Name: Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-15T17:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer een nieuwe techniek om mtDNA-replicatie in neuronen te visualiseren met EdU-incorporatie en tyramide signaalversterking. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale biogenese en neurologische ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Subsidies NS-38849 en de DK-076160, de Juvenile Diabetes Research Foundation Centrum voor de Studie van complicaties bij diabetes, het Programma voor Neurologie onderzoek en ontdekking en de A. Alfred Taubman Medical Research Institute aan de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikte de morfologie en Image Analysis Kern van het Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door National Institutes of Health Grant 5P60 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten. De auteurs danken Scott T. Clarke van Molecular Probes / Invitrogen voor zijn waardevolle adviezen over de verschillende Click-iT Edu labeling kits en de gulle donatie van de reagentia voor de initiële ontwikkeling van het Edu amplificatietechniek ondersteunen.

1. Voorbereiding van de Neuronen <ol><li> Dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen worden geteeld op steriele (autoclaaf) 12 mm glas dekglaasjes in een 24-well plaat cultuur. </li><li> De 10 mM voorraad van onderwijs (in DMSO, Click-iT Edu Microplate Assay Kit) is meestal verdund 1:100 in cultuur medium om een ​​10x EDU-oplossing (100 uM) en vervolgens verdund 1:10 in de cultuur putten (bijvoorbeeld 30 pi van de 10X EDE oplossing in een totaal van 300 ul van cultuur medium). DRG neuronen worden geïncubeerd met een uiteindelijke concentratie van 10 uM Edu bij 37 ° C en 5% CO 2 tussen 2-24 uur. De lengte van de tijd hangt af van hoe behandelingen effect op de snelheid van het mtDNA synthese. </li><li> In een zuurkast, zijn DRG neuronen vastgesteld in 2% paraformaldehyde gedurende 10-15 min bij kamertemperatuur, tweemaal gewassen in 1x PBS 2-5 minuten elke wasbeurt en opgeslagen in verse 1X PBS gedurende maximaal 1 maand bij 4 ° C. </li><li> Coverslips worden overgedragen met een fijne punt een tang om een ​​voorbereide vochtige kamer (Corning Bioassay schotel met zwart behangen bodem voor contrast, verpakt in aluminiumfolie aan het licht gevoelige componenten en bevochtigd met water verzadigd Kimwipes beschermen) en geplaatst op een vel Parafilm M dat voorziet in een hydrofoob oppervlak om de oplossingen te beperken tot het dekglaasje. Het protocol hieronder is ontworpen voor 28 dekglaasjes en oplossingen worden voorbereid voor 32 dekglaasjes (ongeveer 14% extra volume). Oplossingen met dure of een beperkte componenten zijn zo gemaakt dat 75 tot 80 pi worden gebruikt op elke dekglaasje aan. Anders worden 200-300 ul gebruikt voor het wassen en te blokkeren oplossingen om grondig te wassen uit eerdere oplossingen. </li><li> Opnieuw toepassen 1X PBS op het oppervlak van elk dekglaasje (200-300 pi) te dekken. De voorbereiding van de Click-iT test en tyramide signaalversterking kits zoals hieronder en in de instructies van de fabrikant beschreven. </li></ol> De voorbereiding van Click-iT Edu Microplate Assay Kit De meeste componenten van de Click-iT Edu Microplate Assay Kit komen pre-gemaakt en worden bewaard bij 4 ° C [2x Click-iT Reactie Buffer (10x Component E), CuSO4 (100 mM, Component F), Click-iT EDU fixatief ( component D) en blokkerende buffer (2x Component H)]. Click-iT EDU Buffer Additief (10x Component G) wordt opgeslagen bij -20 ° C om te voorkomen dat het geel-bruin in de tijd. Deze component tolereert herhaalde vries-dooi cycli. De Oregon Green 488 azide (Component B) moet worden verdeeld in kleine porties (10-20 pi) naar vries-dooi cycli te minimaliseren en opgeslagen bij -20 ° C. De voorbereiding van een stamoplossing van de anti-Oregon Green HRP-conjugaat (afdeling I), voeg 75 ul van Milli Q dH 2 O aan de flacon. Meng door zachtjes te pipetteren of door inversie schuimvorming te voorkomen en op te slaan bij 4 ° C. Niet vortex. Voorbereiding van de TSA Kit # 12, met HRP geit anti-konijn IgG en Alexa Fluor 488 tyramide Kit Ter voorbereiding van de tyramide stamoplossing, ontbinding van de vaste materiaal (Alexa Fluor 488 tyramide, Component A) in 150 pi van DMSO (Component B). Keer de injectieflacon meerdere malen aan een tyramide laag op de zijkanten van de flacon. Bewaar voorraad oplossing in kleine porties (10-20 pi) bij ≤ -20 ° C, uitgedroogd en beschermd tegen licht. 2. Klik-iT 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EDU) Labeling NB: Alle oplossingen zijn verwijderd met een lamp overdracht pipet met een 200 pi tip aangebracht op het einde om voorzichtig vloeistoffen te verwijderen zonder verlies van cellen. Vermijd het gebruik van een vacuüm lijn, die meestal verwijderen oplossingen te krachtig. Een lamp pipet wordt gebruikt om voorzichtig coverslips overspoelen met 200 tot 300 pi van wasoplossingen grondig te spoelen de vorige oplossing. <ol><li> Cellen worden gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een overdekte vochtige kamer. Gebruik 1% Triton-X-100 stockoplossingen. <ul><li> Maak 3000 pi van 0,1% Triton-X-100 door het toevoegen van 300 pi 1% Triton-X-100 voorraad 2700μL 1X PBS. </li><li> Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan. </li></ul></li><li> Verwijder de Triton X-100-oplossing en spoel tweemaal met 1X PBS. </li><li> Endogene peroxidase activiteit is gedoofd door een 1% H 2 O 2 in 1X PBS-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verdunnen 30% H 2 O 2-oplossing met 1X PBS. Deze oplossing moet vers gemaakt, maar kan worden gemaakt tijdens de 10 minuten permeabilisatie stap boven (stap 3.1). <ul><li> Maak 3000 pi van een 1% H 2 O 2 door de toevoeging van 100 pi 30% H 2 O 2-2900 pi 1X PBS. </li><li> Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan. </li><li> Verwijder de peroxidase-oplossing en spoel tweemaal met 1X PBS. </li></ul></li><li> Click-iT Edu Reactie <ul><li> Voor 32 dekglaasjes (32 x 80 = pi2560 pi) een totaal van 2560 pi nodig is. De 2x reactie is gemaakt in 1280 uL, dat is de helft van het totale volume van de reactie. </li><li> Vers voor de voorbereiding van de Click-iT Reactie Cocktail aan het starten van de 5 minuten na de fix (stap 3.5). </li><li> Meng de cocktail door en neer te pipetteren. Geen vortex bij het maken van deze reactie. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x Reactie Cocktail Componenten zijn van Click-iT Edu Microplate Assay Kit </td><td> Helft van het volume: 1280 pi </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132.8 pi </td></tr><tr><td> 2x Click-iT Reactie Buffer (10x Component E) </td><td> 100,3 pi </td></tr><tr><td> Click-iT EDU Buffer Additief (10x Component G) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mM, Component F) </td><td> 25,6 uL </td></tr><tr><td> Oregon Green Azide (Component A) </td><td> 6,4 pi </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 1290.7 pi </td></tr></tbody></table> OPMERKING: De volumes hierboven gebruikt zijn evenredig met de hoeveelheden die in de Click-iT Edu Microplate Assay kit richtingen. Het uiteindelijke volume van Reaction Cocktail is iets meer dan 1280 pi. </li><li> De 2X Click-iT reactie wordt verdund met een gelijk volume van Click-iT EDU fixatief (Component D) rechts voor gebruik. Het mengen van deze samen maakt een uniforme reactie oplossing voor alle dekglaasjes. </li><li> Voeg 1290.7 ul Click-iT EDU fixatief (Component D) om de 1290.7 pi reactie cocktail. Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan. </li></ul></li><li> Post-fix van de neuronen met Click-iT EDU fixatief (Component D) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de fix en voeg reactie cocktail van bovenaf (stap 3.4). Cover ter bescherming tegen licht en voor 25 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Verwijder voorzichtig de reactie Cocktail. Was twee keer met verdund 1X Blocking Buffer (2X Component H). <ul><li> Maak 5200 pi van 1X Blocking Buffer door verdunning van 2600 pi Blocking Buffer (2x Component H) met een gelijk volume van MilliQ d H 2 O (2600 pi). Gebruik 75-80 pi per dekglaasje aan. </li></ul></li><li> Onder een epi-fluorescentie microscoop, controleer Oregon Green kleuring in kernen van mitotisch actieve controle cellen. </li></ol> 3. Tyramide signaalversterking (TSA) van Edu Signal <ol><li> Voeg 1% TSA blok oplossing voor elk dekglaasje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. <ul><li> Maak pi 6000 van 1% TSA block-oplossing door het wegen van 0,06 g van TSA Blocking Reagent (TSA kit # 12, Component D) en toe te voegen aan 6000 pi 1X PBS. Vortex te mengen. Toevoeging van 5% geit serum in de 1% TSA blok oplossing zal vaak helpen om niet-specifieke binding te verminderen. </li></ul></li><li> Kort draaien de anti-Oregon Green mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam voorraad (afdeling I van de Click-iT EDU Microplate Assay), bereid 2-24 uur van tevoren TSA. Verdun het primaire antilichaam 1:300 in 1% TSA blockingbuffer en omdraaien of pipet op en neer voorzichtig om te mengen. Geen vortex om te voorkomen dat het verstoren van de HRP-geconjugeerd antilichaam. Verwijder 1% TSA block-oplossing, voeg 75 ul aan elke dekglaasje en incubeer overnacht bij 4 ° C. <ul><li> De antistof kan worden gebruikt meer geconcentreerd, zoals 1:150, maar het wordt geleverd in beperkte hoeveelheden, dus gebruik het met mate. Nogmaals, toevoeging van 5% geit serum in de 1% TSA blok oplossing helpen vaak om niet-specifieke binding van het anti-Oregon Green mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam te verminderen. </li><li> Maak 2560 pi van een 1:300 antilichaam-oplossing door het toevoegen van 8,53 pi van de voorraad Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT Edu Microplate Assay) tot 2560 il 1% TSA blokkeren. Meng door zachtjes te pipetteren of inversie. </li></ul></li><li> De volgende dag, verwijder dan het antilichaam-oplossing en spoel drie keer met 1X PBS. Incubeer de dekglaasjes in de finale was voor een extra 30-60 minuten op kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat de ongebonden primaire antilichaam wordt verwijderd. </li><li> Bereid tyramide reactie voor 2560 pi (32 dekglaasjes x 80 pi). <ul><li> Maak 400 pi van een 0,15% H 2 O 2-oplossing (100X) door toevoeging van 2 pl van de 30% H 2 O 2 (TSA kit # 12, Component F) tot boven 398 pi Amplification Buffer (TSA kit # 12, Component E) . Dit moet vlak voor nodig. </li><li> Voor een uiteindelijk volume van 2560 il combineren: <ul><li> 25,6 pi tyramide-488 (TSA kit Component A) </li><li> 2508.8 pi Amplification Buffer (TSA kit Component E) </li><li> 25,6 pi 0,15% H 2 O 2 (van boven voor een laatste 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Verwijder 1X PBS en incubeer met de tyramide reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li></ul></li></ul></li><li> Verwijder tyramide reactie en spoel drie keer met 1X PBS, incuberen in de finale was gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur als voorheen. </li><li> Controleer op mtDNA etikettering krachtens een epi-fluorescentie microscoop. <ul><li> Mount coverslips op glas microscoopglaasjes met een antifade montage medium, zoals ProLong Goud met DAPI. Als alternatief kan de Edu etikettering en versterking worden gevolgd door standaard tl-immunocytochemie naar andere cellulaire merkers label. </li></ul></li></ol> 4. Representatieve resultaten: Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie als een marker voor mitochondriële Biogenesis Wij zijn geïnteresseerd in hoe de sensorische neuronen (figuur 1) regelen van het aantal mitochondria. Dit protocol zal label nieuw gesynthetiseerde mtDNA met een fluorescente marker als een manier van meten nieuwe mitochondriën. De opname van de synthetische nucleotide Edu, gevolgd door de klik chemie van de Oregon Green-azide en de daaropvolgende amplificatie met de Alexa-Fluor 488 tyramide resultaten in de etikettering van mtDNA met een groen fluorescerend signaal (figuur 2). Indien correct gedaan, het versterkte groene signaal is voldoende hoger is dan achtergrond fluorescentie (zoals cellulaire autofluorescentie of een side-effect van de HRP-TSA reactie). Deze techniek is bedoeld om nieuw gerepliceerd mtDNA label om te visualiseren en te kwantificeren mtDNA biogenese binnen subcellulaire compartimenten van neuronen (figuur 3). De EDE etikettering zorgt voor volgend fluorescent label immunocytochemie aan andere cellulaire merkers zoals neurofilament (Figuur 3D). De TSA reactie kan ook gedaan worden met andere fluorescerende Alexa Fluor tyramides zoals Alexa Fluor 594-tyramide. Dit resulteert in een groen fluorescerend nucleair signaal van de Oregon Green-azide Klik reactie in de kern, maar geen groen signaal in mtDNA, die voorafgaand aan de TSA niet op te sporen. De versterking met Alexa Fluor 594-tyramide versterkt de nucleaire label en onthult de opgenomen EDE in mtDNA met een rode fluorescente signaal (figuur 4). Een soortgelijke versterking procedure wordt gebruikt om BrdU incorporatie in nieuw gesynthetiseerde mtDNA (figuur 5) visualiseren, maar deze methode vereist een extra stap om het BrdU epitoop te herstellen door een van beide een harde zoutzuur (HCl) of enzym verteren, wat niet noodzakelijk is voor Edu etikettering. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiger differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van embryonale (links) en volwassen (rechts) dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen die doorgaans worden gebruikt voor analyse. Bars = 10 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische voorstelling die de procedure voor de etikettering EDE in mtDNA met een groen fluorescerend signaal. Het schema geeft de drie-stappen-protocol voor de etikettering EDE in mtDNA met een groen fluorescerend signaal. Mitotisch actieve F11 neuroblastomacellen dienen als een positieve controle en illustreren de etikettering patroon van Edu, dat werd opgericht in nucleair en mitochondriaal DNA. De eerste stap (P1) is om een ​​thymidine analoog op te nemen in nieuw gesynthetiseerde mtDNA door het incuberen van cellen in de aanwezigheid van Edu. De tweede stap (P2) is gebaseerd op klik chemie opgenomen Edu label met een Oregon Green-azide. Groene signaal is zichtbaar in kernen van cellen die hun nucleaire DNA gerepliceerd. De laatste stap (P3) is het versterken van de Oregon Green-azide-signaal door incubatie met een HRP-geconjugeerd konijn antilichaam tegen Oregon Green gevolgd door incubatie met Alexa Fluor 488 gelabeld tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) naar groen signaal in mtDNA te visualiseren. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Edu etikettering van mtDNA in dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen. Neuronen zijn geïncubeerd met Edu en het signaal wordt vervolgens versterkt tot mtDNA dat verwerkt Edu onthullen. Vertegenwoordiger van fluorescentie beelden overlay op doorvallend licht zien groen punctata signalen versterkt EDU (EDU-OG-TSA, groen) opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde mtDNA van zowel embryonale (A) en volwassen (BD) DRG neuronen. De EDU etikettering procedure maakt voor de latere immunofluorescentiekleuring van neuronale markers, zoals neurofilament (D, αNF, in het rood). Schaal bars = 10 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Schematische voorstelling die de procedure voor de etikettering EDE in mtDNA met een rood fluorescerend signaal. Het schema geeft de drie-stappen-protocol voor de etikettering EDE in mtDNA met een rood fluorescerend signaal. Mitotisch actieve F11 neuroblastomacellen dienen als een positieve controle en illustreren de etikettering patroon van Edu, dat werd opgericht in nucleair en mitochondriaal DNA. De eerste stap (P1) is om een ​​thymidine analoog op te nemen in nieuw gesynthetiseerde mtDNA door het incuberen van cellen in de aanwezigheid van Edu. De tweede stap (P2) is gebaseerd op klik chemie opgenomen Edu label met een Oregon Green-azide. Groene signaal is zichtbaar in kernen van cellen die hun nucleaire DNA gerepliceerd. De laatste stap (P3) is aan de Oregon Green-azide signaal te versterken door incubatie met een HRP-geconjugeerd konijn antilichaam tegen Oregon Green gevolgd door incubatie met Alexa Fluor 594 gelabeld tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) te visualiseren rood sein in mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. BrdU etikettering en tyramide signaalversterking met een groene of rode fluorescente signaal in mtDNA. Het schema geeft de procedure voor de etikettering BrdU in nieuw gesynthetiseerde mtDNA met ofwel een groen of rood fluorescerend signaal. Een eerste stap is nodig om de BrdU epitoop herstellen door ofwel een zuur (HCl) of enzym verteren, wat niet noodzakelijk is voor Edu etikettering. De volgende stap is incuberen met een muis primaire anti-BrdU antilichaam. Dit wordt gevolgd door incubatie met een mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd geit anti-muis antilichaam. Tenslotte wordt het signaal versterkt met een groene of rode fluorescent gelabelde tyramide in de aanwezigheid van waterstofperoxide (H 2 O 2) om aan te geven in het mtDNA te visualiseren.

<ol><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li>
<li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28De%29constructing+mitochondria%3A+what+for%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li>
<li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+matters%3A+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+%5B%283%29H%5Dthymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li>
<li>Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li>
<li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Ethynyl-2%27-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li>
<li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro.+J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li>
<li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li>
<li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li>
</ol>

We ontwikkelden een gevoelige test om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in individuele cellen met behulp van een tyramide signaalversterking van Edu label. Een van de grootste problemen tijdens de optimalisatie van dit protocol is de inconsistente resultaten tussen dekglaasjes. Wijzigingen zijn aangebracht in de Invitrogen kit protocollen om te voorkomen dat het mengen van kleine volumes op individuele coverslips en het maken van meester-oplossingen te gebruiken voor alle dekglaasjes. De 75-80 pi gebruikt voor elke 12 mm ronde glazen dekglaasje is een ideale volume volledig te bedekken van het oppervlak en biedt voldoende oplossing om consistente resultaten tussen monsters te geven. Incubatie tijden en reagens concentraties werden geoptimaliseerd, maar verbeteringen kunnen worden gezien met aanpassingen aan hen. Het protocol is ontwikkeld om elk proces eenmaal uit te voeren. Er zijn echter enkele van de stappen zijn herhaald met nieuwe oplossingen voor monsters die niet na de eerste poging herstellen. In het bijzonder hebben de EDU klikken reactie stappen (3,4 tot 3,6) is herhaald zonder een significante toename in de achtergrond fluorescentie. De anti-Oregon Green-HRP antilichaam incubatie (4,1 tot 4.3) en de tyramide amplificatie (4.4-4.5) stappen zijn ook herhaald, maar resulteert vaak in een slechte signaal-ruisverhouding als gevolg van de verhoogde achtergrond fluorescentie. De meest gevoelige reagentia zijn de Click-iT EDU Buffer Additief (Component G) en het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam (afdeling I) van de Click-iT Edu Microplate Assay kit. De Click-iT Edu Buffer Additief draait geleidelijk aan geel na verloop van tijd indien bewaard bij 4 ° C en tussen de 6-12 maanden donkerder aanzienlijk. Opslag van de Click-iT Edu Buffer Additief bij -20 ° C zal verlichten deze kwestie. De etikettering en de tyramide versterking stappen werken het best als het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam wordt gebruikt binnen 4-6 maanden voor de reconstructie van het in MilliQ dH 2 O. De milde etikettering van onderwijs in mtDNA zorgt voor directe vergelijkingen met extra cellulaire merkers 9-11 en verbetert het nut van deze techniek ten opzichte van andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), die vereist dat een ruwe behandeling te herstellen zijn epitoop binnen DNA. Ons laboratorium 11-12 en 13-15 hebben anderen met succes gebruikt om BrdU mtDNA label. De BrdU etikettering techniek is vergelijkbaar met die gebruikt voor Edu, maar heeft een aantal belangrijke verschillen (figuur 5). Na de permeabilisatie stap hierboven genoemde (3.1 tot 3,2), is de BrdU epitoop hersteld met een denaturatiestap (2 N HCl gedurende 30 minuten bij 37 ° C gevolgd door drie wasbeurten in 1X PBS). De BrdU wordt dan gelabeld met een primair antilichaam tegen BrdU (Vector Laboratories verdund 1:50 in 1% oplossing van het blokkeren van de TSA kit en &#39;s nachts geïncubeerd bij 4 ° C). Een secundaire antilichaam stap is nodig om de BrdU signaal (geit anti-muis IgG geconjugeerd aan HRP van de TSA kits # 2 en # 5, verdund 1:100 in 1% blockingbuffer en geïncubeerd gedurende 45 min bij kamertemperatuur) te versterken voorafgaand aan de de TSA stappen (+4,3 tot 4,5 boven). Met twee thymidine-analogen, Edu en BrdU, een label mtDNA is voordelig voor het uitvoeren van dubbele label experimenten waarbij mtDNA sequentieel kan worden geëtiketteerd pulse-labeling paradigma 11. Ons laboratorium is met behulp van de EDU en BrdU de etikettering van mtDNA om de regeling van mitochondriale biogenese in de context van diabetische neuropathie, een veel voorkomende complicatie van diabetes te onderzoeken. We hebben met succes gebruikt de signaalversterking om veranderingen in mtDNA biogenese in individuele neuronen 11-12 te meten. Deze techniek zal nuttig zijn in andere experimenten ontworpen om de mechanismen van mtDNA replicatie en omzet of voor het identificeren van geneesmiddelen die mtDNA synthese remmen te verkennen. Daarnaast kunnen de basisprincipes van het versterken van Edu en BrdU signalen worden toegepast op andere studies die maatregel DNA-replicatie of reparatie.

<table><tbody><tr><td>Dekglasjes 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>BioAssay-schaal 245 mm x 245 mm</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399</td><td></td></tr><tr><td>Overbrengpipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide, 30% in water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2633</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10214</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #12, met HRP&amp;#8212;geit anti-konijn IgG en Alexa Fluor 488 tyramide</td><td>Invitrogen</td><td>T20922</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #15, met HRP&amp;#8211;geit anti-konijn IgG en Alexa Fluor 594 tyramide</td><td>Invitrogen</td><td>T20925</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade-reagens met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaal konijn Neurofilament-antilichaam</td><td>Chemicon International</td><td>AB1981</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-BrdU-antilichaam</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-B209</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #2, met HRP&amp;#8212;geit anti-muis IgG en Alexa Fluor 488 tyramide</td><td>Invitrogen</td><td>T20912</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit #5, met HRP&amp;#8212;geit anti-muis IgG en Alexa Fluor 594 tyramide</td><td>Invitrogen</td><td>T20915</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van mitochondriaal dna-replicatie in afzonderlijke cellen door edu signaalversterking

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondriën zijn de belangrijkste regulatoren van de cellulaire energie en mitochondriale biogenese is een essentieel onderdeel van de regulering van mitochondria aantallen in gezonde cellen 1-3. Een benadering voor de bewaking mitochondriale biogenese is het meten van de snelheid van mitochondriaal DNA (mtDNA) replicatie 4. We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in afzonderlijke cellen het etiket om te mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de inbouw van 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) 5-7 met een tyramide signaalversterking (TSA) 8 protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen. EDU is superieur aan andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), omdat de eerste klik reactie op het label Edu 5-7 niet vereist dat de harde zuur behandelingen of enzym verteert die nodig zijn voor het blootstellen van de BrdU epitoop . De mildere etikettering van Edu maakt directe vergelijking van de oprichting met andere cellulaire markers 9-10. De mogelijkheid om te visualiseren en te kwantificeren mtDNA biogenese biedt een essentieel instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die gebruikt worden om mitochondriale biogenese reguleren en zou inzicht geven in de pathogenese geassocieerd met drugs toxiciteit, veroudering, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Onze techniek is van toepassing op sensorische neuronen en andere celtypen. Het gebruik van deze techniek om mtDNA biogenese maatregel belangrijke implicaties in het bevorderen van het begrip van zowel de normale cellulaire fysiologie evenals bijzondere waardevermindering ziekte staten.

We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mitochondriaal DNA (mtDNA) label in individuele cellen om mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de integratie van onderwijs, samen met een tyramide signaalversterking (TSA) protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen.

Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking

Mitochondriën zijn belangrijke regulatoren van de cellulaire energie en mitochondriële biogenese is een essentieel onderdeel van de regulering van het aantal mitochondriën in gezonde ...

Het algemene doel van deze procedure is het labelen en visualiseren van M-T-D-N-A-replicatie in gekweekte neuronen. Dit wordt bereikt door de neuronen eerst gedurende twee tot 24 uur te incuberen met het thymidine-analogon EDU. De tweede stap van de procedure is het labelen van de EDU, die een alkyn bevat, met het fluorescente Oregon Green 488-azide via een kopergekatalyseerde covalente reactie.De laatste stap van de procedure is het versterken van het organengroene signaal met een aramide-signaalversterkingsstap om het EDU te visualiseren dat is ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd MT-DNA. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die MT-DNA-replicatie in specifieke subcellulaire compartimenten van neuronen aantonen door de combinatie van click-EDU-chemie en daaropvolgende tear-mind-signaalversterking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals BRDU-labeling is dat EDU-labeling eenvoudiger en milder is, wat aanvullende immunofluorescente kleuring van neuronale markers mogelijk maakt.Deze methode kan cruciale vragen beantwoorden over de regulatie van het aantal mitochondriën, zoals de manier waarop neuronen voldoen aan veranderende energievraag in hun subcellulaire compartimenten, waaronder cellichamen, axonen, dendrieten en synaptische terminals. Zo kan deze methode inzicht bieden in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van verschillende mitochondriële neurologische aandoeningen, waaronder neuropathie en neurodegeneratie. Belangrijk is dat de methode ook kan worden toegepast op andere systemen waarbij veranderingen in het aantal kopieën van mitochondriaal DNA waarschijnlijk de pathogenese van de ziekte toeliggend zijn, waaronder geneesmiddeltoxiciteit, kanker en veroudering.Deze video demonstreert hoe men pas gesynthetiseerd mitochondriaal DNA, afgekort M-T-D-N-A, kan labelen in neuronen van het dorsale wortelganglion die zijn gekweekt op steriele glazen dekglasjes van 12 millimeter. Verdun in een kweekplaat met 24 putjes de 10 millimolaire stock van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, afgekort EDU, uit de Click-iT EDU Microplate assay kit in een verhouding van 1:100 in kweekmedium om een 10X EDU-stock te verkrijgen. De 10X EDU-stock wordt vervolgens direct aan het medium in elke putje toegevoegd. Incubeer de behandelde neuronen gedurende 2 tot 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 in een zuurkast.Fixeer de neuronen in 2% Paraformaldehyde gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Was tweemaal in 1x PBS gedurende twee tot vijf minuten per wasbeurt. De gefixeerde neuronen kunnen worden bewaard in verse 1x PBS bij vier graden Celsius voor maximaal één maand.Bereid een vochtkamer voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Gebruik een pincet met fijne punten om 28 gefixeerde dekglasjes, inclusief positieve en negatieve EDU-controles, over te brengen naar vellen hydrofoob paraform M in de vochtkamer. Breng 200 tot 300 µL 1X PBS opnieuw aan om het oppervlak van elk dekglasje te bedekken.Bereid de click-it assaykit voor zoals beschreven in de tekst en de instructies van de fabrikant om mitochondriaal DNA te labelen. Voeg 75 tot 80 µL van een permeabilisatieloplossing met 0,1% Triton X in 1x PBS toe aan elk dekglas en incubeer dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een bulb-transferpipet met een 200 µL tip aan het uiteinde om de vloeistof voorzichtig te verwijderen zonder cellen te verliezen.Gebruik een bulbpipet om het dekglas voorzichtig te vullen. Spoel met 200 tot 300 µL 1x PBS om de vorige oplossing grondig uit te wassen. Was elk dekglas twee keer.Pipetteer 75 tot 80 µL verse 1% waterstofperoxide in 1X PBS op elk dekglas. Incubeer afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Spoel twee keer met 1X PBS zoals voorheen en bereid vers de click-reactiecocktail voor zoals beschreven in de begeleidende tekst.Pipette de vloeistof op en neer om te mengen. Vortex niet. Postfixeer de neuronen met 75 tot 80 µL click-at-EDU fixatief per dekglas en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun tijdens de postfix-incubatie de reactiecocktail met een gelijk volume click-at-EDU fixatief.Voeg het reactiemengsel toe aan elk dekglasdeksel om bescherming tegen licht te bieden en laat dit 25 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het reactiemengsel en was tweemaal met verdunde 1x blokkeringsbuffer onder een epifluorescentiemicroscoop. Controleer op Orgon Green-kleuring in de kernen wanneer de EdU-kleuring is voltooid.Begin de termite signal amplification (TSA) door 1% TSA-blokkeeroplossing aan elk dekglas toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Centrifugeer de voorraad anti-green horse radish peroxidase-geconjugeerde antilichamen kortstondig. Bereid de TSA twee tot 24 uur vooraf voor; verdun het primaire antilichaam 1:300 in TSA-blokkeeroplossing en meng door te keren of te pipetteren, maar vortexeer niet. Voeg 75 µL toe aan elk dekglas en incubeer overnight bij 4 °C.Spoel de volgende dag drie keer met 1x PBS bij kamertemperatuur. Incubeer de dekglasjes in de laatste wasstap nog eens 30 tot 60 minuten om ervoor te zorgen dat ongebonden primaire antilichamen zijn verwijderd. Bereid de IDE-reactie direct voor gebruik voor volgens het tekstgedeelte van dit protocol.Incubeer de dekglasjes met de IDE-reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer met XPBS, waarbij de laatste wasstap 30 tot 60 minuten duurt, zoals voorheen onder de microscoop. Controleer op MT-DNA-labeling en monteer succesvol gekleurde neuronen op glazen objectglazen met een ANTIFA-montagemedium dat DPI bevat; hier worden representatieve differential interference contrast-beelden getoond van embryonale en volwassen neuronen uit het dorsaal wortelganglion die gewoonlijk voor analyse worden gebruikt.Deze schematische diagrammen representeren de procedure voor het labelen van EDU in MTD NA met een groen fluorescent signaal. Mitotisch actieve F 11 neuroblastoomcellen dienen als positieve controle en illustreren het labelingspatroon van EDU dat is ingebouwd in nucleair en mitochondriaal DNA in deze representatieve fluorescentiebeelden over een bright field-opname. De groene punctate signalen tonen het versterkte EDU-signaal dat is ingebouwd in nieuw gesynthetiseerde M-D-D-N-A van zowel embryonale als volwassen neuronen van het dorsale wortelganglion.De EDU-labelingsprocedure maakt een daaropvolgende immunofluorescente kleuring van neuronale markers, zoals neurofilament in het rood, mogelijk. Deze schema's representeren de procedure voor het labelen van EDU en MTD NA met een rood fluorescent signaal. Mitotisch actieve F 11 neuroblastoomcellen dienen als positieve controle en illustreren het labelingspatroon van EDU dat is ingebouwd in het nucleaire en mitochondriale DNA.Dit schema stelt de procedure voor het labelen van BRDU in nieuw gesynthetiseerd M-T-D-N-A met een groen of rood fluorescent signaal voor. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om controles uit te voeren met mitotisch actieve cellen om de succesvolle EDU-labeling en celkernen te controleren voordat men overgaat tot de amplificatiestappen om de MT DNA-labeling volgens deze procedure te visualiseren. Andere methoden, zoals standaard immunofluorescentie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de synthese van mitochondriaal DNA wordt gereguleerd in specifieke subpopulaties van neuronen of neuronale compartimenten. Door de ontwikkeling van deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurobiologie om de regulatie van het aantal mitochondriën te onderzoeken in cultuurmodellen van zowel normale fysiologie als cultuurmodellen die ziektebeelden simuleren.Neurologische toestanden.

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

DT40, een model gewerveld genetisch systeem, biedt een krachtig hulpmiddel om eiwit functie te analyseren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode die kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase in DT40-cellen op de single molecule-niveau mogelijk maakt.

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Mitochondriale fusie werd gemeten door het bijhouden van de gelijkschakeling van de photoconverted matrix-gerichte GFP over het mitochondriale netwerk in de tijd. Tot dusver kon slechts een cel worden onderworpen aan een uur lang kinetische analyse tegelijk. Wij presenteren een methode die meet gelijktijdig meerdere cellen, waardoor versnelling van het proces van gegevensverzameling.

Een snellere, met hoge resolutie, MTPA-GFP-gebaseerde Mitochondriale Fusion Assay verwerven Kinetische gegevens van meerdere cellen parallel geschakeld Met behulp van confocale microscopie

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

Dit artikel beschrijft het gebruik van confocale microscopie en ImageJ om de dynamiek van mitochondriale splijting/fusie te beoordelen via Dendra2 fotoschakelende fluorescentie.

Beoordeling van mitochondriale splijting/fusiedynamiek in proximale tubulaire cellen van de nier

Leer een nieuwe techniek om mtDNA-replicatie in neuronen te visualiseren met EdU-incorporatie en tyramide signaalversterking. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale biogenese en neurologische ziekten.

Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking

Meer video's verkennen