RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법

우리는 특정 RNA 분자에 의해 조직된 염색질 접촉을 지도화하기 위해 RNA 연관 염색질 DNA-DNA 상호작용법, 즉 RDD 방법을 개발했습니다. RDD는 내인성 및 외인성 RNA 간의 RNA 특이적 염색질 밴딩과 장거리 상호작용을 강력하게 지도화합니다. 우선, 초파리 S2 이중 가교 세포에서 유래한 투과성 핵 펠릿을 Triton X-100이 포함된 0.1% FA 용해 완충제 15밀리리터에 재현탁합니다.

기포 형성을 피하면서 14밀리리터 둥근 바닥 시험관에 1.5밀리리터의 핵 현탁액을 분리합니다. 30초 켜기, 30초 끄기 사이클을 사용해 38% 진폭으로 4.5분간 서스펜션을 초음파 처리하세요. 초음파 처리된 크로마틴을 15밀리리터 튜브에 모아 3,200g 원심분리기에서 실온에서 20분간 보관합니다.

약 13밀리리터의 상청액을 새로운 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이제 초음파 처리된 크로마틴이 들어있는 튜브에 준비된 스트렙타비딘 C1 비즈 100마이크로리터를 넣고 실온에서 20분간 회전시킵니다. 그 후 튜브를 자기 랙에 1분간 올려놓고, 미리 정해진 크로마틴이 포함된 상청액을 새로운 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

분석을 위해 10마이크로리터 알리코트를 영하 20도에 보관하세요. 상온에서 회전 기계 위에서 30분간 신선히 준비한 하이브리드 버퍼 26밀리리터와 13밀리리터의 사전 클리어된 크로마틴을 배양합니다. 다음으로, 하이브리다이제이션 혼합물을 15밀리리터 튜브 세 개로 분리하고, 각 샘플에 100마이크로몰라 비오티닐화 프로브 6마이크로리터를 추가합니다.

튜브 캡을 필름으로 밀봉한 후, 튜브를 37도에서 하룻밤 동안 회전시킵니다. 스트렙타비딘 C1 비즈를 차단한 후, 블로킹 버퍼를 제거하고 400마이크로리터의 하이브리다이제이션 버퍼에 다시 현탁합니다. 이제 차단 버퍼 처리된 스트렙타비딘 C1 비즈를 이전에 준비한 하이브리드 크로마틴에 추가합니다.

혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 돌려 보세요. 상원액을 버리고 구슬을 1.5밀리리터 튜브로 옮긴 후, 800 마이크로리터의 세척 버퍼로 구슬을 다섯 번, TE 버퍼로 두 번 세척합니다. 최종 세척 후에는 상청액을 버리고 1X 프로테아제 억제제가 포함된 TE 버퍼 1,000마이크로리터에 구슬을 재현탁합니다.

프로브-크로마틴 복합체에 결합된 스트렙타비딘 C1 비드의 빈 부위를 차단하려면, 비즈에 변성 IPB 220마이크로리터를 추가하고 실온에서 15분간 돌립니다. 배양 후에는 TE 버퍼를 사용해 스트렙타비딘 C1 구슬을 다섯 번 세척합니다. 다음으로, 스트렙타비딘 C1 비즈의 크로마틴에 693마이크로리터의 엔드 리페어 믹스를 첨가하고 잘 섞습니다.

그 다음 7마이크로리터의 T4 DNA 중합효소를 추가합니다. 혼합물을 분당 800회전, 섭씨 12도에서 30분간 열믹서에 배양하세요. 그 후 샘플을 16도 온도의 믹서에서 15분간 배양합니다.

비즈를 800마이크로리터의 얼음 차가운 ChIA-PET 버퍼로 세 번 세척한 뒤, TE 버퍼로 한 번 세척하세요. 그 후 스트렙타비딘 C1 비즈의 크로마틴에 693마이크로리터의 A-테일링 혼합물을 첨가하고 잘 섞습니다. 다음으로, 클레노우 조각 3에서 5 프라임 엑소뉴클레아제 마이너스 7마이크로리터를 추가합니다.

튜브를 분당 12회전, 섭씨 37도에서 50분간 배양합니다. 구슬을 800마이크로리터의 얼음 차가운 ChIA-PET 버퍼로 세 번 세척한 후, 부드러운 피펫으로 용출 버퍼로 한 번 세척하세요. 이제 스트렙타비딘 C1 비즈의 염색질에 1,390 마이크로리터의 근접 연결 혼합물을 추가하고, 실온에서 믹서기에서 5분간 배양합니다.

혼합물에 T4 DNA 리가아제 10마이크로리터를 추가하고 상온에서 분당 20회전으로 5분간 회전시키고, 그 후 상온에서 분당 12회전으로 50분간 배양한 뒤, 하룻밤 16도에서 배양을 계속합니다. 다음으로, 800마이크로리터의 차가운 ChIA-PET 버퍼로 구슬을 세 번 세척한 뒤, TE 버퍼로 두 번 세척합니다. 크로마틴 방출을 위해서는 스트렙타비딘 C1 비드의 크로마틴에 480마이크로리터의 LC ChIP 용출 버퍼를 첨가하고 잘 혼합합니다.

탈가교를 위해 20밀리그램/밀리리터 단백질효소 K 20마이크로리터를 추가하세요. 튜브를 분당 950회전, 65도 섭씨 온도에서 열믹서에 하룻밤 배양한 후, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 시약으로 근접 결합 DNA를 정제합니다. Tn5 태그멘테이션 테스트에 필요한 모든 성분을 PCR 튜브 위에 50마이크로리터 반응 부피로 얼음 위에 넣으세요.

태그멘테이션 반응을 55도 섭씨에서 열사이클러에서 10분간 인큐브하고 뚜껑을 70도로 설정한 후 4도에서 유지합니다. 태그가 부착된 DNA에 ChIP 용출 버퍼 50마이크로리터와 단백질나제 K 1마이크로리터를 첨가합니다. 용액을 혼합한 후 65도 섭씨, 분당 900회전에서 열믹서에서 30분간 배양합니다.

DNA 정제 키트를 사용해 DNA를 정제하고, 자동 모세관 전기영동 시스템으로 DNA를 정량합니다. 모든 조각된 연결 DNA를 차단 완충제와 유전체 DNA로 미리 차단한 M280 비드에 추가한 후 현탁액을 혼합합니다. 튜브를 믹서 위에서 실온에서 45분간 돌려보세요.

잠시 돌린 후 튜브를 자석 거치대에 올려놓고 상원액을 버립니다. 세척 단계 후, 혼합하지 않고 30마이크로리터의 용출 버퍼를 비드에 첨가합니다. DNA 라이브러리 준비 키트에 따라 PCR 혼합물을 준비하세요.

PCR 튜브를 PCR 기계로 옮기고 증폭 프로그램을 설정하세요. 마지막으로, 자기 구슬을 이용해 PCR 산물을 정제한 후, 핵산 정량기로 10에서 30나노그램의 라이브러리 DNA를 측정하여 시퀀싱을 준비합니다. 초음파 처리된 크로마틴 조각은 약 1,000에서 3,000 염기쌍 사이로, 성공적인 분열을 나타냈다.

RNA 연관 염색질은 약 1,000에서 3,000염기쌍 사이의 조각 크기를 보였습니다. Tn5로 표지한 염색질은 크로마틴 표지 효율을 나타내는 조각 분포를 보였다. 증폭 후 시퀀싱 라이브러리는 약 180에서 1,000 염기쌍 사이의 분포를 보였습니다.

크기 선택 후, 시퀀싱 라이브러리 조각들은 주로 약 250에서 600 염기쌍 범위에서 풍부하게 증가했습니다. RNA 연관 염색질-DNA 상호작용(RDD 방법)은 NC RNA roX2 및 7SK 결합의 유전체 위치와 해당 원격 염색질 상호작용 루프를 검출했습니다. RNA 중합효소 II ChIA-PET의 데이터는 이 NC RNA와 유전자 발현 사이에 명확한 조절 관계가 있음을 보여주며, 상호작용 강도를 나타내는 피크가 있습니다.

다차원 분석은 RDD 고정 상호작용과 Hi-C 유전체 전체 염색질 구조 지도 및 후생유전체 표지, 초기 전사, RNA 중합효소 II ChIA-PET 데이터를 통합하여 달성했습니다. 이 영역들에서는 위상학적으로 연관된 도메인이 명확히 시각화되었으며, RNA에 의해 유도된 크로마틴 루프가 경계에 위치하거나 여러 도메인을 아우르는 경우가 많았습니다. 또한 RNA 중심의 조절 허브도 결정되었습니다.

RDD 방법과 고정 크로마틴 상호작용을 통해 RNA 결합 부위와 3D 게놈 조직에서 관련된 DNA-DNA 상호작용을 밝혀냈습니다. 주요 교리는 적절한 프로브, 링커, 크로마틴 비율을 유지하고, 중합효소 연결하기 전에 자연 비오틴으로 경계 없는 스트렙타비딘 부위를 차단하는 것입니다. 향후 연구는 RNA가 발달, 교란, 감염 전반에 걸쳐 크로마틴 상호작용을 동적으로 감아내는 방식을 탐구할 수 있습니다.