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이 작품은 NIH 보조금 (DP2OD007447, R01GM110174 및 R01AI118891)에서 자금에 의해 지원되었다.

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 비용, 시간 및 성능을 고려하여 최적화된다. 다른 제제는 가능하지만, 특히 MS 분석을 결합하는 경우에는 한계가있다. 예를 들어, 높은 소금 추출 프로토콜 히스톤 26 대신 TCA 침전 ((3))를 정제하기 위해 사용될 수있다. 이 강산성을 사용하지 않기 때문에 높은 염 프로토콜은 본질적 온화하다. 이 산해리 PTMS 보존 및 TCA 침전으로 추출 히스톤의 수율을 증가 여러 염색질 결합 단백질을 공동 침전. 그러나, 높은 소금 추출 HPLC-MS / MS에 대해 너무 농축시켜 염을 함유하는 샘플을 이끈다. 트립신 배양 시간 및 효소 / 기판 (27)의 비율 감소 또는 소화 효소로는 argc 28-30를 사용하여, 예를 들어 - 다른 제제에서, 히스톤 소화는 propionylation (8 섹션 6)없이 수행 될 수있다. 그러나, 프로피온산 무수물 유도체 내가 같이 추천t 더 나은 액체 크로마토 그래피 동안​​ 유지됩니다 소수성 펩타이드의 생성으로 이어집니다. 화학 유도체를 들어, 유기산 무수물의 다양한 평가되었으며, 그 장점은 포괄적 18에 대해 논의했다. 그럼에도 불구하고, 프로피온산 무수물 효율성을 최소화 측 제품 및 개선 펩타이드 소수성 사이의 최고의 타협을 입증했다. 잠재적으로, 프로피온산 무수물은 동위 원소 표지 된 형태로 구입할 수 있습니다; 이는 다수의 시료를 혼합하고 무거운 라벨에 부여 상이한 질량에 기초하여 MS의 레벨을 판별의 가능성 다중 분석을 허용한다. 그러나 이러한 분석은 LC-MS 크로마토 그램의 증가 된 복잡성을 초래하고 각 단일 조건 주입 될 수있는 샘플의 양을 감소시킨다. 이와 관련하여, 프로토콜의 몇몇 중요한 측면이 강조되어야한다. 다음은 CH 표기부정적인 결과가 얻어진 경우에는 절차를 수행하는 오류를 발견 ecklist. 우선 핵 침전 후의 펠릿을 조심스럽게 대체 NP-40 (혼합 중에 기포의 부족 띄는) 세제 완전히 제거 될 때까지 (2.10)없이 NIB로 세척한다. 그렇지 않을 경우 산과 히스톤 추출을 손상 것이다. 둘째, TCA와 히스톤 침전 (섹션 3.9) 아세톤 펠렛의 세척 후 중요하다. propionylation 및 소화 (6.1 절)을 직접 수행하는 경우 농축 된 산의 존재는 다음과 같은 단계를 끼칠 것입니다. (섹션 5를) 수행되는 경우 히스톤 분류에없는 문제가 될 것입니다. (- 6.7 섹션 6.3) 셋째, 상기 propionylation 반응이 신속하게 수행하는 것이 필수적이다. 4 연속 샘플 -이를 위해 3 개 이상의 동일한 propionylation 믹스 (프로피온산 무수물 + 아세토 니트릴)를 사용하지 마십시오. 또한, pH는 트립신 분해 (7)의 가장 중요한 측면이다. 그렇지 않은 경우8.0 (7.5-8.5) 주위에 소화 효과가있을 것입니다. 샘플이 단계에서 프로피온산이 풍부 할 것 같은이 발생할 수 있습니다. NH 4 OH 필요까지 추가 할 수 있습니다. 또한, 프로테오믹스 워크 플로우에 익숙한 연구자는 트립신의 소화를 종료 샘플을 산성화 정상 느낄 것이다. 그 다음 반응, 즉, 펩타이드 N 말단 (8.1 절)의 propionylation을 위태롭게하므로 이것은 수행 할 수 없습니다. 마지막으로, 같은 문제에서는, 수정되지 않은 펩타이드가 실제로 변성되지 않는 데이터 분석을 위해 기억하는 것이 중요하다; 모두 무료 리신 잔기 및 N- 말단은 propionylation (56.026 다)에 의해 점유 될 것이다. 이와 같이, 단백질 서열에 고유하게 대응하는 중량의 추출, 이온 크로마토 그래피를 수행하는 단계없이 결과를 가져올 것이다. 방법의 제한은 실제 abun 달성의 편향으로 인해 짧은 펩티드 서열에 조합 PTMS 검출 불능에 주로 관련 있으며다른 변형 된 형태의 펩티드는 상이한 효율로 이온화 할 수 있다는 사실로 인해 변형 댄스. 첫 번째 문제는 중간 또는 다운 (16 평가) 하향식 접근법이 기술을 조합함으로써 해결할 수있다. 하더라도 기술적으로 더 어려운, 이러한 유형의 분석은 수정 공존 주파수를 연구하는데 적합하다. 또한, 일부 펩타이드 다른 히스톤 변형에서 동일한 서열을 갖기 때문에 항상 상향식으로 달성 될 수 없다 히스톤 변형, 더 잘 구별 할 수있다. 이온화 효율과 관련된 두 번째 문제는, 합성 펩티드 (31)의 라이브러리를 사용하여 해결 될 수있다. 이 접근법은 히스톤 PTMS의 상대적인 풍부함의보다 정확한 추정을 보장한다. 그러나, 대부분의 실험에서, 원하는 결과는 분석 조건 사이의 주어진 변형의 상대적 변화이다. 이 경우, 이러한 보정으로 인해 모든 샘플은 동일한 BIA를 가지고 있다는 사실에 필요하지 않다에스. 결론적으로,이 프로토콜은 탠덤 MS에 결합 NLC를 사용하는 일에 완료 할 수 있습니다 히스톤 PTMS의 분석이 가능합니다. MS가 아닌 다른 기술과의 비교 예들이 처리량에도 거의이 수준을 달성 할 수 도입부에서 논의 된 바와 같이 항체 기반 전략을 사용하여, 적합하지 않다. 또한, 항체 기반 기술은 새로운 변형의 발견을 허용하지 않지만, 이들은 단독으로 확인 및 정량 예측 부호에 기초한다. 우리는 따라서 튜닝 유전자 발현의 주인공이다 히스톤 마크의 규정을 알고에 의한 직관적 인 장점 프로테오믹스 실험실에서 인기를 얻을 따라서 프로테옴의 조절에 영향을 미칠 것입니다 히스톤 펩티드에 그 상향식 (bottom-up)의 단백질 체학을 추측. 또, 프로토콜이 기재된 LABORA에도 히스톤 분석 더 단순하게 데이터 분석을위한 시료 준비 및 소프트웨어의 최근 개선 포함hypermodified 펩티드의이 유형의 특성을 경험 한 적이 토리.

후성 유전학은 기본 DNA 서열 1을 변경 이외의 다른 메커니즘에 의해 발생하는 유전자 발현의 유전 적 변화의 연구로 정의된다. 유기체 극적인 표현형은 DNA의 내용이 변경되지 않는 경우에도 변경 겪는으로 성적인 규제는 개발하는 동안 중요합니다. 다른 메커니즘 (2)을 통해 유전자 발현에 영향을 미치는 각각의 히스톤 번역 후 변형 (PTMS), 히스톤 변형, 비 - 코딩의 RNA, DNA 메틸화와 DNA 결합 요소를 포함하여 적절한 후성 유지에 필요한 몇 가지 중요한 구성 요소가있다. 예를 들면, DNA 메틸화 상태가 유전자 번역 3, 히스톤 변형 및 히스톤 PTMS 더 동적이며 4 가지 다양한 염색질 영향을 억압 할 수 매우 안정 변형이다. 이들이 가장 노출가요 영역만큼 히스톤 PTMS 대부분의 N 말단 꼬리에서 지역화단백질. 그러나, 뉴 클레오 핵심은 크게 평균 단백질 5에 비해 수정됩니다. 히스톤 마크가 광범위하게 지난 10 년을 특징으로되어 있지만, 알려진 히스톤 마크와 그 기능 사이에 많은 링크는 여전히 불분명하다. 이것은 대부분의 히스톤 PTMS이 전사 -6,7- 같은 특정 프로세스를 변경하기 위해 다른 PTMS ( &quot;크로스 토크&quot;)와 협력하여 기능을 오히려 혼자서 작동하지만하지 않는다는 사실에 주로 기인한다. 예를 들어, 유전자 P21의 조합 마크 H3S10K14ac 두 PTMS 8 하나만 발생하지 않을의 전사를 활성화시킨다. 단백질 HP1 콤팩트는 H3K9me2 / 여기서 Me3을 인식하고 근처의 뉴 클레오에 수정을 확산하여 염색질. 인접 S10 9 인산화 때, HP1은 H3K9me2 / 3 바인딩 할 수 없습니다. H3K4의 아세틸 화는, 분열의 pombe 10 H3K9me2 / 여기서 Me3에 단백질 spChp1의 결합을 억제한다. 또한, 히스톤 라이신 Demethylase PHF8 세 PTMS H3K4me3, K9ac 및 K14ac 11 존재하는 가장 높은 뉴 클레오 결합 효율을 가지고있다. 이러한 예는 히스톤 PTM 변화의 글로벌 개요를 달성하기보다는 하나의 수정에 초점을 맞추고의 중요성을 강조 표시합니다. 서열의 존재는 또한 변형 히스톤 이소 타입은 일반적으로 고도의 유사한 서열을 가지고, 히스톤 분석의 복잡성을 증가 시키지만, 종종 염색질의 서로 다른 역할이있다. 예를 들어, H2A.x보다 쉽게 정규 H2A 12에 비해 DNA 손상시 인산화 된 C 말단 서열을 보유하고, 수컷 마우스 감수 13 성 염색체의 불 활성화에 요구되고; 유사하게, CENP-A는 동원체 (14)에 정식 히스톤 H3를 대체합니다. 서로 다른 기능에도 불구하고, 이러한 변이체는 식별하고 개별적으로 계량하는 것이 어려워, 각 정규 히스톤과의 아미노산 서열의 많은 부분을 공유한다. </p&gt; 예컨대 웨스턴 블 롯팅과 같은 항체 - 기반 기술은 광범위 히스톤을 특성화하기 위해 채택되었다. 그러나, 항체 기반의 접근법은 다음과 같은 이유로 제한된다 : (I)가 유일한 변형의 존재를 확인할 수 알려지지 PTMS를 식별 할 수있다; (ⅱ)들은 의한 결합력에 영향을 미칠 수있는 공존 마크의 존재로 바이어스된다; (ⅲ) 그들은 단지 거의 항체는 목적 (IV)가 매우 유사한 히스톤 변형 또는 유사한 PTMS (예를 들어, 디 - 및 리신 잔기의 trimethylation) 사이에 교차 반응에 사용할 수있는 바와 같이, 조합 마크를 식별 할 수 없습니다. Egelhofer 등. 상업적인 항체의 25 % 이상이 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯에 의해 특이성 테스트를 실패, 특정 항체들 사이에서 20 % 이상 염색질 면역 침전 실험 15에서 실패 것이 기재. 질량 분석 (MS)는 현재 신규 및 / 또는 조합 PTMS을 연구하는 가장 적합한 분석 도구입니다그리고 광범위 (16 평가) 히스톤 단백질에 대해 구현되었다. 이것은 고감도 MS 질량 정확도 및 대규모 분석을 수행 할 수있는 가능성에 주로 기인한다. (- 20 AA 5) 상향식 전략은 그대로 단백질 효소 짧은 펩티드로 분해되는 것을 특징으로 히스톤 특성 및 PTMS 대한 가장 일반적으로 사용되는 MS 기반 프로테오믹스 전략이다. 이 소화 LC 분리 및 MS 검출 모두를 용이하게한다. 600의 범위에서 대중 - 2000 다 일반적으로 더 쉽게 이온화 큰 질량보다 높은 질량 정확도와 해상도로 식별됩니다. MS / MS 단편화는 짧은 펩티드는 일반적으로 충돌 유도 해리 (CID)에 적합하다, 개선된다. 그들은 높은 염기성 아미노산 잔기, 즉, 라이신과 아르기닌이 풍부한된다 그러나, 히스톤은 상향식 MS에 대한 도전을 제시한다. 따라서, 트립신 소화도 SM 펩티드의 생성에 이르게모든 LC 보유하고 PTMS의 명확한 파악합니다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리의 프로토콜은 라이신과 펩티드 N- 말단 화학 유도체 (17)를 포함한다. 프로피온산 무수물의 사용은 다른 시약 (18)에 비해 효율적인 화학 유도체하는 것이 좋습니다. 트립신만을 아르기닌 잔기의 C 말단에서 단백질 분해를 수행 할 수 있도록 이러한 유도체 블록 변성 및 모노 리신 잔기의 ɛ 아미노기를. 아민 유도체의 용액으로 양성자 교환 할 수없고, 따라서 펩티드는 일반적으로 단지 이중 또는 삼중 MS 및 MS / MS 검출을 용이하게 충전된다. 또한, N 말단 펩티드 유도체는 소수성 때문에 역상 크로마토 보존 증가시킨다. 여기서 우리는 히스톤 정화 및 상향식 (bottom-up) 프로테오믹스 (그림 1)를 통해 PTM 분석을 준비 할 워크 플로를 설명합니다. 이 전략은 하나의 히스톤 마크와 조합 마크 (F)의 정량화를 달성아미노산 서열에서 비교적 가까운 또는 히스톤 PTMS.

<table><tbody><tr><td>트립신 0.25 % EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td> 세포 <td>수확 용</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘, 무수</td><td>시그마</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>인비트로젠</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>EMD 밀리포어 코프</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로시스틴</td><td>시그마</td><td>M4194</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease 및 Phosphatase 억제제 칵테일, EDTA 무함유 (100개)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>NP- 40 대체</td><td>CALBIOCHEM</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>황산, ACS 등급</td><td>Fisher Chemical</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>시그마</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Biorad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드/bis 29:1 &#8212; 500ml</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie</td><td>Fisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>C18 컬럼 (5 &#181; m) 2.1&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>그레이스</td><td>218TP52</td><td></td></tr><tr><td>C18 컬럼 (5 &#181; m) 4.6&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>그레이스</td><td>218TP54</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 아세토니트릴</td><td>피셔 케미컬</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모</td>늄 <td>시그마</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>프로피온 무수물</td><td>Sigma</td><td>240311</td><td></td></tr><tr><td>시퀀싱 등급 수정 트립신</td><td>Promega</td><td>PRV5113</td> MS 아세트산 Sigma 49199 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 추출 디스크</td><td>Empore</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Formic</td><td>Acid Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr>의 히스톤 소화용</tbody></table>

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

뉴 클레오 히스톤 단백질의 옥타 감싸 DNA의 147 염기쌍 이루어지는 염색질의 최소 구성 단위이다. 히스톤 기능은 핵 단백질의 무수한에 의해 광범위한 번역 후 변형에 의해 매개된다. 그들은 유전자 조절, DNA 수리 및 염색체 응축에 관여 크로 마틴 구조 및 모집 효소를 조절 이러한 수정은 핵 무결성을 위해 중요하다. 과학계의 큰 부분은 히스톤 PTM 풍부의 특성을 항체 기반 기술을 채택하더라도 에피토프가 근처의 수정에 의해 차단 될 수 있습니다로, 이러한 접근 방식은, 낮은 처리량과 hypermodified 단백질에 대한 편견이다. 이 프로토콜은 히스톤 변형의 정확한 정량 나노 액체 크로마토 그래피 (NLC)와 질량 분석기 (MS)를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 히스톤 PTMS의 큰 다양성과 여러 히스톤의 상대적 풍요의 특성을 설계의 내 변종화롯불은 분석한다. 길이 20 AA -이 프로토콜에서, 히스톤 5의 펩티드를 생성하기 위해 트립신 소화 하였다 프로피온산 무수물로 유도된다. 소화 후, 히스톤 펩티드의 새롭게 노출 된 N 말단은 NLC-MS 크로마토 그래피 동안​​ 유지를 향상시키기 위해 유도된다. 이 방법은 크기의 네 주문에 걸친 히스톤 PTMS의 상대적 정량이 가능합니다.

예를 들어, 우리는 200 ㎕의 세포 펠렛 개시와 레티노 산 (RA) 자극없이 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)로부터 추출 된 히스톤을 분석 하였다. 세포 배양에서 RA의 존재는 ESC 차별화로 연결됩니다. 히스톤 펩티드의 다중 LC-MS 주사를 수행하기에 충분한 것보다 더 히스톤 100㎍을 추출하고, - 세포 펠렛 약 50부터. 유도체 소화 및 탈염 한 후, 시료에 연결된 마이크로 유체 칩 고성능 액체 나노 크로마토 그래피 시스템에 연속 모드에서 75 μm의 X 15cm C 18 컬럼 (입자 직경이 3 μm, 기공 크기 300 Å) 상에 로딩 하였다 하이브리드 선형 트랩 사중 극자 - orbitrap 질량 분석기. MS 획득은 DIA를 사용하여 수행 하였다. 병행하여, 샘플은 또한 하이브리드 이온 트랩 질량 분광계 orbitrap에 결합 된 나노 - 플로우 UHPLC DDA를 이용한 방법으로 분석 하였다 (데이터는 보이지 않음). 에서각주기는 하나의 전체 MS orbitrap 검출 1,400 m / Z, 6. 그런 다음 데이터에 의존 획득 모드는 동적으로 적용 하였다 (10)의 60,000 AGC (m / z 200)과의 해상도에 290의 스캔 범위 하였다 30 초의 배제. MS / MS 스캔이 가장 강한 것과 부모 이온에 추적 관찰 하였다. 하나의 전하 상태에 이온 MS / MS에서 제외 하였다. 2m / Z의 분리 창을 사용 하였다. 이온은 35 %의 충돌 에너지와 충돌 유도 분해 (CID)를 사용하여 단편화 하였다. 이온 트랩 검출 (10) (4)의 AGC 정상 스캔 범위 모드와 정상 스캔 속도로 사용되었다. 원시 MS 데이터, 즉 23 EpiProfile (22)의 스카이 라인, 전구체 및 조각 이온 크로마토 그램의 추출을위한 소프트웨어를 채택 분석 하였다. 이 때문에 격려의 이전 지식 지능형 피크 면적 추출을 통합으로 EpiProfile는 히스톤 펩티드에 최적화 된조류 체류 시간. 한편, 스카이 라인 DIA 분석에 최적화되어, 따라서 표시되는 DIA 수치 (도 4, 5A)이 소프트웨어의 스크린 샷이다. 추출 된 이온 크로마토 그램에서 곡선 아래 면적을 취득하며, 이는 각각의 펩티드의 풍부함을 추정하는데 사용된다. 크로마토 그래피 피크의 면적은 [M + H] +에 대한 계산 된 [M + 2H] 2+ 및 [M + 3H] 같은 펩티드 3+ 이온 심지어 대부분의 [M + 2H] 비록 2+ 널리 퍼진 형태였다. 이 펩티드의 주어진 수정 된 형태의 원시 풍요 로움을 제공합니다. PTMS의 상대적인 풍부함을 달성하기 위해, 히스톤 펩타이드의 모든 다른 변형 된 형태의 합계가 100 %로 간주하고, 특정 펩티드의 면적은 그것의 변형 된 형태 모두에서 히스톤 펩티드에 대한 전체 면적으로 나누어 . 히스톤 펩타이드는 버지니아에 존재동중 형태의 riety (그림 5). 등압 펩티드, 예 K18ac 및 K23ac 만 독특한 단편 이온이 등압 종 (도 5a 및도 5b)의 비율을 결정하는데 사용되는 MS / MS 수준에서 정량화 할 수있다. 이 비율은 두 종류의 크로마토 그래피 피크의 영역을 분할하는 데 사용된다. DDA를 사용하는 경우 이러한 펩티드는 표준 DDA 실험에서 발생할 것이다, 그들의 전체 용출 통해 조각화 선정 할 필요가 있기 때문에,이 등압 형태, 표적 질량의리스트에 포함되었다. 등압 종의 상대적인 풍부함의 차별은 단편 이온의 용출 프로파일을 모니터링함으로써 수행된다. 한편, 취득 DIA 형식은 포함 목록을 요구하지 않는다. 그러나, 획득 방법이 유형은 알 변형 펩타이드를 발견하지 못할 수도 따라서 기존 데이터베이스 검색과 호환되지 않으며,. <p clFO 엉덩이 = &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 라이신 아세틸 (+ 42.011 다)는 높은 해상도 MS 수집 (&gt; 30,000)를 사용하여 거의 등압 trimethylation (+ 42.047 다) 구별 하였다. 또한, 아세틸 나중에 각각의 트라이 메틸화 것보다 아세틸 펩타이드의 용출로 이어지는 trimethylation보다 더 소수성이다. 동일한 펩타이드의 개질 된 형태로 인해 라이신 propionylated된다는 사실에도 나중에 용출. 요약하면, 하나의 수정 사이트와의 펩티드를위한 소수성의 순서는 디이고 트라이 메틸화 &lt;아세틸 &lt;수정되지 않은 (propionylated) &lt;monomethylated (propionylated). 분화 (도 6a 및 6b)에 대한 자극이 때 hESCs는 아세틸 화 펩티드의 명확한 감소가 나타났다. 이전의 결과는 차별화들 (25)에 비해는 ESC에 더 높은 아세틸를보고 이것은 놀라운 일이 아니었다능성 염색질의 일반적으로 허용 성격을 반영. 히스톤 H3에 초점을 맞춤으로써, 35 가지 변형 된 형태 (그림 6C) 정량화 하였다. 그러나이 방법으로 조사 할 수있는 모든 히스톤 proteoforms 200 개 이상의 모든 히스톤 변형 및 낮은 풍부한 변형 (데이터 미도시)을 포함한다. 또한, 분석은 (± 표준 편차를 나타냄) 오차 막대의 작은 크기에 의해 입증되는 바와 같이, 재현성이 기술 복제 사이 얻을 수있는 것을 나타냈다. 함께이 섹션에서는 NLC-MS 데이터를 사용하여 히스톤 변형 된 펩타이드의 상대적인 풍요를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> 그림 1. 상향식 MS / MS 분석 히스톤 흐름은 히스톤 분석 10 단계는 각 단계에 필요한 시간의 추정을 포함하여 도시된다.<html> 섹션 번호는 원고 본 같이 괄호로 주어진다. 특정 변형의 고감도 분석에 대한 필요가없는 다양한 히스톤 변형 분리 샘플 분획을 설명하는 제 5 항은 생략 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">이 도면의 확대를 보려면 여기를 클릭하세요.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> 그림 2 : 히스톤 변형 분별와 쿠마 젤에 대한 역상 고 유량 LC (A) 그대로 히스톤 분리를 나타내는 LC-UV 크로마토 그램.. 히스톤 H3 변이체는 용출 시간에있어서 서로 구별 될 수있다. 분획을 자동 분획 수집기를 이용하여 수동으로 또는 수집 될 수있다. 히스톤 정제 세 복제의 (B) 쿠마 겔.= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> 그림 3 :. P1000 피펫 팁으로 플러그 스테이지 - 팁의 제작은 고상 추출 디스크 (제 2 패널)에서 C (18) 재료로 만들어진 디스크를 펀치. 이 모세 혈관의 종류를 사용하여 작은 P100 / 200 피펫 팁으로 압출 될 수 있도록 미니 디스크는 팁 (중간 패널)에 부착된다. 이 예에서는 700 ㎛의 외경 용융 실리카 튜브를 사용했다. 미니 디스크은 (는) 더 (마지막 패널) 갈 수있을 때까지 P100 / 200 피펫 팁의 바닥에 밀어해야합니다. 그것은 다수의 복제를 위해 충분한 샘플 물질을 유지하기에 충분한 용량을 갖고, 상기 스테이지 팁 히스톤 탈염을위한 준비이다. SA의 20 μg의 - 특히, 하나의 미니 디스크 (15)에 대한 충분하다mple. 더 많은 샘플이 필요한 경우, 여러 디스크가 서로에 포장 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> 그림 4 :. DDA를 사용하는 경우 DDA 및 DIA 방법의 개략도는 MS 스캔 사이클은 그 강도와 충전 상태에 따라 MS / MS 분열에 대한 전구체 이온의 순차적 인 선택에 의해 특징입니다. 전구체 이온 단편화되면 MS 덜 풍부한 신호로 &quot;파기&quot;할 수 있도록, 동일한 펩타이드의 반복적 인 선택을 피하기 위해 제외리스트에 놓인다. 이번 인수 방법은 검색 모드에 대한 프로테오믹스에서 선택의 기술이다. 정량 확인 된 MS의 옆에 소정의 이온의 전체 주사 신호를 통합함으로써 달성된다 /MS 스펙트럼. DIA, 전체 m / z 범위는 매 스캔주기에서 조각난된다. 이러한 접근법은 검색 모드 덜 적합하지만, 모든 이온 전구체 및 제품의 크로마토 그래피 프로필을 생성한다. 이 자신감 정량 및 동중 형태의 차별로 연결. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> 그림 5 : 동중 펩타이드의 정량 히스톤 분석에서 일반적으로 풍부한 두 동중 펩타이드 (A) 예.. 추출 된 이온 크로마토 그램 그들의 전구체 질량 (위) 상대적인 동위 원소 (XIC)은 동일하다. 그러나, 생성물 이온 XIC (아래) 두 등압 형태의 차별을 허용한다. 특히, 만 독특한 조각 이온은 우리를해야한다에드는. 두 종의 상대 풍부 추정 (빨간색으로 강조 표시) 두 설명 펩티드의 고유 조각 이온의 (B) 대표. 적어도 하나의 동중 상당을 가진 호모 사피엔스의 일반적 분석 펩타이드 (C) 목록입니다. 순서 나열된 히스톤 펩타이드가 표시됩니다 사이. 변형 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> 그림 6 :와 레티노 산 처리하지 않고 인간 배아 줄기 세포의 대표 결과 (A) 히스톤 H3 펩타이드 KQLATKAAR의 상대 정량 - 그 수정 proteoforms의 모두 (AA 18 26).. 상대 풍부한 100 %합니다 (REL 모든 proteoforms을 이용하여 추정 하였다. 수정되지 않은 펩타이드의 극상 비율) 도시 히스톤 H3 펩타이드 KSTGGKAPR (AA (9) (B) 상대 정량화되지 않습니다 -. 17) (C)와 레티노 산으로 세포 치료없이 정식 히스톤 H3에 대한 검출 된 펩티드의 상대 풍부. 그림은 주어진 수정 (&gt; 50 %)보다 풍부 두 치료하는냅니다. 전반적으로, 우리는 히스톤 H3의 아세틸 화는 세포 분화의 유도에 따라 라이신 잔기의 대부분에서 감소한다는 것을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 해결책 # </td><td colspan="7"> 구성 </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> 핵 분리 완충액 (NIB) 스톡은 다음과 같이 제조하고 -20 ℃에서 100 mL의 분취 량으로 동결 저장된다; 해동15 mM 트리스, 60 밀리미터의 KCl, 15 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 염화칼슘 2, 250 MM의 자당 : NIB는 몇 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 버퍼의 pH를 HCl로 7.5로 조정한다. </td></tr><tr><td> 이 </td><td colspan="7"> 프로테아제 억제제 (버퍼에 새로운 추가 사용 전에) DDH이 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT) O (1000 배); DDH 2 O (400X) 200 mM의 AEBSF </td></tr><tr><td> 삼 </td><td colspan="7"> 포스파타제 억제제 (버퍼에 새로운 추가 사용 전에) : 2.5 μM 마이크로 시스틴 100 % 에탄올 (500X) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> HDAC 억제제 (사용 전에 버퍼에 새로운 추가) 5 M 소듐 뷰티 레이트, pH가 7.0 (500X)에 수산화 나트륨을 사용하여 5 M 부티르산의 적정에 의해 </td></tr><tr><td> (5) </td><td colspan="7"> NP-40 대체 : DDH 2 O 10 %의 v / V </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> DDH 2 O 0.2 MH 2 SO 4 </td></tr><tr><td> (7)</td><td colspan="7"> 트리클로로 아세트산 (TCA) : w 100 % / DDH 2 O에서 V </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> 아세톤 + 0.1 % 염산 (HCL) : 0.1 % v / V를 염산 아세톤 </td></tr></tbody></table> 표 1. 솔루션.

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 유전자 발현 조절 및 염색체 응축과 같은 염색질 생물학에서 필수적인 역할을 하는 히스톤 번역 후 수식의 상대적 풍부도를 평가하기 위한 간단한 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 특정 세포 또는 조직의 자극이나 처리 시 어떤 히스톤 수식의 상대적 풍부도가 변화하는지와 같은 염색질 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용하여 단 한 번의 분석으로 알려진 단백질 상의 알려진 대부분의 PTM을 동시에 정량할 수 있다는 점입니다. 히스톤 수정 분석은 약물 처리 또는 스트레스 상황에서 개체 또는 모델 시스템의 후성유전학적 변화와 염색질 작동을 추정하는 것을 포함하여 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. Simone 외에 저희 실험실의 다른 두 명의 구성원이 이 프로토콜의 절차를 시연할 예정입니다.연구 전문가인 Natarajan Bhanu와 대학원생 Kelly Karch입니다. 이 워크플로우에서 보여주듯이, 본 프로토콜은 세포 배양물 또는 조직으로부터의 히스톤 정제, 히스톤 유도체화, 소화 및 탈염, 그리고 나노플로우 액체 크로마토그래피를 이용한 질량 분석법 분석을 포함하는 10단계 과정으로 구성됩니다. 본 영상에서는 선택된 절차만을 시연합니다.온전한 세포에서 핵을 분리하는 절차를 시작하려면, 이전에 수확하여 -80 °C에서 보관한 세포를 얼음 위에서 해동하십시오. 그리고 프로토콜 본문에 설명된 대로 핵 분리 버퍼(nuclear isolation buffer, NIB)를 준비합니다. NIB 부피의 5분의 1을 덜어내어 NP-40 Alternative를 최종 농도 0.2%가 되도록 첨가하십시오. 나머지 5분의 4 부피는 세척용으로 사용됩니다.세포 펠릿 부피 대비 버퍼 부피 1:10 비율로 NP-40 Alternative가 포함되지 않은 NIB를 사용하여 세포 펠릿을 세척합니다. 700 RCF에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 얼음 위에 놓고 세포 펠릿 부피 대비 버퍼 부피 1:10 비율로 0.2%NP-40 Alternative가 포함된 NIB를 첨가하여 세포 펠릿을 용해합니다.피펫팅을 부드럽게 하여 세포를 균질화합니다. 균질화된 세포를 얼음 위에서 5~10분 동안 배양하여 세포를 용해시키고 핵을 방출시킵니다. 4°C에서 1000 RCF로 5~10분 동안 원심분리합니다.펠릿에는 주로 세포핵이 포함되며, 상층액에는 주로 세포질 성분이 포함됩니다. 필요한 경우 세포질 분획을 저장하십시오. 펠릿 부피 대비 버퍼 부피의 비율을 1:10으로 하여 NP-40 Alternative가 포함되지 않은 NIB로 핵 펠릿을 부드럽게 재현탁함으로써 세척합니다.4°C에서 1000 RCF로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 핵 펠릿에서 NP-40 Alternative를 완전히 제거한 후, 핵 부피 대비 황산 부피의 비율을 1:5로 하여 얼음처럼 차가운 0.2 M 황산을 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 핵을 황산에 다시 부유시킵니다.시료를 4 °C에서 2~4시간 동안 일정하게 회전시키거나 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그 다음, 시료를 4 °C에서 3400 RCF로 5분 동안 원심 분리하고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 불용성 물질을 완전히 제거하기 위해 다시 한번 원심 분리한 후 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.히스톤을 침전시키기 위해, 수집한 상층액에 차갑게 식힌 100% trichloroacetic acid(TCA)를 1:3 부피 비율로 첨가합니다. 샘플이 뿌얗게 변하면 히스톤이 존재함을 의미합니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞어줍니다.혼합물을 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 3400 RCF에서 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 히스톤은 튜브 벽면에 코팅되거나 바닥에 침전됩니다.튜브의 맨 바닥에는 주로 비히스톤 단백질과 기타 생체 분자를 포함하는 흰색의 불용성 펠릿이 형성됩니다. 튜브의 벽면이나 바닥의 펠릿을 긁지 않도록 주의하며 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 100% ice-cold acetone 및 0.1% hydrochloric acid로 튜브를 헹구어, 벽면과 바닥에 코팅된 침전 단백질이 충분히 덮이도록 하십시오.3400 RCF에서 2분 동안 원심분리합니다. 튜브 벽면이나 펠릿을 긁지 않도록 주의하여 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 100% 얼음처럼 차가운 아세톤으로 튜브를 세척한 후 다시 원심분리하고, 벽면이나 펠릿을 긁지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다.이어서, 프로토콜 본문에 설명된 대로 히스톤 정량 및 순도 분석을 수행합니다. 히스톤 유도체화 전에 역상 HPLC를 이용한 히스톤 변이체의 선택적 분획을 수행할 수도 있습니다. 이 절차는 히스톤 샘플을 40 µL의 50 mM 중탄산암모늄(pH 8.0)에 용해하는 것으로 시작합니다.P10 피펫 팁을 흡입 없이 샘플에 넣은 후, 피펫 팁을 pH 지시지에 접촉시켜 pH를 확인합니다. 수산화암모늄과 포름산을 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다. 이때부터 프로피온산 무수물을 사용하는 모든 단계는 흄 후드 내에서 수행해야 합니다.프로피온산 무수물(propionic anhydride)의 반응성을 유지하기 위해 한 번에 최대 3~4개의 샘플만 처리하십시오. 프로피온산 무수물과 아세토니트릴을 1:3의 부피 비율로 혼합하여 신선한 프로피온화 시약을 준비합니다. 각 샘플에 프로피온화 시약을 1:4의 부피 비율로 첨가하십시오.수산화암모늄을 빠르게 첨가하여 용액의 pH를 8.0으로 다시 맞춥니다. 일반적으로 시료에 수산화암모늄을 1:5의 부피 비율로 첨가하면 pH 8.0으로 재설정하는 데 적합합니다. 즉시 볼텍싱하여 혼합합니다.pH를 확인하십시오. 샘플을 상온에서 15분 동안 배양하십시오. 모든 샘플의 프로피오닐화(propionylation)가 완료되면, 진공 농축기를 사용하여 샘플을 10~20 µL까지 건조시키십시오.최종 부피가 40 µL가 될 때까지 ddH2O로 샘플을 재현탁하거나 희석합니다. 염은 액체 크로마토그래피와 질량 분석을 방해하므로, 분석 전에 샘플의 탈염 과정을 거쳐야 합니다. 본 영상에서는 스테이지 팁(stage-tip)의 제작 과정만을 시연합니다.P1000 피펫 팁을 사용하여 고상 추출 디스크에서 C18 재료 디스크를 펀칭하여 떼어냅니다. 용융 실리카 모세관을 사용하여 미니 디스크를 P1000 팁에서 밀어내어 P100 또는 P200 피펫 팁의 바닥으로 옮깁니다. 디스크가 팁 바닥에 단단히 고정되었는지 확인하십시오.25 µg 이상의 샘플을 탈염하는 경우, 동일한 P100 또는 P200 팁에 두 개의 C18 mini-disk를 사용하십시오. 1.5 또는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브 내에서 스테이지 팁을 고정하기 위해 원심분리 어댑터를 사용하십시오. C18 물질을 활성화하고 잠재적인 오염 물질을 제거하기 위해 50 µL의 100% acetonitrile로 스핀하여 레진을 세척하십시오.이후 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 시료 탈염을 수행합니다. 히스톤 펩타이드는 다양한 동중량(isobaric) 형태로 존재합니다. 히스톤 분석에서 흔히 발견되는 두 가지 사례가 제시되어 있습니다.위에 표시된 전구체 질량 및 상대적 동위원소의 추출 이온 크로마토그램은 동일합니다. 그러나 아래에 표시된 생성 이온의 추출 이온 크로마토그램을 통해 두 등중량 형태를 구분할 수 있습니다. 두 종의 상대적 함량을 추정하려면 빨간색으로 강조 표시된 고유한 조각 이온만을 사용해야 합니다.레티노산 자극 여부에 따른 인간 배아줄기세포 추출 히스톤을 분석하였습니다. 두 가지 히스톤 H3 펩타이드의 상대 정량 분석 결과, 분화를 위해 자극을 준 인간 배아줄기세포에서 아세틸화가 뚜렷하게 감소한 것이 확인되었습니다. 이는 분화 중인 세포에 비해 배아줄기세포에서 아세틸화 수준이 더 높다는 기존의 보고와 일치하는 결과입니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 3일 만에 완료할 수 있습니다. 첫째 날은 히스톤 추출, 둘째 날은 단백질 유도체화 및 소화, 셋째 날은 펩타이드 유도체화, 스테이지-팁 처리 및 LC-MS 분석을 진행합니다. 히스톤 정제 과정은 펩타이드 분석 외에도 조합 히스톤 수식(combinatorial histone modifications)의 특성을 규명할 수 있는 미들다운(middle-down) 및 탑다운(top-down) 프로테오믹스를 포함한 다른 목적으로 활용될 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용하여 히스톤 번역 후 수식화(post-translational modification)를 식별하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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