히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유전자 발현 조절 및 염색체 응축과 같은 염색질 생물학에서 필수적인 역할을 하는 히스톤 번역 후 변형의 상대적 풍부함을 평가하기 위한 간단한 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 염색질 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 어떤 히스톤 변형이 주어진 세포 또는 조직의 자극 또는 치료에 대한 상대적 풍부도를 변화시킵니다.

이 기술의 주요 장점은 질량 분석 기반 단백질체학을 사용하여 단일 분석에서 알려진 단백질에 대해 알려진 대부분의 PTM을 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다. 히스톤 변형 분석은 약물 치료 또는 스트레스에 대한 개인 또는 모델 시스템의 후성유전학적 변화 및 염색질 작동 추정을 포함하여 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. Simone 외에도 제 연구실의 다른 두 명의 구성원이 이 프로토콜의 절차를 시연할 것입니다.

연구 전문가인 Natarajan Bhanu와 대학원생인 Kelly Karch. 이 워크플로우에서 볼 수 있듯이 이는 세포 배양 또는 조직에서 히스톤 정제, 히스톤 유도체화, 분해 및 탈염, 나노 플로우 액체 크로마토그래피를 사용한 질량 분석 분석을 포함하는 10단계 프로토콜입니다. 이 비디오에서는 선택한 절차만 시연합니다.

온전한 세포에서 핵을 분리하는 절차를 시작하려면 이전에 수확하여 섭씨 영하 80도에서 보관한 세포를 얼음 위에서 해동합니다. 그리고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 핵 분리 버퍼(NIB)를 준비합니다. NIB의 1/5 부피를 제거하고 0.2%The 잔여 4/5 부피의 최종 농도에 NP-40 대안을 첨가하십시오.

NP-40 대안 없이 세포 펠릿 부피 대 완충액의 1:10 비율을 사용하여 NP-40 대안 없이 세포 펠릿을 세척합니다. 700 RCF에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 얼음 위에 넣고 세포 펠릿 부피 대 완충액의 1:10 비율로 0.2%NP-40 Alternative가 포함된 NIB를 첨가하여 세포 펠릿을 용해합니다.

부드러운 피펫팅으로 세포를 균질화합니다. 균질화된 세포를 얼음 위에서 5-10분 동안 배양하여 세포가 용해되어 핵을 방출하도록 합니다. 섭씨 4도에서 5-10분 동안 1000RCF에서 원심분리기.

펠릿은 대부분 세포핵을 포함하고 상등액은 대부분 세포질 성분을 포함합니다. 원하는 경우 세포질 분획을 저장합니다. NP-40 Alternative 없이 펠릿 부피 대 완충액 부피의 1:10 비율을 사용하여 NP-40 대안 없이 NIB를 부드럽게 다시 현탁시켜 핵 펠릿을 세척합니다.

섭씨 4도에서 5분 동안 1000RCF에서 원심분리기를 제거하고 상층부를 제거합니다. NP-40 Alternative가 핵 펠릿에서 완전히 제거된 후, 핵 부피 대 황산 부피의 1:5 비율로 얼음처럼 차가운 0.2 몰 황산을 첨가합니다. 부드러운 피펫팅으로 황산의 핵을 다시 현탁시킵니다.

샘플을 계속 회전시키거나 섭씨 4도에서 2-4시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 3400RCF에서 5분 동안 샘플을 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 다시 원심분리기를 만들고 상층액을 새 튜브로 옮겨 불용성 물질을 제거합니다.

히스톤을 침전시키기 위해, 100 : 3 부피 비율로 수집 된 상등액에 냉각 된 100 % 트리클로로 아세트산 또는 TCA를 첨가하십시오. 히스톤의 존재는 샘플이 흐려지는 것으로 표시됩니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞습니다.

혼합물을 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 3400 RCF에서 5분 동안 원심분리기. 원심 분리 후, 히스톤은 튜브의 측면을 코팅하고 바닥에도 침전됩니다.

흰색의 불용성 펠릿은 또한 튜브의 맨 아래에 형성되며, 여기에는 대부분 비 히스톤 단백질 및 기타 생체 분자가 포함되어 있습니다. 튜브의 측면이나 튜브 바닥의 펠릿을 긁지 않고 흡인으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 100% 얼음처럼 차가운 아세톤과 0.1% 염산으로 튜브를 헹구어 측면과 바닥을 코팅하는 침전된 단백질을 덮습니다.

3400 RCF에서 2분 동안 원심분리기. 측면이나 펠릿을 긁지 않고 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 튜브를 100% 얼음처럼 차가운 아세톤으로 헹구고 다시 원심분리기를 하고 측면이나 펠릿을 긁지 않고 상층액을 제거합니다.

그 후, 히스톤 정량화 및 순도 분석은 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 수행됩니다. 역상 HPLC에 의한 히스톤 변이체의 선택적 분별은 히스톤 유도체화 전에 수행할 수도 있습니다. 히스톤 샘플을 40 마이크로 리터의 50 밀리 몰 중탄산 암모늄, pH 8.0에 용해하여이 절차를 시작하십시오.

흡인 없이 P10 피펫 팁을 샘플에 삽입하고 피펫 팁을 pH 지시 스트립에 접촉하여 pH를 확인합니다. 수산화암모늄과 포름산을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다. 여기서부터 프로피온성 무수물의 사용과 관련된 모든 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다.

프로피온성 무수물을 반응성 상태로 유지하기 위해 한 번에 최대 3-4개의 샘플을 처리합니다. 프로피온 무수물(propionic anhydride)과 아세토니트릴(acetonitrile)을 1:3의 부피 비율로 혼합하여 새로운 프로피오닐화 시약을 준비합니다. 프로피오닐화 시약을 각 샘플에 1:4의 부피 비율로 추가합니다.

수산화암모늄을 빠르게 첨가하여 용액에 pH 8.0을 재설정합니다. 일반적으로 1:5의 부피 비율로 샘플에 수산화암모늄을 첨가하면 pH 8.0을 다시 설정하는 것이 적절합니다. 볼텍싱으로 즉시 혼합하십시오.

pH를 확인합니다. 샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 모든 샘플이 프로피오닐화를 거친 후 진공 농축기에서 샘플을 10-20마이크로리터로 건조시킵니다.

40마이크로리터의 최종 부피에 도달할 때까지 ddH20으로 샘플을 다시 현탁시키거나 희석합니다. 염은 액체 크로마토그래피와 질량 분석법을 방해하기 때문에 분석 전에 샘플을 탈염해야 합니다. 이 비디오에서는 스테이지 팁의 구성만 시연합니다.

P1000 피펫 팁을 사용하여 고체상 추출 디스크에서 C18 물질 디스크를 펀칭합니다. 용융 실리카 모세관을 사용하여 미니 디스크를 P1000 팁에서 P100 또는 P200 피펫 팁 바닥으로 밀어 넣습니다. 디스크가 팁 아래쪽에 단단히 끼워져 있는지 확인합니다.

25마이크로그램 이상의 시료를 탈염하는 경우 동일한 P100 또는 P200 팁에 두 개의 C18 미니 디스크를 사용하십시오. 원심분리기 어댑터를 사용하여 스테이지 팁을 1.5 또는 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 제자리에 고정합니다. 50마이크로리터의 100% 아세토니트릴로 회전시켜 수지를 세척하여 C18 재료를 활성화하고 잠재적인 오염 물질을 제거합니다.

샘플 탈염은 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 이후에 수행됩니다. 히스톤 펩타이드는 다양한 등압 형태로 존재합니다. 히스톤 분석에 일반적으로 풍부한 두 가지 예가 표시됩니다.

위에 표시된 전구체 질량과 상대 동위원소의 추출된 이온 크로마토그램은 동일합니다. 그러나 아래에 표시된 생성물 이온의 추출된 이온 크로마토그램은 두 가지 등압 형태를 구별할 수 있습니다. 빨간색으로 강조 표시된 고유한 단편 이온만 사용하여 두 종의 상대적 풍부도를 추정해야 합니다.

레티노산 자극이 있거나 없는 인간 배아 줄기 세포에서 추출한 히스톤을 분석했습니다. 두 히스톤 H3 펩티드의 상대적 정량화는 분화를 위해 자극된 인간 배아 줄기 세포에서 아세틸화의 명확한 감소를 보여주었습니다. 이는 분화 세포와 비교하여 배아 줄기 세포에서 더 높은 아세틸화에 대한 이전 보고와 일치합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 안에 완료할 수 있습니다. 하루는 히스톤 추출, 둘째 날은 단백질 유도체화 및 분해, 셋째 날은 펩타이드 유도체화, 스테이지 티핑 및 LC-MS 분석. 히스톤 정제는 펩타이드 분석 이외의 다른 목적으로 활용될 수 있으며, 여기에는 중간-하향식 및 하향식 단백질체학을 포함하여 조합 히스톤 변형을 charactarize할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 질량 분광법 기반 단백질체학을 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 식별하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.