Plasmiden zijn circulaire, extra chromosomale DNA-moleculen en in de moleculaire biologie fungeren ze als dragers, of vectoren, voor een specifiek DNA-fragment. Bacteriën worden gebruikt om plasmiden te repliceren, zodat uw DNA van belang in grote hoeveelheden wordt geproduceerd. Het proces waarmee onderzoekers plasmiden uit bacteriën verkrijgen, wordt plasmide-zuivering genoemd, wat in deze video zal worden uitgelegd.
Uiterlijk betekent plasmide-zuivering het zuiveren van plasmiden, maar wat betekent dat precies? Om plasmiden te zuiveren, moeten ze worden geïsoleerd van het bacteriële chromosoom, eiwitten, het bacteriële membraan en bacteriële ribosomen.
Hoewel er veel verschillende kits bestaan voor het zuiveren van plasmiden, blijft het basisprincipe achter plasmide-zuivering voor alle hetzelfde. Eerst wordt de geselecteerde bacteriekolonie gekweekt in een geschikt kweekmedium dat de juiste antibiotica bevat. Dankzij een antibioticaresistentiegen, gecodeerd door het plasmide, zullen alleen bacteriën die het plasmide bevatten in dit medium groeien. De bacteriën worden geoogst en onder een hoge pH gelyseerd. De pH wordt geneutraliseerd, er wordt zout toegevoegd en vervolgens wordt het mengsel gecentrifugeerd om puin en genomisch DNA te verwijderen.
Geneutraliseerd cellysaat wordt op een silicakolom aangebracht. Plasmide-DNA wordt geacht te hechten aan de kolom via een mechanisme genaamd anionenuitwisseling, waarbij DNA, een sterke anion, via een kationenzoutbrug aan de negatief geladen kolom bindt. Andere materialen uit het lysate, zoals eiwitten, worden door de kolom gewassen met buffers met een hoog zoutgehalte. Ten slotte wordt gezuiverd plasmide uit de kolom vrijgegeven wanneer een buffer met een laag zoutgehalte wordt toegevoegd die de zoutbrug verstoort.
Voor deze procedure moeten een labjas, wegwerphandschoenen en beschermende bril worden gedragen.
De bacterieculturen, die zijn getransformeerd met het gewenste plasmide-DNA, moeten worden gekweekt in groeimedia met geschikt antibioticum in een 37°C schudkuvende incubator.
De volgende dag wordt de bacteriecultuur door centrifugatie gepelleteerd en wordt het supernatant verwijderd. Het resterende pellet wordt opgeschort in lysebuffer.
Eenmaal opgeschort, kunnen bacteriën worden overgebracht naar een kleinere buis waar lysebuffer wordt toegevoegd. Lysebuffer heeft een hoge pH en bevat detergenten, zoals natriumdodecylsulfaat, die de bacteriemembranen verstoren en daardoor de bacteriën lyseren. De oplossing wordt troebel met de toevoeging van de lysebuffer en na het mengen wordt de oplossing helderder. De mengsel mag niet worden gevormd omdat er een mogelijkheid bestaat dat genomisch DNA wordt afgeschoord of gebroken, wat vervolgens de zuivering van plasmide-DNA zou kunnen besmetten.
Vervolgens wordt neutralisatiebuffer toegevoegd om de alkalische omstandigheden te neutraliseren en de pH te verlagen. Met voorzichtig mengen zal genomisch DNA en eventuele eiwitten die eraan gebonden zijn, precipitatie ondergaan, terwijl plasmide-DNA in oplossing blijft. Vermijd opnieuw voorzichtig mengen, zodat uw plasmiden vrij zijn van besmetting met genomisch DNA.
Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd en het genomisch DNA/eiwitprecipitaat wordt gepelleteerd. Het supernatant bevat het plasmide-DNA evenals oplosbare eiwitten.
Dit supernatant wordt op de kolom geplaatst door het af te decanteren, een mooie naam voor het afgieten of pipetteren. Het pellet kan worden weggegooid.
Vervolgens passeert hoog zout wasbuffer door de kolom terwijl het DNA aan de silica gebonden blijft. Herhaalde wasstappen met hoge zoutbuffer verwijderen endonucleasen, RNA, eiwitten, kleurstoffen en onzuiverheden met een laag molecuulgewicht. De flow-through van de wasstappen moet worden weggegooid. Zorg ervoor dat na de laatste wasstap de filter volledig droog is zonder resterend buffer. Het plasmide-DNA bevindt zich nog steeds op de filter.
Het plasmide-DNA wordt geëlueerd met steriel water of een elutiebuffer. Het DNA is direct beschikbaar voor gebruik in een breed scala aan toepassingen.
Er zijn verschillende manieren om de zuiverheid van plasmiden na zuivering te verifiëren. Een spectrometer kan worden gebruikt om de absorptie bij verschillende golflengten te vergelijken om de concentratie van plasmide-DNA te bepalen. Een agarosegelanalyse van het gezuiverde plasmide kan bepalen of het plasmide de juiste grootte heeft en of er geen verontreinigingen zijn. Deze stap zorgt ervoor dat er geen genomisch DNA-besmetting is en dat het plasmide niet in bacteriën is gemodificeerd.
De plasmide-zuiveringsprocedure kan worden aangepast om verschillende plasmidegroottes, kopienummer, kweekvolume te accommoderen en kan verschillende apparatuur omvatten voor de bindings-, was- en elutiestappen. Opbrengst is een van de meest prominente verschillen tussen plasmide-preparaten en ze worden vaak verdeeld in de minipreparatie, of miniprep, de midiprep, een maxiprep en een megaprep, afhankelijk van de gewenste opbrengst.
In termen van downstream-toepassingen is een procedure die vaak volgt op plasmide-zuivering de transfectie, die het introduceren van plasmide-DNA in eukaryote cellen omvat. Vaak is het doel van een transfectie-experiment om de structuur van cellen en weefsels te visualiseren met reportereiwitten, zoals die welke de neuronen labelen in de afbeeldingen die u hier ziet.
Soms kunnen meerdere plasmiden die door verschillende zuiveringspreparaten zijn gezuiverd, in dezelfde bacterie worden geïntroduceerd, waardoor een hele biosynthetische route wordt gereproduceerd door de productie van een aantal enzymen gecodeerd door de plasmiden. Het eindresultaat is de productie van een complexe verbinding, zoals het antibioticum dat u hier ziet, door de cel.
Gezuiverde plasmiden kunnen opnieuw worden geïntroduceerd in bacteriën om grote hoeveelheden eiwitten te genereren die door het plasmide worden gecodeerd. Hier ziet u bacteriecellen die worden gehomogeniseerd en gelyseerd voordat een techniek genaamd affiniteitszuivering kan worden uitgevoerd om het doeleiwit te isoleren. Gezuiverd eiwit wordt gekristallis
Plasmied-zuivering is een techniek die wordt gebruikt om plasmide-DNA te isoleren en zuiveren van genomisch DNA, eiwitten, ribosomen en de bacteriële…
Plasmiden zijn circulaire, extra chromosomale DNA-moleculen en in de moleculaire biologie fungeren ze als dragers, of vectoren, voor een specifiek DNA-fragment. Bacteriën worden gebruikt om plasmiden te repliceren, zodat uw DNA van belang in grote hoeveelheden wordt geproduceerd. Het proces waarmee onderzoekers plasmiden uit bacteriën verkrijgen, wordt plasmide-zuivering genoemd, wat in deze video zal worden uitgelegd.
Uiterlijk betekent plasmide-zuivering het zuiveren van plasmiden, maar wat betekent dat precies? Om plasmiden te zuiveren, moeten ze worden geïsoleerd van het bacteriële chromosoom, eiwitten, het bacteriële membraan en bacteriële ribosomen.
Hoewel er veel verschillende kits bestaan voor het zuiveren van plasmiden, blijft het basisprincipe achter plasmide-zuivering voor alle hetzelfde. Eerst wordt de geselecteerde bacteriekolonie gekweekt in een geschikt kweekmedium dat de juiste antibiotica bevat. Dankzij een antibioticaresistentiegen, gecodeerd door het plasmide, zullen alleen bacteriën die het plasmide bevatten in dit medium groeien. De bacteriën worden geoogst en onder een hoge pH gelyseerd. De pH wordt geneutraliseerd, er wordt zout toegevoegd en vervolgens wordt het mengsel gecentrifugeerd om puin en genomisch DNA te verwijderen.
Geneutraliseerd cellysaat wordt op een silicakolom aangebracht. Plasmide-DNA wordt geacht te hechten aan de kolom via een mechanisme genaamd anionenuitwisseling, waarbij DNA, een sterke anion, via een kationenzoutbrug aan de negatief geladen kolom bindt. Andere materialen uit het lysate, zoals eiwitten, worden door de kolom gewassen met buffers met een hoog zoutgehalte. Ten slotte wordt gezuiverd plasmide uit de kolom vrijgegeven wanneer een buffer met een laag zoutgehalte wordt toegevoegd die de zoutbrug verstoort.
Voor deze procedure moeten een labjas, wegwerphandschoenen en beschermende bril worden gedragen.
De bacterieculturen, die zijn getransformeerd met het gewenste plasmide-DNA, moeten worden gekweekt in groeimedia met geschikt antibioticum in een 37°C schudkuvende incubator.
De volgende dag wordt de bacteriecultuur door centrifugatie gepelleteerd en wordt het supernatant verwijderd. Het resterende pellet wordt opgeschort in lysebuffer.
Eenmaal opgeschort, kunnen bacteriën worden overgebracht naar een kleinere buis waar lysebuffer wordt toegevoegd. Lysebuffer heeft een hoge pH en bevat detergenten, zoals natriumdodecylsulfaat, die de bacteriemembranen verstoren en daardoor de bacteriën lyseren. De oplossing wordt troebel met de toevoeging van de lysebuffer en na het mengen wordt de oplossing helderder. De mengsel mag niet worden gevormd omdat er een mogelijkheid bestaat dat genomisch DNA wordt afgeschoord of gebroken, wat vervolgens de zuivering van plasmide-DNA zou kunnen besmetten.
Vervolgens wordt neutralisatiebuffer toegevoegd om de alkalische omstandigheden te neutraliseren en de pH te verlagen. Met voorzichtig mengen zal genomisch DNA en eventuele eiwitten die eraan gebonden zijn, precipitatie ondergaan, terwijl plasmide-DNA in oplossing blijft. Vermijd opnieuw voorzichtig mengen, zodat uw plasmiden vrij zijn van besmetting met genomisch DNA.
Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd en het genomisch DNA/eiwitprecipitaat wordt gepelleteerd. Het supernatant bevat het plasmide-DNA evenals oplosbare eiwitten.
Dit supernatant wordt op de kolom geplaatst door het af te decanteren, een mooie naam voor het afgieten of pipetteren. Het pellet kan worden weggegooid.
Vervolgens passeert hoog zout wasbuffer door de kolom terwijl het DNA aan de silica gebonden blijft. Herhaalde wasstappen met hoge zoutbuffer verwijderen endonucleasen, RNA, eiwitten, kleurstoffen en onzuiverheden met een laag molecuulgewicht. De flow-through van de wasstappen moet worden weggegooid. Zorg ervoor dat na de laatste wasstap de filter volledig droog is zonder resterend buffer. Het plasmide-DNA bevindt zich nog steeds op de filter.
Het plasmide-DNA wordt geëlueerd met steriel water of een elutiebuffer. Het DNA is direct beschikbaar voor gebruik in een breed scala aan toepassingen.
Er zijn verschillende manieren om de zuiverheid van plasmiden na zuivering te verifiëren. Een spectrometer kan worden gebruikt om de absorptie bij verschillende golflengten te vergelijken om de concentratie van plasmide-DNA te bepalen. Een agarosegelanalyse van het gezuiverde plasmide kan bepalen of het plasmide de juiste grootte heeft en of er geen verontreinigingen zijn. Deze stap zorgt ervoor dat er geen genomisch DNA-besmetting is en dat het plasmide niet in bacteriën is gemodificeerd.
De plasmide-zuiveringsprocedure kan worden aangepast om verschillende plasmidegroottes, kopienummer, kweekvolume te accommoderen en kan verschillende apparatuur omvatten voor de bindings-, was- en elutiestappen. Opbrengst is een van de meest prominente verschillen tussen plasmide-preparaten en ze worden vaak verdeeld in de minipreparatie, of miniprep, de midiprep, een maxiprep en een megaprep, afhankelijk van de gewenste opbrengst.
In termen van downstream-toepassingen is een procedure die vaak volgt op plasmide-zuivering de transfectie, die het introduceren van plasmide-DNA in eukaryote cellen omvat. Vaak is het doel van een transfectie-experiment om de structuur van cellen en weefsels te visualiseren met reportereiwitten, zoals die welke de neuronen labelen in de afbeeldingen die u hier ziet.
Soms kunnen meerdere plasmiden die door verschillende zuiveringspreparaten zijn gezuiverd, in dezelfde bacterie worden geïntroduceerd, waardoor een hele biosynthetische route wordt gereproduceerd door de productie van een aantal enzymen gecodeerd door de plasmiden. Het eindresultaat is de productie van een complexe verbinding, zoals het antibioticum dat u hier ziet, door de cel.
Gezuiverde plasmiden kunnen opnieuw worden geïntroduceerd in bacteriën om grote hoeveelheden eiwitten te genereren die door het plasmide worden gecodeerd. Hier ziet u bacteriecellen die worden gehomogeniseerd en gelyseerd voordat een techniek genaamd affiniteitszuivering kan worden uitgevoerd om het doeleiwit te isoleren. Gezuiverd eiwit wordt gekristallis
Plasmiden zijn circulaire, extra chromosomale DNA-moleculen en in de moleculaire biologie fungeren ze als dragers, of vectoren, voor een specifiek DNA-fragment. Bacteriën worden gebruikt om plasmiden te repliceren, zodat uw DNA van belang in grote hoeveelheden wordt geproduceerd. Het proces waarmee onderzoekers plasmiden uit bacteriën verkrijgen, wordt plasmide-zuivering genoemd, wat in deze video zal worden uitgelegd.
Uiterlijk betekent plasmide-zuivering het zuiveren van plasmiden, maar wat betekent dat precies? Om plasmiden te zuiveren, moeten ze worden geïsoleerd van het bacteriële chromosoom, eiwitten, het bacteriële membraan en bacteriële ribosomen.
Hoewel er veel verschillende kits bestaan voor het zuiveren van plasmiden, blijft het basisprincipe achter plasmide-zuivering voor alle hetzelfde. Eerst wordt de geselecteerde bacteriekolonie gekweekt in een geschikt kweekmedium dat de juiste antibiotica bevat. Dankzij een antibioticaresistentiegen, gecodeerd door het plasmide, zullen alleen bacteriën die het plasmide bevatten in dit medium groeien. De bacteriën worden geoogst en onder een hoge pH gelyseerd. De pH wordt geneutraliseerd, er wordt zout toegevoegd en vervolgens wordt het mengsel gecentrifugeerd om puin en genomisch DNA te verwijderen.
Geneutraliseerd cellysaat wordt op een silicakolom aangebracht. Plasmide-DNA wordt geacht te hechten aan de kolom via een mechanisme genaamd anionenuitwisseling, waarbij DNA, een sterke anion, via een kationenzoutbrug aan de negatief geladen kolom bindt. Andere materialen uit het lysate, zoals eiwitten, worden door de kolom gewassen met buffers met een hoog zoutgehalte. Ten slotte wordt gezuiverd plasmide uit de kolom vrijgegeven wanneer een buffer met een laag zoutgehalte wordt toegevoegd die de zoutbrug verstoort.
Voor deze procedure moeten een labjas, wegwerphandschoenen en beschermende bril worden gedragen.
De bacterieculturen, die zijn getransformeerd met het gewenste plasmide-DNA, moeten worden gekweekt in groeimedia met geschikt antibioticum in een 37°C schudkuvende incubator.
De volgende dag wordt de bacteriecultuur door centrifugatie gepelleteerd en wordt het supernatant verwijderd. Het resterende pellet wordt opgeschort in lysebuffer.
Eenmaal opgeschort, kunnen bacteriën worden overgebracht naar een kleinere buis waar lysebuffer wordt toegevoegd. Lysebuffer heeft een hoge pH en bevat detergenten, zoals natriumdodecylsulfaat, die de bacteriemembranen verstoren en daardoor de bacteriën lyseren. De oplossing wordt troebel met de toevoeging van de lysebuffer en na het mengen wordt de oplossing helderder. De mengsel mag niet worden gevormd omdat er een mogelijkheid bestaat dat genomisch DNA wordt afgeschoord of gebroken, wat vervolgens de zuivering van plasmide-DNA zou kunnen besmetten.
Vervolgens wordt neutralisatiebuffer toegevoegd om de alkalische omstandigheden te neutraliseren en de pH te verlagen. Met voorzichtig mengen zal genomisch DNA en eventuele eiwitten die eraan gebonden zijn, precipitatie ondergaan, terwijl plasmide-DNA in oplossing blijft. Vermijd opnieuw voorzichtig mengen, zodat uw plasmiden vrij zijn van besmetting met genomisch DNA.
Het mengsel wordt vervolgens gecentrifugeerd en het genomisch DNA/eiwitprecipitaat wordt gepelleteerd. Het supernatant bevat het plasmide-DNA evenals oplosbare eiwitten.
Dit supernatant wordt op de kolom geplaatst door het af te decanteren, een mooie naam voor het afgieten of pipetteren. Het pellet kan worden weggegooid.
Vervolgens passeert hoog zout wasbuffer door de kolom terwijl het DNA aan de silica gebonden blijft. Herhaalde wasstappen met hoge zoutbuffer verwijderen endonucleasen, RNA, eiwitten, kleurstoffen en onzuiverheden met een laag molecuulgewicht. De flow-through van de wasstappen moet worden weggegooid. Zorg ervoor dat na de laatste wasstap de filter volledig droog is zonder resterend buffer. Het plasmide-DNA bevindt zich nog steeds op de filter.
Het plasmide-DNA wordt geëlueerd met steriel water of een elutiebuffer. Het DNA is direct beschikbaar voor gebruik in een breed scala aan toepassingen.
Er zijn verschillende manieren om de zuiverheid van plasmiden na zuivering te verifiëren. Een spectrometer kan worden gebruikt om de absorptie bij verschillende golflengten te vergelijken om de concentratie van plasmide-DNA te bepalen. Een agarosegelanalyse van het gezuiverde plasmide kan bepalen of het plasmide de juiste grootte heeft en of er geen verontreinigingen zijn. Deze stap zorgt ervoor dat er geen genomisch DNA-besmetting is en dat het plasmide niet in bacteriën is gemodificeerd.
De plasmide-zuiveringsprocedure kan worden aangepast om verschillende plasmidegroottes, kopienummer, kweekvolume te accommoderen en kan verschillende apparatuur omvatten voor de bindings-, was- en elutiestappen. Opbrengst is een van de meest prominente verschillen tussen plasmide-preparaten en ze worden vaak verdeeld in de minipreparatie, of miniprep, de midiprep, een maxiprep en een megaprep, afhankelijk van de gewenste opbrengst.
In termen van downstream-toepassingen is een procedure die vaak volgt op plasmide-zuivering de transfectie, die het introduceren van plasmide-DNA in eukaryote cellen omvat. Vaak is het doel van een transfectie-experiment om de structuur van cellen en weefsels te visualiseren met reportereiwitten, zoals die welke de neuronen labelen in de afbeeldingen die u hier ziet.
Soms kunnen meerdere plasmiden die door verschillende zuiveringspreparaten zijn gezuiverd, in dezelfde bacterie worden geïntroduceerd, waardoor een hele biosynthetische route wordt gereproduceerd door de productie van een aantal enzymen gecodeerd door de plasmiden. Het eindresultaat is de productie van een complexe verbinding, zoals het antibioticum dat u hier ziet, door de cel.
Gezuiverde plasmiden kunnen opnieuw worden geïntroduceerd in bacteriën om grote hoeveelheden eiwitten te genereren die door het plasmide worden gecodeerd. Hier ziet u bacteriecellen die worden gehomogeniseerd en gelyseerd voordat een techniek genaamd affiniteitszuivering kan worden uitgevoerd om het doeleiwit te isoleren. Gezuiverd eiwit wordt gekristallis
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and how is it used in molecular biology?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that acts as a vector to carry specific DNA fragments. When introduced into bacteria through transformation, plasmids are replicated, creating numerous copies of the DNA of interest. This allows researchers to mass-produce desired genetic material for various molecular biology applications.
Q2: Why is bacterial culture grown with antibiotics during plasmid purification?
Antibiotics are added to the growth media to select for bacteria containing the plasmid. The plasmid encodes an antibiotic resistance gene, allowing only bacteria with the plasmid to survive in the antibiotic-containing media. This ensures that the bacterial culture used for purification contains the desired plasmid.
Q3: How does anion exchange help purify plasmid DNA on a silica column?
Plasmid DNA, a strong anion, binds to the negatively charged silica column through a cation salt bridge mechanism called anion exchange. Proteins and other contaminants are washed away with high salt buffers, while plasmid DNA remains bound. When low salt buffer is added, the salt bridge is disrupted, releasing purified plasmid DNA from the column.
Q4: Why should the lysate mixture not be vortexed during plasmid purification?
Vortexing can shear or break apart genomic DNA, which would then contaminate the plasmid DNA preparation. Instead, gentle mixing is used throughout the procedure to keep genomic DNA intact so it precipitates during neutralization and can be separated from the plasmid DNA in solution.
Q5: What methods verify the purity and quality of purified plasmid DNA?
A spectrophotometer measures absorbance at different wavelengths to determine plasmid DNA concentration and purity. Agarose gel electrophoresis concept procedure and applications can verify that the plasmid is the correct size and free from contaminants like genomic DNA. Together, these techniques confirm successful purification and that the plasmid was not modified during bacterial replication.
Q6: How do miniprep, midiprep, maxiprep, and megaprep differ?
These plasmid purification methods are distinguished by their yield and are selected based on the desired amount of plasmid DNA needed. Miniprep produces the smallest yield, while megaprep produces the largest. The choice depends on downstream applications and the volume of bacterial culture available for processing.
Q7: What happens to purified plasmids after they are isolated from bacteria?
Purified plasmids are used in various downstream applications. One common procedure is transfection inserting genetic materials into mammalian cells to visualize cellular structures with reporter proteins. Plasmids can also be reintroduced into bacteria to produce large amounts of encoded proteins, which are then isolated and analyzed for research and biotechnology purposes.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:44
Principal Components of the Plasmid Purification Procedure
2:25
Plasmid Purification Procedure: Step by Step
5:53
Applications
7:51
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved