히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

본 프로토콜의 전반적인 목표는 유전자 발현 조절 및 염색체 응축과 같은 염색질 생물학에서 필수적인 역할을 하는 히스톤 번역 후 수식의 상대적 풍부도를 평가하기 위한 간단한 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 특정 세포 또는 조직의 자극이나 처리 시 어떤 히스톤 수식의 상대적 풍부도가 변화하는지와 같은 염색질 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용하여 단 한 번의 분석으로 알려진 단백질 상의 알려진 대부분의 PTM을 동시에 정량할 수 있다는 점입니다. 히스톤 수정 분석은 약물 처리 또는 스트레스 상황에서 개체 또는 모델 시스템의 후성유전학적 변화와 염색질 작동을 추정하는 것을 포함하여 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. Simone 외에 저희 실험실의 다른 두 명의 구성원이 이 프로토콜의 절차를 시연할 예정입니다.

연구 전문가인 Natarajan Bhanu와 대학원생 Kelly Karch입니다. 이 워크플로우에서 보여주듯이, 본 프로토콜은 세포 배양물 또는 조직으로부터의 히스톤 정제, 히스톤 유도체화, 소화 및 탈염, 그리고 나노플로우 액체 크로마토그래피를 이용한 질량 분석법 분석을 포함하는 10단계 과정으로 구성됩니다. 본 영상에서는 선택된 절차만을 시연합니다.

온전한 세포에서 핵을 분리하는 절차를 시작하려면, 이전에 수확하여 -80 °C에서 보관한 세포를 얼음 위에서 해동하십시오. 그리고 프로토콜 본문에 설명된 대로 핵 분리 버퍼(nuclear isolation buffer, NIB)를 준비합니다. NIB 부피의 5분의 1을 덜어내어 NP-40 Alternative를 최종 농도 0.2%가 되도록 첨가하십시오. 나머지 5분의 4 부피는 세척용으로 사용됩니다.

세포 펠릿 부피 대비 버퍼 부피 1:10 비율로 NP-40 Alternative가 포함되지 않은 NIB를 사용하여 세포 펠릿을 세척합니다. 700 RCF에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 얼음 위에 놓고 세포 펠릿 부피 대비 버퍼 부피 1:10 비율로 0.2%NP-40 Alternative가 포함된 NIB를 첨가하여 세포 펠릿을 용해합니다.

피펫팅을 부드럽게 하여 세포를 균질화합니다. 균질화된 세포를 얼음 위에서 5~10분 동안 배양하여 세포를 용해시키고 핵을 방출시킵니다. 4°C에서 1000 RCF로 5~10분 동안 원심분리합니다.

펠릿에는 주로 세포핵이 포함되며, 상층액에는 주로 세포질 성분이 포함됩니다. 필요한 경우 세포질 분획을 저장하십시오. 펠릿 부피 대비 버퍼 부피의 비율을 1:10으로 하여 NP-40 Alternative가 포함되지 않은 NIB로 핵 펠릿을 부드럽게 재현탁함으로써 세척합니다.

4°C에서 1000 RCF로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 핵 펠릿에서 NP-40 Alternative를 완전히 제거한 후, 핵 부피 대비 황산 부피의 비율을 1:5로 하여 얼음처럼 차가운 0.2 M 황산을 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 핵을 황산에 다시 부유시킵니다.

시료를 4 °C에서 2~4시간 동안 일정하게 회전시키거나 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그 다음, 시료를 4 °C에서 3400 RCF로 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 불용성 물질을 완전히 제거하기 위해 다시 한번 원심 분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

히스톤을 침전시키기 위해, 수집한 상층액에 차갑게 식힌 100% trichloroacetic acid(TCA)를 1:3 부피 비율로 첨가합니다. 샘플이 뿌얗게 변하면 히스톤이 존재함을 의미합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞어줍니다.

혼합물을 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 3400 RCF에서 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 히스톤은 튜브 벽면에 코팅되거나 바닥에 침전됩니다.

튜브의 맨 바닥에는 주로 비히스톤 단백질과 기타 생체 분자를 포함하는 흰색의 불용성 펠릿이 형성됩니다. 튜브의 벽면이나 바닥의 펠릿을 긁지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 100% ice-cold acetone 및 0.1% hydrochloric acid로 튜브를 헹구어, 벽면과 바닥에 코팅된 침전 단백질이 충분히 덮이도록 하십시오.

3400 RCF에서 2분 동안 원심분리합니다. 튜브 벽면이나 펠릿을 긁지 않도록 주의하여 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 100% 얼음처럼 차가운 아세톤으로 튜브를 세척한 후 다시 원심분리하고, 벽면이나 펠릿을 긁지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다.

이어서, 프로토콜 본문에 설명된 대로 히스톤 정량 및 순도 분석을 수행합니다. 히스톤 유도체화 전에 역상 HPLC를 이용한 히스톤 변이체의 선택적 분획을 수행할 수도 있습니다. 이 절차는 히스톤 샘플을 40 µL의 50 mM 중탄산암모늄(pH 8.0)에 용해하는 것으로 시작합니다.

P10 피펫 팁을 흡입 없이 샘플에 넣은 후, 피펫 팁을 pH 지시지에 접촉시켜 pH를 확인합니다. 수산화암모늄과 포름산을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다. 이때부터 프로피온산 무수물을 사용하는 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행해야 합니다.

프로피온산 무수물(propionic anhydride)의 반응성을 유지하기 위해 한 번에 최대 3~4개의 샘플만 처리하십시오. 프로피온산 무수물과 아세토니트릴을 1:3의 부피 비율로 혼합하여 신선한 프로피온화 시약을 준비합니다. 각 샘플에 프로피온화 시약을 1:4의 부피 비율로 첨가하십시오.

수산화암모늄을 빠르게 첨가하여 용액의 pH를 8.0으로 다시 맞춥니다. 일반적으로 시료에 수산화암모늄을 1:5의 부피 비율로 첨가하면 pH 8.0으로 재설정하는 데 적합합니다. 즉시 볼텍싱하여 혼합합니다.

pH를 확인하십시오. 샘플을 상온에서 15분 동안 배양하십시오. 모든 샘플의 프로피오닐화(propionylation)가 완료되면, 진공 농축기를 사용하여 샘플을 10~20 µL까지 건조시키십시오.

최종 부피가 40 µL가 될 때까지 ddH2O로 샘플을 재현탁하거나 희석합니다. 염은 액체 크로마토그래피와 질량 분석을 방해하므로, 분석 전에 샘플의 탈염 과정을 거쳐야 합니다. 본 영상에서는 스테이지 팁(stage-tip)의 제작 과정만을 시연합니다.

P1000 피펫 팁을 사용하여 고상 추출 디스크에서 C18 재료 디스크를 펀칭하여 떼어냅니다. 용융 실리카 모세관을 사용하여 미니 디스크를 P1000 팁에서 밀어내어 P100 또는 P200 피펫 팁의 바닥으로 옮깁니다. 디스크가 팁 바닥에 단단히 고정되었는지 확인하십시오.

25 µg 이상의 샘플을 탈염하는 경우, 동일한 P100 또는 P200 팁에 두 개의 C18 mini-disk를 사용하십시오. 1.5 또는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브 내에서 스테이지 팁을 고정하기 위해 원심분리 어댑터를 사용하십시오. C18 물질을 활성화하고 잠재적인 오염 물질을 제거하기 위해 50 µL의 100% acetonitrile로 스핀하여 레진을 세척하십시오.

이후 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 시료 탈염을 수행합니다. 히스톤 펩타이드는 다양한 동중량(isobaric) 형태로 존재합니다. 히스톤 분석에서 흔히 발견되는 두 가지 사례가 제시되어 있습니다.

위에 표시된 전구체 질량 및 상대적 동위원소의 추출 이온 크로마토그램은 동일합니다. 그러나 아래에 표시된 생성 이온의 추출 이온 크로마토그램을 통해 두 등중량 형태를 구분할 수 있습니다. 두 종의 상대적 함량을 추정하려면 빨간색으로 강조 표시된 고유한 조각 이온만을 사용해야 합니다.

레티노산 자극 여부에 따른 인간 배아줄기세포 추출 히스톤을 분석하였습니다. 두 가지 히스톤 H3 펩타이드의 상대 정량 분석 결과, 분화를 위해 자극을 준 인간 배아줄기세포에서 아세틸화가 뚜렷하게 감소한 것이 확인되었습니다. 이는 분화 중인 세포에 비해 배아줄기세포에서 아세틸화 수준이 더 높다는 기존의 보고와 일치하는 결과입니다.

이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 3일 만에 완료할 수 있습니다. 첫째 날은 히스톤 추출, 둘째 날은 단백질 유도체화 및 소화, 셋째 날은 펩타이드 유도체화, 스테이지-팁 처리 및 LC-MS 분석을 진행합니다. 히스톤 정제 과정은 펩타이드 분석 외에도 조합 히스톤 수식(combinatorial histone modifications)의 특성을 규명할 수 있는 미들다운(middle-down) 및 탑다운(top-down) 프로테오믹스를 포함한 다른 목적으로 활용될 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용하여 히스톤 번역 후 수식화(post-translational modification)를 식별하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.