Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

We presenteren een protocol voor de elektronenmicroscopische visualisatie van de replicerende domeinen in de cel door de EdU-etikettering van het nieuw gesynthetiseerde DNA en labeldetectie met zilververbetering van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van het chromatine. Dit protocol geeft de pre-embedding-etikettering met hoog contrast met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van het chromatine geeft voor de monsterverwerking bij kamertemperatuur. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de hechtingscel die groeit op de coverslips in de petrischaal.

Voeg EdU toe aan de eindconcentratie van 10 micromol en plaats de cellen in de incubator voor de gewenste etiketteringstijd. Fixeer de gelabelde cellen met 2,5% gluaradehydraat in een 100 millimol natriumcacellodaatoplossing gedurende één uur. Langere fixatietijd kan de EdU-etikettering nadelig beïnvloeden.

Verwijder glutaaraldehyde door de monsters te spoelen met PBS aangevuld met vijf millimol magnesiumchloride, verder beschouwd als PBS-ster. Was drie keer gedurende 10 minuten. Permeabiliseer plasmamembranen met 1% oplossing van Trione X-100 in PBS-ster, breng twee veranderingen aan gedurende vijf minuten elk.

Deze oplossing wordt verder aangeduid als PBS-ster T.Was het monster uitgebreid met PBS-ster. Vijf wissels voor elk vijf minuten. Blus de resterende aldehydegroepen met 20 millimol glycine in PBS star, twee keer gedurende 10 minuten.

Plaats het monster gedurende een half uur in PBS star met 1%BSA. Bereid tijdens het blokkeren in BSA de reactiecocktail voor op EdU-detectie. De volgorde van componenttoevoeging is belangrijk.

EdU biotine-azide conjugatie wordt uitgevoerd in de vochtige kamer om de verdamping en concentratieverschuivingen in de reactiecocktail te minimaliseren. Bereid de vochtige kamer voor. Plaats de coverslip op de parafilm met een naar boven gerichte cellen en leg 50 tot 100 microliter van de reactiecocktail op de coverslip.

Reactie duurt 30 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie door het monster in PBS-ster T te wassen, vijf keer gedurende vijf minuten elk. Blokkeer opnieuw met 1%BSA in PBS ster T voor nog een half uur.

Bereid streptavidin-Nanogold oplossing in PBS ster T met 1%BSA. Incubeer het monster met streptavidin 's nachts bij plus vier graden in een nieuw bereide vochtige kamer. De procedure is dezelfde als bij EdU biotine-azide conjugatie.

Stop de reactie en was het monster, vijf keer gedurende 10 minuten elk met PBS-ster T.Stabiliseer biotine streptavidin complex door extra fixatie zal 1% glutaaraldehyde PBS ster gedurende een half uur. Verwijder glutaaraldehyde door intensief te wassen met gedeïoniseerd water. Blus resterende aldehydegroepen met één milligram per milliliter natriumboorhydride.

Was opnieuw grondig. De volgende stap is het vergroten van de grootte van Nanogold deeltjes door middel van zilverafzetting op de gulden koers. Bereid premixen voor om de activiteit in de donkere kamer te minimaliseren.

Breng de monsters in evenwicht met de wasbuffer en ga naar een donkere kamer. Meng in de donkere kamer de componenten om de wasoplossing te bereiden en breng deze aan op de monsters. Acacia poeder oplossing is zeer visicles.

Dus tijdens het mengen van de componenten, schommel de buis langzaam om bubbel- en schuimvorming te voorkomen. De reactie duurt twee tot vijf minuten. We raden aan om een testrun uit te voeren om de optimale reactietijd te bepalen.

Een langere incubatietijd kan resulteren in een niet-specifieke zilverafzetting. Om de reactie te stoppen, spoelt u het monster snel af met drie tot vijf keer het gedeïoniseerde water. Gevolgd door nog drie wissels gedurende elk vijf minuten.

Om de zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door het osmiumtetroxide, incubeer je de monsters in 0,05% tetrachloorzuur gedurende twee minuten in het donker. Was grondig met gedeïoniseerd water. In dit stadium wordt extra contrast toegevoegd aan het DNA-bevattende materiaal.

Verzadig het monster met DRAQ5 DNA-kleuring. Voeg diamionobenzidine-oplossing toe aan het monster en incubeer gedurende één minuut. Verplaats de hoeslip in de petrischaal met glazen bodem en plaats deze op het podium van de omgekeerde microscoop.

Bestraal verschillende gezichtsvelden met 640 nanometer rood licht. Linkerpaneel toont de volledige fotobleking van DRAQ5. Op het rechterpaneel wordt hetzelfde gezichtsveld weergegeven in het doorgelaten licht dat DAB-neerslag vertoont.

Was monsters met gedeïoniseerd water. De volgende fase moet onder de zuurkast worden uitgevoerd. Bereide gedeeltelijk gereduceerde osmiumtetroxide-oplossing.

Wees voorzichtig. Deze stof is zeer vluchtig en giftig. Breng de bereide oplossing aan op het monster.

In dit stadium reageren de gereduceerde osmiumverbindingen met diamionobenzidineafzettingen en verhogen ze het contrast van het DNA. Gooi osmium bevattende oplossing volgens uw lokale regelgeving weg en was monsters drie keer gedurende vijf minuten elk. Het monster wordt verder gedehydrateerd in een reeks toenemende ethanolconcentraties gevolgd door de infiltratie van de cellen met ethanolharsmengsels.

Vervang alcoholharsmix door vers bereide pure hars. Vul de juiste inbeddingsvorm met een vers bereide hars. Plaats de dekplaat met een cel naar beneden gericht over de met hars gevulde holte.

Laat de hars 24 uur uitharden bij 37 graden. Daarna op 60 graden voor minstens twee dagen. Verwijder hars van een onderoppervlak van een hoes.

Laat de plaat in een vloeibare stikstof vallen en breng deze vervolgens over in kokend water. Het glas moet loskomen. Herhaal indien nodig.

Bestraalde gezichtsvelden moeten duidelijk zichtbaar zijn vanwege de diamionobenzidineafzetting en DAB-kleuring. Knip het interessegebied uit de plaat met behulp van de ijzerzaag of een ander geschikt instrument. Plaats de uitsparing in de ultramicrotome eenvoudige houder.

Stel de ultramicrotoom in voor het laatste trimmen van blokken. Bereid met het scheermesje de piramidevormige pilet voor. De grootte van een vlak gebied bovenop de piramide moet ongeveer 400 bij 200 micron zijn.

Monteer de geprepareerde piramide in de ultramicrotome arm en installeer het mes. Bereid de secties voor. De sectiedikte kan worden aangepast aan de experimentele vereisten.

We streven naar EM-tomografie. Dus bereidden we secties voor met een dikte van 250 nanometer, ook wel semi-dunne secties genoemd. Maak de secties los van de rand van het mes en monteer ze op een sleufraster.

We gebruikten een gleufrooster, ze waren rond een millimeter om rond te zijn, een millimeter zijopening. De kleine opening zorgt voor een betere stabiliteit van de secties. Laat de monsters drogen op het rooster.

Op dit moment zijn de secties klaar voor observatie. Plaats het rooster in de monsterhouder van de elektronenmicroscoop. Laad het monster in de elektronenmicroscoop.

Koop kantelseries. Replicatiehaarden in celkernen van zoogdieren vertonen verschillende distributiepatronen, afhankelijk van de progressie van de S-fase. Succesvolle EdU-etikettering bevestigd door de klikreactie met fluorescerend gelabeld azide toont een typisch replicatiepatroon in de heterogene celpopulatie na glutaaraldehydefixatie bovenop.

Streptavidin etikettering kan worden beïnvloed door glutaaraldehyde. Controleer dus eerst de fluorescentie streptavidin kleuring onder dezelfde conditie als streptavidin nanogold op de bodem. Goed resultaat van de zilververbeteringsprocedure is een donkerbruine kleuring van enkele kernen en zeer flauwgevallen gele cytoplastvlek, weergegeven op de bodem.

Voordeel van een pre-embedding labeling is de mogelijkheid om cellen te selecteren voor de sectioning. Het is in dit stadium mogelijk omdat de etiketteringspatronen zichtbaar worden onder een heldere veldmicroscoop. De juiste etikettering resulteert in de goed afgebakende replicatiesites.

Pijlpunten tonen de DAB-gekleurde chromatinevezels. De achtergrondetikettering aan de rechterkant is beperkt tot enkele nanodeeltjes per vierkante micron. Halfdunne secties zijn klaar voor tomografie en vereisen geen toevoeging van gouden nanodeeltjes.

De beschreven aanpak die wordt gebruikt voor de studies van chromatineorganisatie op locaties met ingeschakelde replicatie. Voor analyse van postreplicatieve herschikking van chromatine inclusief hoge resolutie beeldvorming van chromatine segregatie. Het werd ook gebruikt voor gerepliceerde etikettering van grote chromosomale domeinen en studies van hogere orde chromatinevouwing en heterochromatine.

Deze beeldvormingstechniek is ook belangrijk als referentiepunt voor de gegevens die worden gegenereerd door andere niet-microscopische benaderingen. De methode kan ook worden ondergebracht in gecorreleerde microscopische studies, waaronder superresolutietechnieken. Dit opent nieuwe horizonten in studies van chromatine hogere orde structuur en de dynamiek ervan in de verschillende fysiologische toestanden van de cel.