Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-replicatie op het niveau van een enkel molecuul te visualiseren. Begin met het inbouwen van gehalogeneerde nucleotide-analogen in nieuw gesynthetiseerd DNA. Breng bij levende cellen de cellen met gelabeld DNA op een microscoop aan.

Smeer vervolgens de cellen uit en rek het DNA uit op het microscoopglaasje. De daaropvolgende immunokleuring van DNA-vezels en de analyse van de fluorescentiemicroscopiebeelden kunnen inzicht geven in de globale dynamiek van de replicatievorken, waardoor kwantitatieve analyse mogelijk is van parameters die het algehele replicatieprogramma beïnvloeden. In de afgelopen jaren zijn verschillende versies van de DNA-vezelfluorotechnieken ontwikkeld om de beweging van individuele replicatievorken in levende cellen te visualiseren.

Dit in vivo experiment in DT 40-cellen dat u nu gaat zien, kan binnen één dag worden voltooid en vereist enkel algemene laboratoriumapparatuur en een fluorescentiemicroscoop. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Rebecca Schwab, een postdoc in mijn laboratorium. Om DT 40-cellen in vivo te labelen, begint u met een exponentieel groeiende cultuur. Voeg IDU-label toe tot een eindconcentratie van 25 micromolar en meng de celsuspensie.

Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 38 °C en 5% CO₂. Voeg vervolgens het CLDU-label toe tot een uiteindelijke concentratie van 250 µM. Meng en incubeer de celsuspensie.

Was nu de DT 40-cellen met ijskoude PBS. Resuspendeer de celpellets in koude PBS en bewaar de gelabelde cellen op ijs. Breng twee microliters van de celsuspensie aan op één uiteinde van het glazen objectglas en laat dit aan de lucht drogen totdat het volume van de druppel sterk is verminderd, maar nog niet volledig droog is.

Voeg nu zeven µL fiber lysis solution toe aan de celсусpensie en meng de oplossingen voorzichtig door te roeren met een pipetpunt; laat dit twee minuten incuberen. Kantel vervolgens de objectglazen tot 15 graden zodat de vezels zich over het glas kunnen verspreiden. Zodra de vezeloplossing de onderkant van het objectglas heeft bereikt, wordt dit horizontaal geplaatst om aan de lucht te drogen.

Op dit moment moet er een dunne ondoorzichtige lijn langs het preparaat zichtbaar zijn. Markeer het begin van de uitgerekte vezels met een potlood. Dompel de preparaten vervolgens gedurende 10 minuten onder in een mengsel van methanol en azijnzuur in een verhouding van drie op één.

Was de objectglazen in gedestilleerd water en dompel ze vervolgens 80 minuten onder in 2,5 molair zoutzuur. Was de objectglazen drie keer gedurende vijf minuten in PBS en dep ze droog. Neem overtollig PBS op met een papieren handdoek.

Plaats de objectglaasjes vervolgens horizontaal. Pipetteer nu 5% BSA in PBS op elk objectglas, plaats een dekglas en laat dit 20 minuten incuberen. Schuif het dekglas voorzichtig over het objectglas.

Verwijder het overtollige BSA met een papieren handdoek. Pipetteer vervolgens 50 µL van de anti-BRDU primaire antilichaamoplossing op elke objectglas.

Dek een preparaat af met een dekglas en incubeer dit gedurende twee uur in een bevochtigde kamer. Was de objectglazen na het verwijderen van de dekglazen drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Breng 50 µL van de secundaire antilichaamoplossing aan, plaats de dekglazen en bescherm de objectglazen tegen licht.

Incubeer vervolgens gedurende één uur. Verwijder de dekglasjes en was de coupes drie keer in PBS gedurende vijf minuten. Voeg tot slot een druppel vector shield monteermedium toe aan elke coupe.

Druk voorzichtig op een dekglas en verwijder het overtollige vloeistof eromheen. Seal de dekglazen met een papieren handdoek en transparante nagellak en laat ze aan de lucht drogen. Bewaar de objectglazen bij min 20 °C.

Plaats een druppel immersie-olie op een objectglas vlakbij het potloodstreepje en begin met het lokaliseren van de vezels. Beweeg weg van de hoofdbundel om gebieden te vinden waar de vezels duidelijk van elkaar gescheiden zijn. Selecteer in een typisch experiment afbeeldingen met slechts één kleurkanaal om bias te voorkomen.

Maak vervolgens ongeveer 10 foto's van elk monster. Verplaats de slide om verschillende foto's te maken, aangezien één gebied op een slide mogelijk geen representatieve vezellengtes of replicatiestructuren biedt. Importeer de foto's in een programma voor beeldanalyse.

Meet de lengten van de 100 vezelbundels of tel 150 tot 200 verschillende replicatiestructuren. De dubbele labelingsmethode voor vezels maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen verschillende replicatiestructuren. Pas gerepliceerd DNA kan worden gevisualiseerd als lijnen van met antilichamen gelabelde nucleotidenanalogen.

Hier wordt een voortdurend verlengende replicatievork weergegeven als aangrenzende rode en groene signalen. Nieuwe initiatiegebeurtenissen kunnen worden onderverdeeld in oorsprongen die zijn geactiveerd terwijl de cellen werden geïncubeerd met het eerste label en oorsprongen die activeerden tijdens de incubatie met het tweede label. De eerste categorie bestaat uit naburige groene, rood-groene signalen en de laatste uitsluitend uit een groene lijn.

Termineringsgebeurtenissen manifesteren zich als aangrenzende rode en groene kleuren. Rode signalen zijn verspreid aanwezig. De oorsprongen bestaan uit opeenvolgende oorsprongen en termineringssignalen.

Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen gestopte of ingestorte replicatievorken worden gedefinieerd als een uitsluitend rood signaal of als een rode lijn gevolgd door een kort groen traject. In dit experiment hebben de wildtype DT 40-cellen een gemiddelde vorksnelheid van 0,4 microns per minuut. Met 63% lopende vorken, 10% origins, 16% gestopte vorken, 8% terminaties en 3% verspreide vezels.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het visualiseren en analyseren van de dynamiek van replicatievorken in DT 40-cellen. Dit biedt u een essentieel instrument voor het onderzoeken van defecten in de DNA-replicatie.