Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking
15 november 2010
We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mitochondriaal DNA (mtDNA) label in individuele cellen om mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de integratie van onderwijs, samen met een tyramide signaalversterking (TSA) protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen.
Het algemene doel van deze procedure is om de M-T-D-N-A replicatie in gekweekte neuronen te labelen en visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst neuronen gedurende twee tot 24 uur te incuberen met het thymidine analoog EDU. De tweede stap van de procedure is om het EDU dat een alkin bevat, te labelen met de fluorescerende orgon groen 4 88 azide via een koper gekatalyseerde covalente reactie.
De laatste stap van de procedure is om het orgon groene signaal te versterken met een aramide signaal versterkingsstap om het EDU dat in nieuw gesynthetiseerd MT DNA is opgenomen, te visualiseren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die MT DNA replicatie in specifieke subcellulaire compartimenten van neuronen laten zien door de combinatie van clicka EDU chemie en daaropvolgende tear mind signaal versterking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals BRDU labelen, is dat EDU labelen eenvoudiger en milder is, waardoor aanvullende immunofluorescente kleuring van neuronale markers mogelijk is.
Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over de regulatie van het aantal mitochondriën, zoals hoe neuronen voldoen aan veranderende energiebelastingen in hun subcellulaire compartimenten, inclusief cellichamen, axonen, dendrieten en synaptische terminal. Dus deze methode kan inzicht geven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van meerdere mitochondriale neurologische ziekten, inclusief neuropathie en neurodegeneratie. Maar belangrijker nog, het kan ook worden toegepast op andere systemen waar veranderingen in mitochondriaal DNA-kopie waarschijnlijk ten grondslag liggen aan de pathogenese van de ziektetoestand, inclusief drugstoxiciteit, kanker en veroudering.
Deze video zal demonstreren hoe nieuw gesynthetiseerd mitochondriaal DNA, afgekort M-T-D-N-A, wordt gelabeld in dorsale wortel ganglion neuronen die zijn gekweekt op steriele 12 millimeter glazen deksels. In een 24 wel culture plate verdun de 10 millimolar stock van vijf ethanol twee doxy uridine, afgekort EDU van de Clicka EDO Microplate assay kit een op honderd in kweekmedium voor een 10 XEDU stock. De 10 XEDU stock wordt vervolgens direct toegevoegd aan het medium in elke put. De behandelde neuronen worden gedurende twee tot 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een afzuigingskast geïncubeerd.
Fixeer de neuronen in 2% Paraform aldehyde gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Was twee keer in één XPBS gedurende twee tot vijf minuten per wasbeurt. De gefixeerde neuronen kunnen worden bewaard in vers één XPBS bij vier graden Celsius gedurende maximaal een maand.
Bereid een vochtige kamer voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Gebruik fijne pincetten om 28 gefixeerde deksels, inclusief positieve en negatieve EDU controles, over te brengen naar vellen hydrofobe paraform M binnen de vochtige kamer. Breng 200 tot 300 microliters van één XPBS aan om het oppervlak van elke deksel te bedekken.
Bereid de click it assay kit voor zoals beschreven in de tekst en de instructies van de fabrikant om mitochondriaal DNA te labelen bij 75 tot 80 microliters van een permeabele oplossing bevattende 0,1% tritton X in één XPBS voor elk deksel, bedek en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gebruik een bulb transferpipet met een 200 microliter tip aan het uiteinde. Om het vocht zachtjes te verwijderen zonder cellen te verliezen.
Gebruik een bulb pipet om het deksel voorzichtig te overspoelen met 200 tot 300 microliters van één XPBS om de vorige oplossing grondig te wassen. Was elk deksel twee keer.
Pipet 75 tot 80 microliters van verse 1% waterstofperoxide in één XPBS op elk deksel. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om endogene peroxidase activiteit te dempen. Spoel twee keer met één XPBS zoals eerder. Bereid vers de click at reactiecocktail voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst.
Pipet op en neer om te mengen. Niet vortexen. Postfixeer de neuronen met 75 tot 80 microliters van click at EDU fixatief per deksel. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Tijdens de postfix incubatie, verdun de reactiecocktail met een gelijk volume van clicka EDU fixatief.
Voeg de reactiecocktail toe aan elk deksel om het te beschermen tegen licht en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. Verwijder voorzichtig de reactiecocktail en was twee keer met verdunde één x blokkeringsbuffer onder een epifluorescente microscoop. Controleer op orgon groene kleuring in kernen wanneer de EDU kleuring voltooid is.
Begin de termite signaal versterking of TSA, voeg 1% TSA blok oplossing toe aan elk deksel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Draai kort de antione groene paardenradijs peroxidase geconjugeerde antilichaam stock, bereid twee tot 24 uur van tevoren voor TSA, verdun het primaire antilichaam een op driehonderd in TSA blokkeringsoplossing en draai of pipet om te mengen. Voeg 75 microliters toe aan elk deksel, bedek en incubeer bij vier graden Celsius gedurende de nacht.
De volgende dag, spoel drie keer met één XPBS bij kamertemperatuur. Incubeer de deksels in de laatste was gedurende nog eens 30 tot 60 minuten om ervoor te zorgen dat ongebonden primair antilichaam wordt verwijderd. Bereid de IDE reactie onmiddellijk voor gebruik volgens het tekstdeel van dit protocol.
Incubeer de deksels met de IDE reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer met één XPBS en incubeer gedurende 30 tot 60 minuten in de laatste was, zoals eerder onder de microscoop. Controleer op MT DNA labelen en monteer succesvol gekleurde neuronen op glazen platen met een ANTIFA montagemedium dat DPI bevat. Hier worden representatieve differentieel interferentiecontrastbeelden van embryonale en volwassen dorsale wortel ganglion neuronen getoond die typisch worden gebruikt voor analyse.
Deze schematische diagrammen vertegenwoordigen de procedure voor het labelen van EDU in MTD NA met een
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe techniek voor het labelen van nieuw gesynthetiseerd mitochondriaal DNA (mtDNA) in gekweekte neuronen, waardoor de visualisatie van mtDNA-replicatie mogelijk wordt. De methode combineert EdU-incorporatie met tyramide-signaalversterking om inzichten te geven in mtDNA-biogenese binnen subcellulaire compartimenten van neuronen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Moleculairbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Mitochondriaal DNA (mtDNA) speelt een cruciale rol in het cellulaire energiemetabolisme.
- Het begrijpen van mtDNA-replicatie is essentieel voor het bestuderen van neuronale functie en gezondheid.
- Bestaande labelmethoden, zoals BRDU, hebben beperkingen die deze nieuwe techniek aanpakt.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende aandoeningen gerelateerd aan mitochondriale disfunctie.
Doel van het onderzoek
- Om een gevoelige techniek te ontwikkelen voor het visualiseren van mtDNA-replicatie in neuronen.
- Om de regulatie van mitochondriaal aantal in reactie op energiebehoeften te onderzoeken.
- Om inzichten te geven in de pathogenese van mitochondriale neurologische ziekten.
Gebruikte methoden
- Neuronen worden gedurende 2 tot 24 uur geïncubeerd met EdU.
- EdU wordt gelabeld met een fluorescerende azide via een koper-gekatalyseerde reactie.
- Tyramide-signaalversterking wordt gebruikt om het fluorescerende signaal te versterken.
- Immunoflurescente kleuring wordt uitgevoerd om neuronale markers te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek labelt met succes mtDNA in specifieke neuronale compartimenten.
- Resultaten tonen het vermogen aan om mtDNA-replicatiedynamiek te visualiseren.
- Het maakt aanvullende immunofluorescente kleuring van neuronale markers mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van mitochondriaal gedrag onder verschillende energiebelastingen.
Conclusies
- Deze methode biedt een toegankelijker benadering voor het bestuderen van mtDNA-replicatie.
- Het heeft potentiële toepassingen in het begrijpen van verschillende neurologische ziekten.
- De techniek kan worden aangepast voor onderzoek naar andere ziektetoestanden gerelateerd aan mitochondriale disfunctie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This technique enables sensitive visualization of mitochondrial DNA replication in individual cells, providing a quantitative readout for mitochondrial biogenesis. It supports target validation in neurodegenerative and metabolic disease models by linking mtDNA dynamics to cellular energy demands. The method enhances predictive confidence in preclinical screening by allowing direct comparison with neuronal markers and subcellular localization studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to mitochondrial biogenesis regulation.
- Operational Value: Provides a milder labeling approach compatible with multiplex immunostaining for pathway analysis.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating mtDNA synthesis with neuronal activity and energy load.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable, punctate fluorescent signals suitable for high-content imaging platforms.
- Reproducibility: Tyramide signal amplification ensures consistent signal detection across experimental replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and automated microscopy workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to models of neuropathy, neurodegeneration, drug toxicity, cancer, and aging where mtDNA copy number alterations are pathogenic.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical validation of mitochondrial-targeted interventions.
- Risk Mitigation: Enables early de-risking of compounds affecting mitochondrial function by monitoring on-target biogenesis effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly for mitochondrial modulators. It supports hit validation by confirming on-target engagement via mtDNA synthesis in relevant subcellular compartments. The quantitative output aids in prioritizing compounds with favorable mitochondrial safety profiles.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about mitochondrial regulation in response to metabolic stress or neuronal activation.
- Screening: Delivers standardized, amplified fluorescence readouts enabling compound-induced changes in mtDNA replication to be scored.
- Analytics: Provides spatial and intensity data that support comparative analysis across treatment conditions and time points.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant mitochondrial dysfunction observed in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mitochondrial liability across diverse therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target engagement by visualizing direct consequences of pathway modulation on mtDNA synthesis.
- Operational Value: Eliminates harsh denaturation steps required for BrdU, preserving antigenicity for concurrent neuronal marker staining.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing false positives in mitochondrial safety assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted resource allocation toward compounds with validated mitochondrial mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in click chemistry, fluorescence microscopy, and neuronal culture techniques.
- Depends on access to EdU, fluorescent azides, hydrogen peroxide, and tyramide signal amplification reagents.
- Necessitates standardized fixation and permeabilization protocols to ensure consistent EdU accessibility.
- Must account for variable incubation times (2–24 hours) depending on cell type and replication rate.
- Limited to detecting nascent mtDNA synthesis; does not report on total mtDNA copy number or degradation rates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:58
Introduction
1:56
Preparation of Neurons
3:38
Click-iT 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) Labeling
5:31
Tyramide Signal Amplification (TSA) of EdU Signal
7:09
Visualization of Mitochondrial DNA Replication as a Marker for Mitochondiral Biogenesis
8:37
Conclusion
