분할 브로콜리 RNA 리포터를 이용한 시험관 내 RNA 클러스터에서 분자 간 RNA 염기쌍의 시각화 및 정량화

우리는 스플릿 브로콜리 RNA 리포터 분석을 적용하여 시험관 내 RNA 클러스터 내 분자 간 염기쌍을 검출하고 정량합니다. 화학적 탐지와 시뮬레이션은 RNA 상호작용을 시사하지만 직접 측정할 수는 없습니다. 이 프로토콜은 RNA 클러스터 내에서 직접적이고 정확한 평가를 가능하게 합니다.

시험관 내 RNA 전사용 DNA 템플릿을 준비한 후, 작업 표면, 튜브 랙, 피펫을 리보뉴클레아제 제염용액으로 닦아냅니다. 모든 피펫팅 단계에는 리보뉴클레아제가 없는 여과 팁을 사용하세요. 전사 키트에 포함된 반응 완충제와 뉴클레오타이드 용액, 그리고 우리딘 삼인산 시아닌 5(UTP-Cy5)를 얼음 위에 해동합니다.

사용 전에 모든 튜브를 2,000g에서 2초간 원심분리하세요. 그 다음 DNA에 있는 티민 염기의 수를 계산하세요. RNA 종 전반에 걸쳐 일관된 표지 밀도를 유지하면서 20마이크로리터 전사 반응에 필요한 UTP 및 UTP-Cy5 부피를 결정합니다.

다음으로, 제시된 시약들을 결합하여 20마이크로리터 전사 반응을 준비합니다. 피펫팅을 위아래로 흔들고 2,000g에서 원심분리기를 2초간 가동해 완전히 섞으세요. 반응을 37도 섭씨에서 6시간 배양한 후, 키트에 포함된 1마이크로리터의 디옥시리보뉴클레아제를 추가하고, 피펫팅으로 충분히 혼합한 후 다시 원심분리기를 사용합니다.

그 후 섭씨 37도에서 추가로 15분간 배양합니다. 반응을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 키트에 포함된 115마이크로리터의 무핵효소 무첨가수와 15마이크로리터의 암모늄 아세테이트 차단액을 추가하세요.

혼합 후 용액을 2,000g에서 2초간 원심분리합니다. 다음으로, 튜브에 150마이크로리터의 페놀 클로로포름을 넣고 부드럽게 혼합하여 두 상을 결합시킵니다. 원심분리기 16,000g에서 10분간 4도 섭씨.

그 다음 상부 수상을 새 튜브로 옮깁니다. 옮긴 용액에 같은 양의 클로로포름을 첨가하고 적절한 상상호작용을 위해 충분히 혼합합니다. 이제 16,000g에서 4도 섭씨에서 2분간 원심분리하고 상 분리 과정을 다시 반복합니다.

그 후 약 100에서 150 마이크로리터 크기의 수층을 새로운 튜브로 옮깁니다. 이소프로판올 900마이크로리터를 추가하고 완전히 섞으세요. 용액을 각각 다른 튜브에 분리한 후, 샘플을 영하 20도에서 하룻밤 또는 최대 한 달간 보관하세요.

RNA 샘플을 16,000g 온도에서 4도 섭씨에서 15분간 원심분리합니다. RNA 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 이소프로판올을 제거하세요. 그 다음 뉴클레아제가 없는 물로 조제한 70% 에탄올 1밀리리터를 펠릿에 추가합니다.

16,000g에서 4도 섭씨에서 2분간 원심분리기. 에탄올을 제거한 후, 뉴클레아제가 없는 물로 준비한 70% 에탄올 1밀리리터를 튜브에 추가하고 원심분리를 반복합니다. 최종 에탄올 세척 중에는 1,000 마이크로리터 피펫을 사용해 대부분의 에탄올을 제거합니다.

2,000g에서 2초간 벤치탑 미니 원심분리기에서 원심분리기를 잠시 하고, 남은 에탄올은 20마이크로리터 피펫으로 제거하세요. RNA 펠릿이 건조되면, 뉴클레아제가 없는 20마이크로리터의 물에 다시 부유시킵니다. 샘플은 얼음 위에 보관하고 빛으로부터 보호하세요.

마이크로 부피 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다. 260 대 280 나노미터에서의 흡수율이 약 2.0이고, 260 대 230 나노미터에서의 흡수율이 2.0보다 높도록 해야 합니다. 100밀리몰라 스페르민 용액과 50% 폴리에틸렌글리콜 8,000을 얼음 위에 녹여 해동하세요.

제시된 성분들을 조합하여 10X RNA 재접기 버퍼를 신선하게 준비합니다. 피펫팅으로 성분을 충분히 혼합한 후, 2,000g 원심분리기를 벤치탑 미니 원심분리기에서 2초간 가열합니다. 공동 접기 조건을 위해 200마이크로리터 PCR 튜브에서 시험관 내에서 상부 또는 하부 서열을 가진 전사 RNA, RNA 재접기 완충제, 그리고 뉴클레아제가 없는 물을 결합합니다.

앞서 시연한 대로 피펫팅을 위아래로 하고 원심분리기를 사용해 충분히 혼합하세요. 샘플을 90도 섭씨에서 2분간 가열하세요. 즉시 샘플을 실온으로 옮기세요.

빛을 피하고 1시간 동안 부양하세요. 별도의 접기 조건을 위해서는 200마이크로리터 PCR 튜브에서 RNA 샘플을 가열한 후 즉시 최소 15분간 얼음에 보관합니다. 200마이크로리터 PCR 튜브에 시험관 내에서 전사된 RNA가 상단 또는 하단 서열을 포함하고, 10배 RNA 재접기 완충제, 그리고 뉴클레아제가 없는 물을 결합합니다.

반응을 빛으로부터 보호한 상태로 30분간 실온에서 배양하세요. 이제 상단과 하단 서열을 포함한 RNA 샘플을 하나의 PCR 튜브에 결합하고, 위아래로 피펫팅하여 충분히 혼합합니다. 2,000g에서 2초간 벤치탑 미니 원심분리기를 사용했습니다.

상온에서 30분간 배양하세요. 두 경우 모두 100밀리몰라 스페르민과 50% 폴리에틸렌글리콜 8,000의 1-2 프리믹스 6마이크로리터를 추가하세요. 내용물을 섞은 후, 2,000g에서 2초간 벤치탑 미니 원심분리기에서 원심분리기를 돌립니다.

이제 1밀리몰라 DFHBI-1T 2마이크로리터를 반응에 섞어 원심분리합니다. 반응을 유리 챔버가 있는 커버 유리에 넣습니다. 실온에서 4시간 동안 어두운 상태에서 덮개를 씌운 채 부화시켜 증발을 최소화하세요.

유리 챔버가 있는 커버 유리를 현미경 스테이지에 올려놓으세요. 레이저를 켜고, 아이피스를 사용해 샘플을 찾아 초점을 맞추세요. 각 Z면에서 먼저 시아닌 5채널로 관심 영역을 촬영하도록 현미경을 설정하세요.

그 후 녹색 형광 단백질 채널을 사용해 같은 관심 영역을 영상화합니다. 모든 채널의 노출 시간을 500밀리초로 설정하세요. 그 다음 녹색 형광 단백질 채널은 레이저 출력을 80%, 시아닌 5 채널은 40%로 설정했습니다.

Z 단계 150나노미터를 사용해, 실온에서 반응 방울의 외부 커버 슬립 영역을 촬영합니다. 그 후 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 분자 간 염기쌍을 정량화합니다. RNA 클러스터링이 유도되면 두 RNA는 각각 또는 함께 클러스터를 형성했다.

RNA 클러스터 내 DFHBI-1T 형광은 상부 또는 하부 RNA만 있을 때 공동 접힘 조건에 비해 현저히 낮았습니다. 별도의 접힘 조건에서 정규화된 DFHBI-1T 신호는 0.031로, 상단 또는 하단에서만 관찰된 기준선 수준과 유사했습니다. 슈탑, 슈-바텀, 슈-안티-탑, 슈-안티바텀은 각각 DFHBI-1T 형광이 최소한으로 나타났다.

슈탑과 슈바텀을 공동 접거나, 슈안티탑과 슈안티바텀을 접을 때, 분리된 접기보다 더 높은 DFHBI-1T 신호가 발생했습니다. 슈-탑과 슈-바텀의 공동 접힘은 정규화된 DFHBI-1T 형광이 5.63배 증가했습니다. 슈탑과 슈바텀을 각각 접을 때는 기준선과 비슷한 1.04배 증가에 그쳤습니다.

슈탑과 슈-안티바텀, 슈안티탑과 슈-보텀을 혼합한 경우, 두 접힘 조건 모두에서 동일한 방향 쌍보다 더 높은 DFHBI-1T 형광을 보였습니다. 슈-탑과 슈-안티-바텀, 슈-안티-탑과 슈 바텀을 공동 접으면 DFHBI-1T 형광이 각각 61.86배와 82.60배 증가했습니다. 이 혼합 쌍을 별도로 접으면 각각 2.69배와 4.94배의 작은 증가가 나타났다.

가장 중요한 고려사항은 강력한 신호 생성을 위해 크라우딩 시약이 필요할 수 있으며, 민감도는 분열된 브로콜리 RNA의 효율적인 이합체화와 접힘에 달려 있다는 점입니다. 이 분석법은 RNA 클러스터 내 분자 간 염기대 대립을 연구하기 위한 RNA 풀다운 및 겔 전기영동 접근법을 보완합니다. 이 분석법은 RNA 서열, 헬리케이스, 이온이 RNA 클러스터 내 분자 간 염기쌍에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.