Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-replicatie op het niveau van enkele moleculen te visualiseren. Begin door gehalogeniseerde nucleotide-analogen in nieuw gesynthetiseerd DNA in te bouwen. Zoek in levende cellen de cellen met gelabeld DNA op een microscoop.

Leg vervolgens de cellen op een microscoopglas en strek het DNA uit op het microscoopglas. Daaropvolgende immunokleuring van DNA-vezels en analyse van de fluorescente microscoopbeelden kunnen de globale replicatieforkdynamiek verhelderen om een kwantitatieve analyse mogelijk te maken van parameters die het algehele replicatieprogramma beïnvloeden. In de afgelopen jaren zijn verschillende versies van de DNA-vezel Fluor-technieken ontwikkeld om de beweging van individuele replicatieforken binnen levende cellen te visualiseren.

Dit in vivo-experiment in DT 40-cellen dat je zojuist gaat zien, kan binnen een dag worden uitgevoerd en vereist alleen algemene laboratoriumapparatuur en een fluorescentiemicroscoop. Dr.Rebecca Schwab, een postdoc voor mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om DT 40-cellen in vivo te labelen, begint u met een exponentieel groeiende cultuur. Voeg IDU-label toe tot een eindconcentratie van 25 micromolair en meng de celsuspensie.

Incubeer de cellen goed gedurende 20 minuten bij 38 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens de CLDU-label toe tot een eindconcentratie van 250 micromolair. Meng en incubeer de celsuspensie.

Was nu de DT 40-cellen met ijskoud PBS. Suspendeer de celpellets in koud PBS en bewaar de gelabelde cellen op ijs. Breng twee microliters van de celsuspensie aan op een uiteinde van het glazen glas en laat het luchtdrogen tot het volume van de druppel sterk is verminderd, maar niet volledig droog.

Voeg nu zeven microliters vezelliseringsoplossing toe bovenop de celsuspensie en meng de oplossingen voorzichtig door te roeren met een pipettip. Incubeer gedurende twee minuten. Kantel vervolgens de platen naar 15 graden om de vezels langs de plaat te laten verspreiden. Zodra de vezeloplossing de bodem van de plaat heeft bereikt, plaats deze horizontaal om te luchtdrogen.

Op dit punt zou een dunne, ondoorzichtige lijn langs de plaat zichtbaar moeten zijn. Markeer het begin van de uitgerekte vezels met een potlood. Dompel de platen eerst 10 minuten in drie tot één methanol naar azijnzuur.

Was de platen in gedestilleerd water en dompel ze vervolgens 80 minuten in 2,5 molair zoutzuur. Was de platen drie keer vijf minuten in PBS en dep ze af. Verzamel overtollig PBS op een papieren handdoek.

Richt de platen vervolgens horizontaal. Pipet 5% BSA in PBS bovenop elke plaat en plaats een dekglas. Laat 20 minuten incuberen. Verplaats het dekglas voorzichtig naar beneden over de glazen plaat.

Verwijder het overtollige BSA met een papieren handdoek. Pipet vervolgens 50 microliter van de primaire anti-BRDU-antilichaamoplossing op elke plaat.

Bedek een spel met een dekglas en incubeer in een bevochtigde kamer gedurende twee uur. Na het verwijderen van de dekglazen, was de platen drie keer vijf minuten in PBS. Breng 50 microliter van de secundaire antilichaamoplossing aan, plaats dekglas en bescherm de platen ook tegen licht.

Incubeer vervolgens een uur. Verwijder de dekglazen en was de platen drie keer vijf minuten in PBS. Voeg tenslotte een druppel vectorschildmontagemedium toe aan elke plaat.

Druk voorzichtig op een dekglas en verwijder overtollig vocht eromheen. Verzegeld de dekglazen met transparante nagellak en laat luchtdrogen met een papieren handdoek. Bewaar de platen op minus 20 graden Celsius.

Plaats een druppel indomsingsolie op een plaat dicht bij de potloodmarkering en begin de vezels te lokaliseren. Ga weg van het hoofdbundel om gebieden te vinden waar vezels duidelijk van elkaar gescheiden zijn. Selecteer in een typisch experiment foto's alleen met één kleurenkanaal om vooringenomenheid te voorkomen.

Neem vervolgens ongeveer 10 foto's van elk monster. Beweeg langs de plaat om de verschillende foto's te maken, omdat één gebied van een plaat mogelijk geen representatieve vezellengten of replicatiestructuren biedt. Importeer foto's in een afbeeldingsanalyseprogramma.

Meet de lengtes van de 100 vezelbanen en tel of 150 tot 200 verschillende replicatiestructuren. De dubbele labelingvezeltechniek maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen verschillende replicatiestructuren. Nieuw gerepliceerd DNA kan worden gevisualiseerd als lijnen van antilichaamgelabelde nucleotide-analogen.

Hier wordt een voortdurend verlengende vork weergegeven als aangrenzende rode en groene signalen. Nieuwe initiatiegebeurtenissen kunnen worden verdeeld in origines die zijn ontstaan terwijl de cellen werden geïncubeerd met de eerste label en origines die ontstonden tijdens de incubatie met de tweede label. De eerste bestaat uit aangrenzende groene, rood-groene signalen en de laatste uit een groene lijn.Alleen.

Terminatiegebeurtenissen manifesteren zich als aangrenzende rood-groen. Rode signalen verspreid. Origines bestaan ​​uit opeenvolgende origines en terminatiesignalen.

Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen vastgelopen of ingeklapte vorken worden gedefinieerd als alleen een rood signaal of een rode lijn, gevolgd door een korte groene spoor. In dit experiment hebben de wildtype DT 40-cellen een gemiddelde vorksnelheid van 0,4 micron per minuut. Met 63% voortdurende vorken, 10% origines, 16% vastgelopen vorken, 8% terminaties en 3% verspreide vezels.

Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de dynamische replicatiefork in DT 40-cellen kunt visualiseren en analyseren. Dit zal u een essentieel hulpmiddel bieden voor het onderzoeken van defecten in DNA-replicatie.