Name: Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer DNA-replicatie visualiseren op enkelmoleculair niveau in DT40-cellen met behulp van DNA-vezeltechniek. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van replicatievorkdynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. T. Helleday en dr. E. Petermann voor hulp met de vezel techniek, alsmede de leden van het lab voor nuttige discussie. WN wordt ondersteund door een Senior International Research Fellowship van de Association for Cancer Research International en door de Poolse staat Comite voor Wetenschappelijk Onderzoek-subsidie ​​(N301 165935).

De hier beschreven methode werd gebruikt in de volgende publicatie: Schwab et al., EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 celcultuur Materialen: Foetale bovine serum (FBS), kip serum, penicilline / streptomycine, 2-mercaptoethanol, RPMI <ol><li> Bereid celkweekmedium: voeg 7% FBS, 3% kip serum, 1x penicilline / streptomycine en 10 uM 2-mercapto-ethanol aan RPMI medium. </li><li> DT40-cellen worden gekweekt in steriele celkweek kolven bij 38 ° C en 5% CO 2 in een bevochtigde incubator. Cellen splitsen elke dag een dichtheid van 5 x 10 5 cellen / ml 6. </li></ol> 2. In vivo labeling Materialen: Idu, CldU <ol><li> Bereid voorraad oplossingen van nucleotide-analogen: los IDU tot 5 mm en CldU tot 2,5 mM in medium. Warmte beide oplossingen kort tot 60 ° C en vortex tot de nucleotide analoogUES volledig is opgelost. </li><li> Voeg IDU tot een uiteindelijke concentratie van 25 uM tot exponentieel groeiende DT40-cellen en meng de celsuspensie. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 38 ° C en 5% CO 2. </li><li> Na incubatie met het eerste label, voeg CldU tot een uiteindelijke concentratie van 250 uM en behandelen cellen zoals beschreven in de vorige stap. </li><li> Was de cellen met ijskoude PBS en resuspendeer ze bij een concentratie van 7,5 x 10 5 cellen / ml in koude PBS. Houd de gelabelde cellen op ijs. </li></ol> De beschreven etikettering procedure is slechts een suggestie en kan worden aangepast om specifieke vragen te beantwoorden. Raadpleeg de discussie sectie voor meer informatie over de experimentele design. 3. Cellysis en DNA verspreiden Materiaal: Glas dia's, fiber lysis oplossing <ol><li> Bereid de vezel lysis oplossing: 50 mM EDTA en 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li spot pi van de celsuspensie aan het ene uiteinde glazen dia. lucht drogen voor minuten of tot volume daling is sterk verminderd maar niet droog.><li> Pipet 7 ul lysis-oplossing op de top van de celsuspensie en voorzichtig roeren met de pipet tip om de oplossingen te mengen. Incubeer gedurende 2 minuten voor cellysis om door te gaan. </li><li> Kantelen dia's tot 15 °, zodat de vezels te verspreiden langs de dia. </li><li> Nadat de vezel oplossing heeft bereikt de onderkant van de schuif, horizontaal plaats het aan de lucht drogen. Na het drogen, moet een dunne, ondoorzichtige lijn zichtbaar langs de dia. Op dit punt, moet het begin van het gestrekte vezels worden gemarkeerd met een potlood als na het kleuren van de lijn niet zichtbaar meer. Dit teken zal later helpen om de vezels onder de microscoop te vinden. </li></ol> 4. Immunofluorescentiekleuring Materialen: Methanol, azijnzuur, HCl, 5% BSA in PBS, vlekken pot, anti-BrdU (muis) antilichaam,anti-BrdU (rat) antilichaam, schapen anti-muis Cy3 antilichaam, geit anti-rat Alexa Fluor 488 antilichaam, Vectashield montage medium, dekglaasjes, nagellak <ol><li> Dompel dia's in methanol / azijnzuur (3:1) in een kleuring pot en incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Was dia's in gedestilleerd H 2 O, vervolgens onder te dompelen in 2,5 M HCl gedurende 80 minuten. </li><li> Was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder dia's uit de kleuring pot en het verzamelen van overtollige PBS met een papieren handdoek. Horizontaal plaatsen van de dia's en pipet 5% BSA op de top van elke dia. Voorzichtig Bedek de dia's met een dekglaasje aan de BSA gelijkmatig verdeeld over de glijbaan en gedurende 20 minuten incuberen. </li><li> Verdun de primaire antilichamen in 5% BSA bij de volgende concentraties: 01:25 anti-BrdU (muis) en 1:400 anti-BrdU (rat). </li><li> Beweeg het dekglaasje naar beneden het glaasje om het te verwijderen. Oefen geen druk als het dekglas kleeft aan de dia. De dia kan worden gehydrateerd in PBS tot het dekglaasje wordt los eend kan worden verwijderd met gemak. Vangt overtollige BSA met een papieren handdoek en horizontaal plaatsen van de dia's. Pipetteer 50 ul van de primaire antilichaam oplossing op elke dia. Bedek opnieuw met een dekglaasje aan het antilichaam oplossing gelijkmatig verdeeld over de glijbaan en in een vochtige kamer voor 2 uur incuberen. </li><li> Na het verwijderen van de dekglaasjes, was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten </li><li> Verdun de secundaire antilichamen in 5% BSA bij de volgende concentraties: 1:500 schaap anti-muis Cy3 en 1:400 geit anti-rat Alexa Fluor 488. </li><li> Van toepassing zijn 50 ui van het secundaire antilichaam oplossing als beschreven voor de primaire antilichamen. Bescherm de dia's van licht en incubeer gedurende 1 uur. </li><li> Na het verwijderen van de dekglaasjes, was de dia's drie keer in PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg een druppel Vectashield montage medium op elke dia en breng een dekglaasje aan. Druk de dekglaasjes en verwijder overtollig vocht omheen met een papieren handdoek. Seal coverslips met transparante nagel polish en laat ze drogen. Bewaar de dia's bij -20 ° C. </li></ol> 5. Beeldacquisitie Materialen: fluorescentie microscoop, camera Plaats een druppel immersie olie op een dia de buurt van het potlood merk en start het lokaliseren van de vezels. Meestal is er een van de belangrijkste vezel bundel, maar deze vezels zijn te verward en kan later niet worden geanalyseerd. Ga uit de buurt van de belangrijkste bundel naar gebieden waar vezels duidelijk gescheiden zijn van elkaar (fig. 2) te vinden. Wij zouden u foto's alleen met behulp van een kleurkanaal om vertekening te voorkomen. Dan zouden we ongeveer 10 foto's van elk tijdstip, concentratie of cellijn. Echter, het aantal foto's hangt af van hoeveel vezels kunnen worden geteld op elke foto. Bewegen langs de glijbaan naar de verschillende foto's te maken, als een deel van een dia kan geen representatief vezels lengtes of replicatie structuren. 6. Data-analyse Materialen: Beeld analyse programma, bijvoorbeeld ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Foto's importeren in een beeld analyse programma. Meet de lengte van de vezel traktaten en / of tellen de verschillende replicatie-structuren (afb. 3). Tellen alleen vezels die duidelijk zichtbaar zijn en die niet uitstrekken over de rand van het beeld. We meten meestal de lengte van ongeveer 100 vezels en tel 150-200 replicatie structuren en we zouden herhalen individuele experimenten minstens drie keer. 7. Representatieve resultaten: Nieuw DNA gerepliceerd kan worden gevisualiseerd als lijnen van antilichaam-gelabeld nucleotide analogen. In onze experimenten een voortdurende vork wordt voorgesteld als aangrenzende rode en groene signalen (afb. 3). De dubbele etikettering-protocol maakt het ook mogelijk ons ​​te definiëren vier grote klassen van replicatie structuren: 1) nieuwe initiatie evenementen kunnen worden divid ed in de oorsprong die zijn afgevuurd, terwijl de cellen werden geïncubeerd met het eerste etiket en de oorsprong die zijn afgevuurd tijdens de incubatie met het tweede label. De voormalige bestaan ​​uit aangrenzende groen-rood-groen-signalen en de laatste van een groene lijn alleen. 2) de beëindiging gebeurtenissen zich manifesteren als aangrenzende rood-groen-rood signalen. 3) afgewisseld oorsprong zijn plaatsen in het genoom met dicht op elkaar staande oorsprong. Dergelijke sites bestaan ​​uit opeenvolgende oorsprong en beëindiging signalen. 4) Afhankelijk van de proefopzet, vastgelopen / ingestort vorken kan gedefinieerd als een rode signaal slechts 7 of een rode lijn, gevolgd door een korte groen-darmkanaal 8,9 te zijn. Met behulp van de voorwaarden hier beschreven, wild-type DT40 cellen hebben een gemiddelde snelheid vork van 0,4 micrometer / min. We kunnen ongeveer 63% te detecteren lopende vorken, 10% afkomst, 16% geblokkeerde vorken (rood alleen traktaten), 8% opzeggingen en 3% afgewisseld vezels. ure 1 "/&gt; . Figuur 1 (A) De linker kant van de cartoon toont de eerste stap van de DNA-etikettering procedure: het toevoegen van IDU exponentieel groeiende DT40 cellen leidt de nucleotide analoog gemakkelijk worden opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde toonaangevende en achterblijvende DNA-strengen. Dit kan worden gevisualiseerd door middel van een specifiek antilichaam, en wordt weergegeven als een rode lijn wanneer bekeken onder de microscoop. Vervolgens wordt dezelfde procedure herhaald met CldU zoals op de rechterkant van de figuur. Na incubatie met de tweede nucleotide analoog, zal een actieve vork zichtbaar als een aangrenzende rood-groen-darmkanaal. De gemiddelde vezellengte is evenredig met de incubatietijd van de nucleotide-analogen. (B) DNA van gelyseerde DT40-cellen wordt uitgerekt door de zwaartekracht op een objectglaasje en de ingebouwde nucleotide analogen worden gevisualiseerd door het gebruik van specifieke antilichamen en fluorescentie microscopie. igure 2 "/&gt; Figuur 2. Een vertegenwoordiger fluorescentie beeld toont vezels van wild-type DT40-cellen vervolgens gelabeld met IDG en CldU gedurende 20 minuten elk. De meeste van de vezels zijn goed van elkaar gescheiden en kunnen dus gemakkelijk worden geanalyseerd. De witte balk geeft 10 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> . Figuur 3 De dubbele-etikettering fiber techniek maakt het mogelijk een onderscheid te maken tussen de verschillende replicatie structuren; 1 - actief te repliceren vorken, 2 - nieuwe sites van de DNA-replicatie (het afvuren van nieuwe afkomst), 3 - vork opzeggingen (twee convergerende vorken), 4 - afgewisseld vezels (sites van dicht bij elkaar gelegen afkomst) en 5 - vastgelopen vorken (alleen rood signaal).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschrijven een methode die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve analyse van de parameters die DNA-synthese invloed tijdens de S-fase bij een enkel molecuul niveau. In de afgelopen tien jaar werden verschillende versies van de DNA-vezel fluorografie techniek ontwikkeld om de beweging van de individuele replicatie vorken in levende cellen te visualiseren. De kritische parameter in al deze technieken is de procedure die wordt gebruikt om de best mogelijke uitrekken van DNA te bereiken op een glazen ondergrond het verstrekken van goed gescheiden DNA vezels. Een cruciale stap om dit te bereiken is de incubatietijd van de celsuspensie op de microscoop glijbaan en lysis tijd. Deze parameters zijn afhankelijk van de temperatuur en de luchtstroom in een bepaald laboratorium en moet empirisch worden bepaald. Het praktische deel van een DNA-vezel experiment is meestal bereikt binnen een dag. Echter, de volgende foto acquisitie en analyse is meer tijdrovend en vereist oefening. De etikettering protocol kan worden adApted aan diverse wetenschappelijke problemen te beantwoorden: met behulp van een agent die met replicatie ingrijpt tijdens de tweede puls etikettering monitoren vork rek / stalling in reactie op replicatieve stress. In dit scenario, het eerste label hoeft niet te worden uitgewassen als tweede nucleotide wordt in overmaat toegevoegd. Als alternatief kunnen geneesmiddelen die de replicatie belemmeren worden gebruikt in combinatie of net na toevoeging van het eerste etiket. Dit vereist het eerste etiket en het geneesmiddel te worden verwijderd voordat de tweede nucleotide analoog wordt toegepast. Deze procedure maakt het mogelijk om vast te stellen het belang van verschillende factoren op de DNA-herstel replicatieve vork stabiliteit / herstel onder omstandigheden van replicatieve stress (dat wil zeggen vork stalling en / of collaps). Opmerkelijk, zou een meer gedetailleerde analyse van gegevens van de DNA-replicatie-programma worden uitgevoerd met het gebruik van een alternatieve benaderingen te combineren DNA kammen en de fluorescentie in situ hybridisatie. Dit is echter, is technisch meer uitdagende en vereist uitgavensieve apparatuur. De mogelijkheid om kwalitatief en kwantitatief te analyseren gegevens van DNA-replicatie biedt een essentieel instrument voor het onderzoeken van defecten in DNA-replicatie zelf als de paden die genomische instabiliteit in verband met replicatie vorken te onderdrukken. Ongetwijfeld zal deze test verder helpen om licht te werpen op de mechanismen van replicatie-gemedieerde DNA reparatie die het mogelijk maken normale cellen om te reageren op / om veranderingen in het milieu aan te passen en hoe kankercellen gebruik maken van deze mechanismen om de toxiciteit van geneesmiddelen gericht op replicatie vorken weerstaan.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Foetaal runderserum goud (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Kip serum </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-jood-2&#39;-deoxyuridine (IDU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-chloor-2&#39;-deoxy-uridine (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Objectglaasjes SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes No1 </td><td> Wetenschappelijk lab suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield afdekmedium </td><td> H-1000 Vector lab </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU antilichaam (muis) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU-antilichaam (rat) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> schaap anti-muis Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> geit anti-rat Alexa Fluor 488 antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van dna-replicatie in de gewervelde model systeem dt40 met behulp van de dna-fiber techniek

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Het onderhoud van de replicatie vork stabiliteit is van het grootste belang is voor delende cellen om de levensvatbaarheid te behouden en ziekte te voorkomen. De processen zorgen niet alleen voor gelovigen genoomduplicatie in het gezicht van de endogene en exogene DNA-schade, maar ook voorkomen dat genomische instabiliteit, een erkende oorzakelijke factor in de ontwikkeling van tumoren. We beschrijven hier een eenvoudige en kosteneffectieve fluorescentie microscopie gebaseerde methode om DNA-replicatie te visualiseren in het aviaire B-cellijn DT40. Deze cellijn is een krachtig hulpmiddel om de functies van eiwitten in vivo te onderzoeken door middel van omgekeerde genetica in gewervelde cellen 1. DNA fiber fluorografie in DT40 cellen ontbreekt een specifiek gen maakt het mogelijk om ophelderen van de functie van dit gen product in DNA replicatie en stabiliteit van het genoom. Traditionele methoden om de replicatie vork dynamiek te analyseren in vertebrate cellen vertrouwen op het meten van de totale percentage van DNA-synthese in een populatie van puls-gemerkte cellen. Dit is een kwantitatieve benadering en staat niet toe dat voor de kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese. In tegenstelling, kan de snelheid van het verkeer van actieve vorken direct worden gevolgd bij het ​​gebruik van de DNA-techniek vezel 2-4. In deze aanpak, is ontluikende DNA gelabeld in vivo door het opnemen van gehalogeneerde nucleotiden (afb. 1A). Vervolgens worden de individuele vezels uitgerekt op een microscoopglaasje, en het gelabelde DNA-replicatie traktaten zijn gekleurd met specifieke antilichamen en gevisualiseerd door fluorescentie microscopie (afb. 1B). Aanvang van de replicatie en vork gerichtheid wordt bepaald door de opeenvolgende gebruik van twee verschillende gewijzigd analogen. Bovendien is de dual-labelling aanpak maakt het mogelijk voor de kwantitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase, dat wil zeggen replicatie structuren zoals permanente en vastgelopen vorken, oorsprong van replicatie dichtheid en vork opzeggingen. Tot slot kan de experimentele procedure te volbrengened binnen een dag, en vereist alleen algemene laboratoriumbenodigdheden en een fluorescentie microscoop.

DT40, een model gewerveld genetisch systeem, biedt een krachtig hulpmiddel om eiwit functie te analyseren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode die kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase in DT40-cellen op de single molecule-niveau mogelijk maakt.

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Het behoud van de stabiliteit van de replicatievork is van het grootste belang voor delende cellen om de levensvatbaarheid te behouden en ziekten te voorkomen. De betrokken processen ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-replicatie op het niveau van een enkel molecuul te visualiseren. Begin met het inbouwen van gehalogeneerde nucleotide-analogen in nieuw gesynthetiseerd DNA. Breng bij levende cellen de cellen met gelabeld DNA op een microscoop aan.Smeer vervolgens de cellen uit en rek het DNA uit op het microscoopglaasje. De daaropvolgende immunokleuring van DNA-vezels en de analyse van de fluorescentiemicroscopiebeelden kunnen inzicht geven in de globale dynamiek van de replicatievorken, waardoor kwantitatieve analyse mogelijk is van parameters die het algehele replicatieprogramma beïnvloeden. In de afgelopen jaren zijn verschillende versies van de DNA-vezelfluorotechnieken ontwikkeld om de beweging van individuele replicatievorken in levende cellen te visualiseren.Dit in vivo experiment in DT 40-cellen dat u nu gaat zien, kan binnen één dag worden voltooid en vereist enkel algemene laboratoriumapparatuur en een fluorescentiemicroscoop. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Rebecca Schwab, een postdoc in mijn laboratorium. Om DT 40-cellen in vivo te labelen, begint u met een exponentieel groeiende cultuur. Voeg IDU-label toe tot een eindconcentratie van 25 micromolar en meng de celsuspensie.Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 38 °C en 5% CO₂. Voeg vervolgens het CLDU-label toe tot een uiteindelijke concentratie van 250 µM. Meng en incubeer de celsuspensie.Was nu de DT 40-cellen met ijskoude PBS. Resuspendeer de celpellets in koude PBS en bewaar de gelabelde cellen op ijs. Breng twee microliters van de celsuspensie aan op één uiteinde van het glazen objectglas en laat dit aan de lucht drogen totdat het volume van de druppel sterk is verminderd, maar nog niet volledig droog is.Voeg nu zeven µL fiber lysis solution toe aan de celсусpensie en meng de oplossingen voorzichtig door te roeren met een pipetpunt; laat dit twee minuten incuberen. Kantel vervolgens de objectglazen tot 15 graden zodat de vezels zich over het glas kunnen verspreiden. Zodra de vezeloplossing de onderkant van het objectglas heeft bereikt, wordt dit horizontaal geplaatst om aan de lucht te drogen.Op dit moment moet er een dunne ondoorzichtige lijn langs het preparaat zichtbaar zijn. Markeer het begin van de uitgerekte vezels met een potlood. Dompel de preparaten vervolgens gedurende 10 minuten onder in een mengsel van methanol en azijnzuur in een verhouding van drie op één.Was de objectglazen in gedestilleerd water en dompel ze vervolgens 80 minuten onder in 2,5 molair zoutzuur. Was de objectglazen drie keer gedurende vijf minuten in PBS en dep ze droog. Neem overtollig PBS op met een papieren handdoek.Plaats de objectglaasjes vervolgens horizontaal. Pipetteer nu 5% BSA in PBS op elk objectglas, plaats een dekglas en laat dit 20 minuten incuberen. Schuif het dekglas voorzichtig over het objectglas.Verwijder het overtollige BSA met een papieren handdoek. Pipetteer vervolgens 50 µL van de anti-BRDU primaire antilichaamoplossing op elke objectglas.Dek een preparaat af met een dekglas en incubeer dit gedurende twee uur in een bevochtigde kamer. Was de objectglazen na het verwijderen van de dekglazen drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Breng 50 µL van de secundaire antilichaamoplossing aan, plaats de dekglazen en bescherm de objectglazen tegen licht.Incubeer vervolgens gedurende één uur. Verwijder de dekglasjes en was de coupes drie keer in PBS gedurende vijf minuten. Voeg tot slot een druppel vector shield monteermedium toe aan elke coupe.Druk voorzichtig op een dekglas en verwijder het overtollige vloeistof eromheen. Seal de dekglazen met een papieren handdoek en transparante nagellak en laat ze aan de lucht drogen. Bewaar de objectglazen bij min 20 °C.Plaats een druppel immersie-olie op een objectglas vlakbij het potloodstreepje en begin met het lokaliseren van de vezels. Beweeg weg van de hoofdbundel om gebieden te vinden waar de vezels duidelijk van elkaar gescheiden zijn. Selecteer in een typisch experiment afbeeldingen met slechts één kleurkanaal om bias te voorkomen.Maak vervolgens ongeveer 10 foto's van elk monster. Verplaats de slide om verschillende foto's te maken, aangezien één gebied op een slide mogelijk geen representatieve vezellengtes of replicatiestructuren biedt. Importeer de foto's in een programma voor beeldanalyse.Meet de lengten van de 100 vezelbundels of tel 150 tot 200 verschillende replicatiestructuren. De dubbele labelingsmethode voor vezels maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen verschillende replicatiestructuren. Pas gerepliceerd DNA kan worden gevisualiseerd als lijnen van met antilichamen gelabelde nucleotidenanalogen.Hier wordt een voortdurend verlengende replicatievork weergegeven als aangrenzende rode en groene signalen. Nieuwe initiatiegebeurtenissen kunnen worden onderverdeeld in oorsprongen die zijn geactiveerd terwijl de cellen werden geïncubeerd met het eerste label en oorsprongen die activeerden tijdens de incubatie met het tweede label. De eerste categorie bestaat uit naburige groene, rood-groene signalen en de laatste uitsluitend uit een groene lijn.Termineringsgebeurtenissen manifesteren zich als aangrenzende rode en groene kleuren. Rode signalen zijn verspreid aanwezig. De oorsprongen bestaan uit opeenvolgende oorsprongen en termineringssignalen.Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen gestopte of ingestorte replicatievorken worden gedefinieerd als een uitsluitend rood signaal of als een rode lijn gevolgd door een kort groen traject. In dit experiment hebben de wildtype DT 40-cellen een gemiddelde vorksnelheid van 0,4 microns per minuut. Met 63% lopende vorken, 10% origins, 16% gestopte vorken, 8% terminaties en 3% verspreide vezels.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in het visualiseren en analyseren van de dynamiek van replicatievorken in DT 40-cellen. Dit biedt u een essentieel instrument voor het onderzoeken van defecten in de DNA-replicatie.

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

De methodologie helpt bij de analyse van variatie in DNA-replicatiedynamiek in de aanwezigheid van nanodeeltjes. Verschillende methodologieën kunnen worden aangenomen op basis van het cytotoxiciteitsniveau van het materiaal van belang. Daarnaast wordt een beschrijving van de beeldanalyse gegeven om te helpen bij DNA-vezelanalyse.

Demonstratie van de DNA-vezeltest voor het onderzoeken van DNA-schade en reparatiedynamiek geïnduceerd door nanodeeltjes

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.

Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom

Dit protocol schetst een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde DNA-replicatietest met één molecuul, waardoor real-time visualisatie van interacties tussen DNA-polymerasen en obstakels zoals G-quadruplex-structuren mogelijk is.

Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen

Leer DNA-replicatie visualiseren op enkelmoleculair niveau in DT40-cellen met behulp van DNA-vezeltechniek. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van replicatievorkdynamica mogelijk.

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Meer video's verkennen