Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen
October 27th, 2009
De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.
Het bio flux-systeem is een geautomatiseerd instrument en microfluïdisch apparaat voor het uitvoeren van live celonderzoeken onder gecontroleerde schuine stroming. Dit systeem gebruikt microfluïdische technologie op plaatniveau om stromingscellen op micronschaal te integreren in SBS-standaard Well-platen. BioFlex kan worden gebruikt om bloedplaatjesadhesie en -aggregatie te bestuderen met hoge doorvoer en verminderde bloedvolumes.
Volbloed gelabeld met fluorescerende kleurstof wordt aan de putjes toegevoegd en stroomt vervolgens door de kanalen. Onder gecontroleerde schuine stroming wordt microscopische gegevens met hoge resolutie geproduceerd, die de bloedplaatjesadhesie en -aggregatie kwantificeren in aanwezigheid van geneesmiddelen en andere variërende parameters. Hallo, ik ben Mike Schwartz van het RD-lab bij Flexion Biosciences.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het gebruik van microfluïdische stroomcellen in bloedplaatjesadhesie-onderzoeken. We gebruiken dit protocol in ons lab voor verschillende vasculaire biologie-onderzoeken. Dus laten we beginnen.
Voordat u het stroomcelexperiment uitvoert, moeten de microfluïdische kanalen van de bio flux-plaat worden voorbereid met een eiwitcoating van interesse, collageen 1, dat in dit experiment zal worden gebruikt. Elk van de 24 experimentele kanalen van de bio flux-plaat is verbonden met een inlaatput en een uitlaatput voor deze plaat. De inlaatput is de linkerput die het kanaal voedt en de uitlaatput is rechts, verdun de collageen 1-voorraad tot een concentratie van 200 microgram per milliliter.
In 0,02 molair azijnzuur zijn 20 microliter nodig voor elke gebruikte kanaal. Aangezien dit experiment 11 kanalen vereist, maak 200 microliter collageencoating. Eén kanaal blijft ongecoat en wordt gemengd door voorzichtig itereren met een micropipettip.
Voeg 20 microliter coating toe aan elk respectief kanaal door een micropipet te gebruiken om de vloeistof in de binnenste pons van de put te doseren. Voed het microfluïdische kanaal van interesse zoals hier getoond met de gele kleurstof. Neem één kanaal op zonder collageen als een negatieve controle voor bloedplaatjesadhesie en -aggregatie. Nadat de collageencoating is toegevoegd aan alle respectieve kanalen, bevestigt u de interface aan de plaat.
Als u de bio flux 1000-interface gebruikt, kunt u beide vergrendelingen op het podium klemmen. Als u de Bio flux 200-interface eerste vinger gebruikt, draait u de vier schroeven vast. En dan, zodra ze allemaal zijn ingesteld, gebruikt u de koppelsleutel om volledig vast te draaien.
De koppelsleutel klikt wanneer deze het maximum bereikt. Gebruik de handmatige modus in de bio flux-software om perfusie toe te passen op de gewenste kanalen met 2D per centimeter vierkant vanaf de uitlaat. Gebruik een objectief met laag vermogen op een microscoop om de inlaatput en de tegenoverliggende binnenste pons te vinden die met vloeistof wordt gevuld.
Je zou eerst een klein beetje vloeistof moeten zien, dat langzaam de binnenste pons vult na enkele minuten en wanneer de binnenste inlaatpons is gevuld, stopt u de perfusie op alle kanalen door op stop in de software te drukken. Incubeer de plaat een uur op kamertemperatuur. Gedurende deze incubatieperiode kunt u beginnen met het voorbereiden van het volbloed aan het einde van de eenuurs incubatie.
Zodra het bloed is voorbereid, verwijdert u de interface en voegt u één milliliter PBS toe plus calcium en magnesiumionen aan de uitlaat. Begin de perfusie vanaf de uitlaatput op twee dines per centimeter vierkant en zet de perfusie door voor 10 minuten. Stop na 10 minuten de perfusie. Nadat de interface is verwijderd, verwijdert u overtollig PBS van zowel de inlaat- als uitlaatputten.
Verwijder nooit de vloeistof die de binnenste pons vult. Om de kanalen te blokkeren, voegt u één milliliter blokkeeroplossing toe aan elke uitlaat. Wel, om te worden gebruikt, perfuseert u vanaf de uitlaatput op twee dine per centimeter vierkant en zet de perfusie door voor 10 minuten.
Stop de perfusie na 10 minuten en verwijder de interface. De kanalen zijn nu klaar en kunnen gedurende de dag worden gebruikt terwijl de plaat wordt bekleed met collageen. Gedurende een incubatie van een uur moet vers menselijk bloed van een vastende persoon worden voorbereid voor beeldvorming en in de plaat worden gebracht.
Bloed moet worden opgezogen in natriumcitraat, een antistollingsmiddel, en binnen drie uur na verzameling worden gebruikt. Voeg eerst een vier millimolair voorraad calcium M in DMSO toe aan het bloed in een verdunning van één op 1000 volume per volume. Om vier micromolair calcium am te verkrijgen, wordt gemengd door voorzichtig omkeren.
Vervolgens doseert u één milliliter van het calcium am-gelabelde bloed in tien een punt vijf milliliter microbuisjes. Voeg GP twee B drie a-remmerantilichaam toe aan elke buis op de gewenste verdunning. Zorg ervoor dat u een negatieve controle zonder antilichaam en een ongerelateerde positieve controle met antilichamen opneemt, gemengd door voorzichtig omkeren.
Incubeer de buisjes op kamertemperatuur gedurende één uur met voorzichtig omkeren elke 10 minuten voordat u het stroomcelexperiment uitvoert. Er moet een geautomatiseerd protocol worden ingesteld in de bio flux-besturingsmodule voor collageen.Een. Stel een protocol in om het bloed gedurende tien negen centimeter vierkant gedurende 10 minuten vanaf de uitlaat te laten lopen.
Gebruik de BioFlex 1000-werkstationgegevensverzamelparameters, die de gewenste podiumposities omvatten, acquisitie in de fitz-golflengte en time-lapse-instelling. Een typische beeldverzameling voor dit protocol zou één gezichtsveld per kanaal omvatten om te worden vastgelegd met behulp van een 10 x objectief elke 30 seconden gedurende een totale duur van 10 minuten. Aanvullende gezichtsvelden en alternatieve TimeLapse-instellingen zijn ook mogelijk.
Zodra het geautomatiseerde protocol en de gegevensverzamelparameters zijn ingesteld, keert u terug naar de BioFlex-plaat en verwijdert u de vloeistof aan beide kanten van het kanaal, behalve de binnenste ponsen. Zorg ervoor dat
Overzicht
Dit artikel presenteert een microfluïdische well-plate-indeling voor bloedplaatjesaggregatie-assays die fysiologische afschuifstromingsomstandigheden simuleren. De methode maakt high-throughput-studies van bloedplaatjesadhesie en -aggregatie mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Vasculaire biologie
- Microfluïdica
Achtergrond
- Bloedplaatjesadhesie is cruciaal voor hemostasis en trombose.
- Conventionele assays repliceren geen afschuifstromingsomstandigheden.
- Microfluïdische technologie maakt nauwkeurige controle van stromingsdynamica mogelijk.
- Hogeresolutiemicroscopie kan bloedplaatjesinteracties kwantificeren.
Doel van studie
- Om een microfluïdische assay te ontwikkelen die fysiologische omstandigheden nabootst.
- Om de effecten van geneesmiddelen op het gedrag van bloedplaatjes te beoordelen.
- Om de efficiëntie van bloedplaatjesaggregatiestudies te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van microfluïdische kanalen met collageencoating.
- Gebruik van een BioFlux-systeem voor gecontroleerde afschuifstromingexperimenten.
- Hogeresolutiebeeldvorming van bloedplaatjesadhesie en -aggregatie.
- Kwantificering van resultaten met behulp van geautomatiseerde gegevensverwerving.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle emulatie van afschuifstromingsomstandigheden in bloedplaatjesassays.
- High-throughput-capaciteit met verminderde bloedvolumevereisten.
- Kwantitatieve gegevens over bloedplaatjesinteracties met variërende parameters.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de assay voor geneesmiddelentest.
Conclusies
- De microfluïdische well-plate-indeling verbetert bloedplaatjesaggregatiestudies.
- Deze methode biedt inzichten in het gedrag van bloedplaatjes onder fysiologische omstandigheden.
- Toekomstige toepassingen kunnen geneesmiddelontwikkeling en vasculair onderzoek omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microfluidic flow cell assays for platelet adhesion and aggregation provide physiologically relevant, quantitative data critical for early-stage vascular biology and thrombosis research. By replicating shear flow conditions, these assays enable predictive evaluation of antiplatelet compounds and mechanistic de-risking at the target validation stage. This approach supports portfolio decisions by delivering high-throughput, reproducible insights into platelet function under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of platelet activation pathways under controlled shear flow.
- Supports functional validation of antiplatelet targets using quantitative aggregation metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing compound effects on adhesion versus aggregation.
- Provides predictive confidence for advancing vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assay formats compatible with SBS well-plate workflows.
- Generates reproducible, quantitative outputs for compound screening and IC50 determination.
- Prepares validated biological systems for downstream pharmacological evaluation.
- Enables reliable comparison of inhibitor efficacy across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro platelet function assays with physiological shear conditions relevant to human disease.
- Supports translational biomarker development by quantifying aggregation endpoints under flow.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of antithrombotic agents.
- Reduces biological risk by modeling disease-relevant vascular responses.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic assay bridges early discovery, lead identification, and preclinical evaluation for antiplatelet and vascular biology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for platelet activation and aggregation.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for quantitative inhibitor profiling.
- Analytics: Provides high-resolution imaging and quantitative aggregation measurements for robust data analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant vascular models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for vascular biology and drug screening pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in platelet-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes assay conditions and enables high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and antithrombotic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, vascular biology, and quantitative imaging analysis.
- Needs access to automated microfluidic platforms and high-resolution microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup, data acquisition, and analysis protocols.
- May require adaptation for different matrix proteins or flow conditions depending on disease context.
- Limited by blood sample stability and donor variability, necessitating careful experimental planning.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:16
Preparation of the Microfluidic Channels of a BioFlux Plate
4:34
Preparing the Blood with GPIIb/IIIa Inhibitory Antibody
5:41
Running the Flow Cell Experiment on the BF1000 Workstation
8:19
Platelet Adhesion and Aggregation Results
8:58
Conclusion
