포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

조직 배양 기술은 세포 생물학 분야에서 널리 적용되고 있습니다. 그러나 배양된 세포는 건강을 유지하기 위해 정기적인 유지 관리가 필요합니다. 세포가 공동 유창성에 도달하면 하위 배양 또는 계대배양되어야 합니다.

그렇게 하지 않으면 성장이 감소하고 결국 세포가 죽게 됩니다. 이 동영상에서는 부착 세포주와 부유 세포주 모두에 대해 조직 배양 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 테네시 동부에 있는 분자 병리학 연구소 네트워크의 Dr.LAN 실험실에서 근무하는 Ricky입니다.

오늘은 현탁액 및 접착 세포를 포장하는 두 가지 기술을 보여 드리고자 합니다. 세포의 판을 통과하기 위해. 60mm 페트리 접시 또는 5mils 조직 배양 배지를 포함하는 25cm 제곱 조직 배양 플라스크에서 유창하게 성장한 1차 배양으로 시작하고 싶습니다.

먼저 멸균 피펫으로 1차 배양에서 모든 배지를 제거합니다. 그런 다음 칼슘과 마그네슘이 없는 섭씨 37도의 소량으로 부착 세포 단층을 한두 번 세척합니다. 다음 단계에서 추가할 트립신 효소의 작용을 억제할 수 있는 잔류 소 태아 혈청을 제거합니다.

다음으로, 부착 세포층을 덮을 수 있도록 배양액에 따뜻한 트립신 EDTA 용액을 충분히 첨가합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도의 보온 트레이에 1-2분 동안 놓을 수 있습니다. 배양 후 평평한 표면에서 플레이트 바닥을 두드려 세포를 제거합니다.

도립 현미경으로 배양물을 확인하여 세포가 둥글게 처리되어 표면에서 분리되었음을 나타냅니다. 셀이 충분히 분리되지 않은 경우 플레이트를 보온 트레이에 다시 넣고 1-2분 더 기다립니다. 내시경을 살펴본 후 접시를 완전한 매체로 헹구고 2mil의 완전한 매체가 들어 있는 15mil 원뿔형 튜브에 현탁액을 피펫으로 넣습니다.

세포를 회전시켜 펠릿화하고 펠릿을 완전한 배지에 재현탁합니다. 이제, 적절하게 라벨링된 각각의 새로운 플레이트에 동일한 부피의 세포 현탁액을 추가합니다. 또는 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수하고 원하는 밀도로 희석하여 특정 수의 세포를 각 플레이트에 추가할 수 있습니다.

모든 접시에 하위 문화의 날짜와 통과 번호를 표시하십시오. 세포 현탁액을 첨가한 후 각각의 새로운 배양액에 1mil의 신선한 배지를 놓습니다. 이제 가습 된 섭씨 37도 5 % CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양하십시오.

밤새 세포를 배양한 후 플레이트에 새로운 배지를 추가하고 37도로 다시 놓습니다. 플레이트가 유창하게 성장하면 이 절차를 반복하여 플레이트를 다시 통과시키고 필요에 따라 계속 통과할 수 있습니다. 이제 현탁 배양에서 세포를 계대적으로 분류하는 방법을 보여드리겠습니다.

현탁 배양에서 세포를 패키징하는 것은 부착 세포보다 간단합니다. 현탁액 배양을 포장하기 전에, 세포가 현탁액에서 뭉쳐지고 배지가 turid로 보이는 cofluency에 도달할 때까지 2-3일마다 세포를 공급하여 세포를 유지해야 합니다. 플라스크가 소용돌이칠 때.

이렇게하려면 인큐베이터에서 현탁 세포의 플라스크를 제거하고 플라스크에 정착 한 플라스크를 방해하지 않도록주의하십시오. 바닥은 무균으로 플라스크에서 매체의 약 1/3을 제거하고 버리고 섭씨 37도에서 동일한 부피의 예열 매체로 교체합니다. 매체를 교체한 후 플라스크를 휘젓고 섭씨 37도, 5%CO2인 인큐베이터에 다시 넣습니다.

15mils 미만인 경우 플라스크의 배지가 플라스크를 수평 위치로 배양하여 세포 대 매체 접촉을 향상시킵니다. 그렇지 않으면, 플라스크는 배양물이 공급되지 않는 날에 수직으로 배양될 수 있습니다. 세포를 다시 현탁시키기 위해 플랫을 소용돌이쳐서 확인하십시오.

좋은 신진대사 성장을 나타내는 배지의 색상 변화를 관찰하십시오. 배양물이 융합되면(mil당 약 250만 개의 세포) 이를 통과시킬 수 있습니다. 다시 한 번, 부착 배양과 현탁 배양 모두에 대해 배양된 세포를 계대배양하는 방법을 보여드렸습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 모든 실험에 행운을 빕니다.