 다음 정량화(DIA-MS)를 측정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig2.jpg"> 그림 2: 한 포트 워크플로우와 다른 방법을 비교합니다. (A)원팟 워크플로우, 직렬 PTM 농축 및 2개의 단일 PTM 농축에 필요한 시간, 비용 및 재료 비교. (B)원팟 워크플로우, 단일 아세틸-리신 PTM 농축, 단일 수시닐-리신 PTM 농축 간의 CV 비교. 스피어맨 상관 분석은 단일 포트 워크플로우및 단일 PTM 농축물로부터 수득된 아실 펩티드 피크 영역을 비교한 결과,(C)아세틸화 부위 및(D)간약성 부위에 대한 log2 피크 영역 결과의 해당 플롯. 회귀 경사 및 상관 계수는 개별 패널14에표시되어 있습니다. 2개의 독립적인 생물학적 복제본은 각각의 조건에 대해 처리되었다. 이 수치는 Basisty 외14에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig2alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig3.jpg"> 그림 3: 아세틸화와 리신 잔기의 간질 수정 사이의 크로스토크. 동일한 아미노산 서열을 보여주지만 다른 PTM을 가진 2개의 리신 잔기에서 변형된 미토콘드리아 3-케토아실-코아 티올라제의 트립틱 펩티드의 MS/MS 스펙트럼.(A)펩타이드 AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK 및(B)MS/MS/MS 의 펩타이드 AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. 이 수치는 Basisty 외14에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig4a.jpg"> 도 4: 단백질 복합체에서 아세틸화 및 간첩성 리신 잔기 사이의 중첩 및 크로스토크. (A)2,235 아세틸화와 2,173 개의 간결한 사이트 사이에 중첩을 표시하는 벤 다이어그램. 이 중 943개 사이트는 아세틸화되고 간결했다. SIRT5 (de-succinylase) 녹아웃 마우스로부터의 간을 분석하고, 많은 간질 부위를 확인하였다. 사실, 그들은 일반적으로 마우스 간에서 관찰 보다 더 풍부 했다 (수정 된 펩 티 드의 Q 값에서 여과 되었다 &lt;0.05). (B)아세틸화 및 간결한 부위를 모두 포함하는 소단위의 백분율을 나타내는 단백질 복합체(굵은 빨간색 선은 피셔의 정확한 시험에 의해 결정된 중요성을 나타낸다). (C)ATP 신타제 복합체의 다이어그램: 적색의 단백질 소단위는 아세틸화 및 간결화된 부위를 모두 포함하는 소단위를 묘사한다. 이 수치는 Basisty 외14에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60780/60780fig5.jpg"> 도 5: 정량적 프로테오믹스 소프트웨어는 PTM의 펩티드 부위 국소화를 해독한다. 펩티드의 MS/MS 단편화에 기초하여, 아세틸 기가 수정되는 특정 라이신 잔류물에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이는 소프트웨어가 PTM의 현장 현지화에 대한 귀중한 정보를제공하는 능력을 보여줍니다. 펩티드의 잠재적 부위 국소화 이소폼에 대해 "확인" 및 "반박" 단편 이온이 도시된다. 이 정보를 바탕으로, 점수를 확인하고 점수를 반박하는 것이 할당되고, 샘플에서 Isoform KQYGEAFEKacR의 존재를 확인한다. (B)확인된 이소폼 KQYGEAFEKacR에 대응하는 MS/MS 스펙트럼은 아세틸화된 리신 잔류물(y2 이상)을 포함한 모든 y 이온이 아세틸 변형에 상응하는 +42 m/z의 증분 질량을 수반한다는 것을 나타낸다. 관찰된 b 이온은 변형을 포함하지 않는다. (C)추출 된 이온 크로마토그램 (XIC)y2 및 y3 이온에서 발생하는 풍부한 피크 영역을 가진, 둘 다 확인 된 이소폼 KQYGEAFEKacR. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60780/60780fig5large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

이 프로토콜은 항체를 가진 다중 PTM의 동시 농축을 위한 새로운 기술을 설명하고 사이트 현지화 및 교차 토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻기 위하여 데이터 독립적인 취득 질량 분광분석 분석뒤에 선행됩니다. 이는 소량의 시료 입력만으로 아세틸화 및 간결 PTM을 포함하는 슬라이스로 펩타이드를 동시 식별 및 정량화할 수 있는 시간 및 비용 효율적인 기술입니다. 번역 후 수정을 추적하는 것은 다른 질병 상태를 특성화하고 퇴치하는 중요한 단계입니다.우리는 이미 특정 암과 당뇨병이 단백질 수정을 통해 높게 통제된다는 것을 알고 있습니다. 이 방법은 이론적으로 유비퀴티닝, 인산화 및 기타와 같은 농축을 위해 항체를 가진 모든 PTM에 적용될 수 있습니다. 그것은 또한 다른 조직 유형 또는 세포 배양 모델에 적용 할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 귀중한 데이터를 얻는 열쇠는 재현성입니다. 이것은 모든 단계가 항체 구슬을 관련시키는 단계 특히 아주 신중하게 수행되도록 함으로써 달성될 수 있다. 시작하려면 최대 10밀리그램의 단백질을 결합한 C18 수지가 함유된 카트리지를 얻습니다.이 카트리지를 진공 장치에 맞춥니다. 80%의 아세토나이트와 0.2%의 마이크로리터를 카트리지에 19.8%의 물로 추가하고 진공 흡입을 시작하여 액체를 통과합니다. 이 단계를 한 번 반복하여 카트리지의 건조를 완전히 피하십시오.진공 흡입이 있는 물에 0.2%의 마이크로리터 800마이크로리터를 추가하여 카트리지를 평형화합니다. 이 것을 두 번 반복합니다. 진공 흡입을 통해 카트리지에 약 1, 000 마이크로리터 용액에 1밀리그램 펩티드를 적재합니다.진공 흡입 하에서 물에 0.2 %의 마이크로 리터 800 마이크로 리터로 펩티드를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 각 카트리지 아래에 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기를 배치하여 펩티드를 수집합니다. 진공 흡입 하에 카트리지의 엘루트 펩타이드는 800 마이크로리터800 마이크로리터와 19.8%의 물에서 0.2%의 포믹산을, 400마이크로리터가 동일한 용액의 마이크로리터로 먼저 배출된다.무염 펩티드 샘플을 진공 농축기에서 2~3시간 동안 완전히 건조시다. 지금, 감기 1X 면역화 정제 완충제의 1.4 밀리리터에서 말린 펩티드를 재중단한다. 소용돌이는 약 7의 pH를 혼합하고 보장합니다.샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 000배 g로 원심분리합니다. 작은 펠릿이 나타납니다. 항체 구슬을 준비하는 동안 펩티드를 얼음 위에 따로 놓습니다.K-아세틸 항체 비드 슬러리 100 마이크로리터를 함유한 튜브에 차가운 1X PBS 1밀리리터를 추가하고, K-succinyl 항체 비드 슬러리 100마이크로리터를 함유한 튜브를 배관하여 혼합합니다. 전체 솔루션을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 30초 동안 소형 원심분리기에서 회전합니다. 구슬을 떼어내지 않도록 주의를 기울이는 PBS를 흡인하십시오.세 번 더 씻는 것을 반복하십시오. 다음으로 PBS의 약 440 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단하십시오. 구슬을 여러 번 파이펫으로 잘 섞어 주시습니다.200 마이크로리터 프리컷 팁으로 각 아세틸리신 항체 비드와 간결한 항체 구슬 100개를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 미니어처 원심분리기에서 30초 동안 회전하고 젤 로더 팁으로 미디어를 흡입합니다. 구슬은 이제 흰색으로 바뀝니다.파이펫은 세척된 구슬에 직접 다시 매달린 펩티드를 배양하고 밤새 섭씨 4도에서 구슬로 펩티드를 교반하여 배양합니다. 아침에는 펩티드 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 바운드되지 않은 펩티드를 함유한 상체를 제거하고 원하는 경우 향후 실험을 위해 저장하십시오.차가운 1X 면역affinity 정제 버퍼 1 밀리리터를 구슬에 추가하여 5번 반전하여 세척하고 섞습니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 면역affinity 정제 용액을 흡습하고 면역 affinity 정제 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.그런 다음 차가운 HPLC 물 1 밀리리터를 구슬에 넣고 5번 반전하여 섞습니다. 섭씨 4도에서 30초 동안 2, 000배 g에서 회전합니다. 물을 흡입하고 물 세척 단계를 2 번 더 반복합니다.2, 000g에서 섭씨 4도에서 30초 동안 추가 시간을 회전하여 튜브 바닥에 남은 물을 채집합니다. 평평한 팁 젤 로딩 팁으로 수집 한 여분의 물을 흡입하십시오. 구슬을 흡입하지 않도록주의하십시오.물에 0.15%의 트리플루오로아세산 55마이크로리터를 비드에 넣습니다. 비드를 실온에서 10분 동안 배양하고 튜브 바닥을 두드려 섞어줍니다. 미니어처 원심분리기에서 30초 동안 실온에서 구슬을 회전시보시다.평평한 팁젤 로딩 팁을 사용하여 용출된 펩티드를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 물에 0.15%의 트리플루오로아세산 45마이크로리터를 비드에 넣습니다. 튜브 의 바닥을 탭하면서 실온에서 10 분 동안 배양하여 가끔 섞습니다.미니어처 원심분리기에서 실온에서 30초 간 구슬을 회전시보시다. 플랫 팁 젤 로딩 팁을 사용하여 두 번째 용출을 제거하고 첫 번째 용출과 결합합니다. 결합된 용출 된 펩티드를 실온에서 5 분 동안 12, 000 배 g에서 회전하여 이월하는 구슬을 펠렛하십시오.펩티드 샘플 용액을 새로운 500 마이크로리터 튜브로 전송합니다. 10분 동안 분당 2개의 마이크로리터에서 모바일 상 A로 세척하여 풍부한 펩티드 혼합물을 C18 전열 칩에 적재하고 펩티드를 다시 탈염하는 로딩 방법을 구축한다. 펩티드가 분석 컬럼으로 옮겨지고 분당 300나노리터의 유량으로 이동상 A와 B.를 사용하여 2~3시간 그라데이션으로 체질화하는 크로마토그래피 방법을 구축하여, 80분 이상 5%의 이동상 B에서 35%의 이동상 B로 선형 그라데이션을 사용한다.그 후, 이동상 B를 5분 동안 80%로 경사로돌린 다음 8분 동안 80%B로 유지한 후 25분 간 재평형으로 5%B로 돌아갑니다. 다음으로 데이터 종속 수집을 위한 MS 계측기 방법을 빌드합니다. 실험용으로는 M/Z 400에서 1, 500까지 MS1 전구체 이온 스캔을 설정합니다.지속 시간을 120분으로 설정합니다. IDA 실험을 만들고 확인을 클릭합니다. 스위치 기준 탭에서 강도 임계값을 설정하여 초당 2~5~200개 사이의 충전 상태의 이온에 대한 MS/MS 스캔을 트리거합니다. 전구체 이온의 동적 제외를 60초로 설정합니다.실험 2의 경우 MS2 스캔 범위로 MS/MS 제품 이온 스캔을 M/Z 100에서 1, 500까지 설정합니다. 매개 변수 편집을 클릭하고 충돌 에너지 확산을 5로 설정하고 고감도 제품 이온 스캔 모드를 선택합니다. 마지막으로 샘플을 자동 샘플러에 넣습니다.샘플 큐를 제출하고 데이터 독립적 인 수집을위한 MS 계측기 방법을 구축하고 두 개의 계측기 스캔 실험을 정의하는 LC-MS / MS 수집 방법을 시작합니다. 400에서 1, 250 질량에서 MS1 전구체 이온 스캔을 수행하여 충전하고 지속 시간을 120분으로 설정합니다. 충돌 에너지 스프레드를 10으로 설정하고 축적 시간을 45밀리초로 설정한 다음 고감도 제품 이온 스캔 모드를 선택합니다.다음으로, 64개의 가변 창 DIA SWATH 획득 체계가 포함된 텍스트 파일을 가져와 스와트 획득 창을 메서드로 채웁니다. 이 인수 방식에서, 5~90질량에서 충전 및 폭에 이르는 가변 창은 45밀리초 누적 시간으로 각각 총 64SWATH 세그먼트로 충전하기 위해 400에서 1, 250 질량의 전체 질량 범위에 걸쳐 증분 단계로 전달됩니다. MS1 축적 시간을 0.25초로 조정합니다.함께 MS1 스캔및 64 MS2 스캔은 이제 총 3.2초의 사이클 시간을 생성합니다. 이 연구에서는, 실험 결과는 PTM 교차 대화를 검출하고 평가의 가능성을 문서화했습니다. 이 표는 워크플로의 타임라인과 필요한 샘플 및 단백질의 양을 보여줍니다.원포트 방법은 반으로 수행될 수 있으며 이러한 대체 방법으로 샘플 수의 절반을 수행할 수 있습니다. 수정된 펩티드 영역에 대한 변형의 중앙계수는 단일 PTM 및 직렬 PTM 농축보다 원포트 방법에서 낮았다. 1pot PTM 및 단일 PTM 농축 방법을 비교하는 동안 두 수정에 대한 사이트 수준 정량화의 상관 관계 사이에 주목할 만한 차이는 보이지 않았습니다.이 그림은 성공적인 농축에서 데이터를 표시하고 PTM 크로스 토크를 시각화하는 다중 및 상이한 아실 수정을 포함하는 펩티드에 대한 예를 보여 줍니다. 펩타이드는 하나의 리신 잔류물위에 아세틸화되었고, 다른 하나는 다른 쪽에서 간결하게 되었고, 여기서도 동일한 펩타이드가 두 리신에서 수축되었다. 이는 동일한 리신 잔류물이 두 아실레이션 그룹으로 수정될 수 있으며 해당 사이트에서 상호 대화가 발생할 가능성이 있음을 보여줍니다.각 샘플이 동일한 양의 구슬을 포함하고 펩티드 본드 구슬을 세척할 때 실수로 비드를 흡입하지 않도록 하는 것이 필수적입니다. Spectronaut와 같은 소프트웨어 도구의 대량 분석 기반 프로파일링 및 데이터 분석은 이 절차에 따라 수행되어 PTM의 사이트 현지화를 식별, 정량화 및 수행합니다. 동시 PTM 농축과 함께 이 데이터 독립적인 인수 워크플로우는 PTM 상호 대화를 보다 효율적으로 평가하고 PTM 시그널링의 관련성에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

simultaneous-affinity-enrichment-two-post-translational-modifications

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

여기에 우리가 현재 proteogenomic 도구 포고와 빠른, 양적, 포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 프로토콜 사용 참조 게놈에 질량 분석을 통해 식별 하는 펩 티 드의 매핑. 이 도구는 사용 하 여 통합 및 proteogenomic 및 개인 proteomic 연구와 직교 게놈 데이터 시각화의.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

학습하세요 항체를 이용한 다중 번역 후 수정 동시 농축 및 데이터 독립적 취득 질량 분석법으로 아세틸화와 석시닐화를 정량화하고 부위를 특정하는 방법을. 이 기법은 소량 샘플로도 높은 재현성을 제공합니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

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