Name: Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Verken experimentele methoden om mitochondriale lokalisatie en functie van de nucleaire celcycluskinase Cdk1 te bestuderen. Deze aanpak onthult inzichten in nucleo-mitochondriale communicatie tijdens de celcyclus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies CA133402, CA152313 en het Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We danken de University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory met financiering van de NCI P30 CA0933730, en NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 en S10 RR 026825 subsidies en met technische assistentie van Ms. Bridget McLaughlin en Mr. Jonathan Van Dyke voor hun hulp bij de flowcytometrie-experimenten.

<ol><li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci+Suppl%22%5BJournal%5D)">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li>
<li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li>
<li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1%2Fcyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li>
<li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+converting+NADH%3Aquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li>
<li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li>
<li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li>
<li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I%3A+structure%2C+function+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li>
<li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2%2FM+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeting+sequence%2C+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li>
<li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3%27-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+%27click%27+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%2C+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).</li>
<li>Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+D+%22Flow+Cytometry%22">Flow Cytometry</a>. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li>
<li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2%2BM+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protcols%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li>
<li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane%3A+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li>
<li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+translation--dual+destination%3A+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li>
<li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyclinB1%2FCdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li>
<li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341(2010).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li>
<li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li>
<li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22BD+Biosciences+Appl+Notes%22">BD Biosciences Appl Notes</a>. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Zoals de eiwitten die bestemd zijn voor andere subcellulaire organellen, de beoogde mitochondriale eiwitten bezitten targeting signalen in de primaire of secundaire structuur die hen direct naar het organel met behulp van uitgebreide eiwit translocatie en vouwmachines 21,22. Mitochondriën targeting sequenties (MTS) uitsluitend verkregen van mitochondriale resident eiwitten zoals COX8 kan worden toegevoegd aan N-terminus van elke gensequentie specifieke eiwitten in de mitochondriën richten 11,23,24....

In zoogdieren, celcyclus progressie afhankelijk sterk geordende gebeurtenissen gecontroleerd door cyclinen en cycline-afhankelijke kinasen (Cdks) 1. Via haar cytoplasma, nucleaire en centrosomal lokalisatie, CyclinB1 / Cdk1 is in staat om verschillende gebeurtenissen in mitose zoals nucleaire envelop afbraak en centrosome scheiding 2 synchroniseren. CyclinB1 / Cdk1 mitotische cellen beschermt tegen apoptose 3 en bevordert mitochondriale splitsing, een kritische stap voor een gelijke verdeling van mitochondriën de nieuw gevormde dochtercellen 4. In prolifererende zoogdiercellen wordt mitochondriale ATP gegenereerd via oxidatieve fosforylering (OXPHOS) machines (elektronentransportketen), dat bestaat uit 5 multi-subunit complexen; complex I - complex V (CI-CV). Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): ubiquinone oxidoreductase of complex I (CI) is de grootste en minst begrepen van de vijf complexen 5. Het complex consists van 45 subeenheden, 14 hiervan vormen de katalytische kern. Eenmaal geassembleerd, het complex uit van een L-vormige structuur met een arm uitsteekt in de matrix en de andere arm ingebed in het binnenste membraan 6,7. Mutaties in CI subeenheden zijn de oorzaak van verschillende mitochondriale aandoeningen 8. Een functioneel efficiënt CI in OXPHOS vereist niet alleen algemene mitochondriale respiratie 9, maar ook voor een succesvolle celcyclusprogressie 10. Het ontrafelen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het functioneren van deze membraangebonden enzymcomplex in gezondheid en ziekte kan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische procedures en geavanceerde therapeutische strategieën mogelijk te maken. In een recente studie, hebben wij gevonden dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria in de (Gap 2) G2 / (mitose) M fase en fosforyleert CI subeenheden mitochondriale energieproductie verbeteren, potentieel verhoogde energiebehoefte van cellen tijdens cel offset 11 cyclus. Hier sho wewcase experimentele werkwijzen en strategieën die kunnen worden gebruikt om mitochondriale translocatie van andere nucleaire / cytoplasmatische kinasen bestuderen hun mitochondriale substraten en functionele gevolgen van de mitochondriale lokalisatie middels CyclinB1 / Cdk1 als voorbeeld. De vaststelling dat de CyclinB1 / Cdk1 complex verplaatst zich in mitochondria als dat nodig was voor de studies van de mitochondriën-specifieke overexpressie en knock-down van dit complex. Mitochondriën-specifieke expressie van eiwitten te bereiken, kan men een mitochondria doelsequentie (MTS) toevoegen aan de N-terminus van het eiwit van belang. Mitochondriën targeting sequenties kan de sortering van de mitochondriale eiwitten in de mitochondria welke gewoonlijk 12 verblijven. We hebben een 87 base mitochondria targeting sequentie afgeleid van de voorloper van de menselijke cytochroom c oxidase subunit 8A (COX8) gebruikt en gekloond het in Green Fluorescent Protein (GFP) gemerkte CyclinB1 of Red FluorescentEiwit (RFP) gemerkte Cdk1 bevattende plasmiden in frame. Deze methode liet ons toe om te richten CyclinB1 en Cdk1 in de mitochondriën, in het bijzonder het veranderen van de mitochondriale expressie van deze eiwitten zonder dat hun nucleaire zwembad. Door fluorescent tagging deze eiwitten, waren we in staat om hun lokalisatie in real time te volgen. Zo hebben we MTS geïntroduceerd in een plasmide dat RFP-tag dominant negatief Cdk1, wat ons toeliet om specifiek knock down het mitochondriale expressie en functies van Cdk1. Het is essentieel om onderscheid te maken tussen mitochondriale en nucleaire functies van de kinasen die dubbele lokalisaties zoals Cdk1 hebben. Techniek MTS in de N-terminale van deze tweevoudige functionaliteit kinasen biedt een goede strategie die gemakkelijk toe te passen en effectief. Aangezien Cdk1 is een celcyclus kinase is essentieel voor de voortgang van de celcyclus te bepalen wanneer Cdk1 wordt vertaald in mitochondria. Hiervoor hebben we een nieuwe metho gebruiktd gehalte aan DNA in cellen te volgen. Traditionele werkwijzen omvatten het gebruik BrdU (bromodeoxyuridine), een synthetisch analoog van thymidine, die wordt opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S fase van de celcyclus te vervangen thymidine. Vervolgens de cellen die actief replicerend hun DNA kan worden gedetecteerd met behulp van anti-BrdU-antilichamen. Een nadeel van deze werkwijze is dat het denaturatie van DNA toegankelijk voor de BrdU antilichaam verschaffen door scherp methoden zoals zuur of warmtebehandeling, hetgeen kan leiden tot onverenigbaarheid tussen resultaten 13,14. Als alternatief hebben we gebruik gemaakt van een soortgelijke benadering van het actief delende cellen met een andere thymidine analogon EDU controleren. Edu-detectie vereist geen agressieve DNA denaturatie een zacht reinigingsmiddel behandeling kan de detectie reagens om toegang te krijgen tot de EDU in nieuw gesynthetiseerde DNA. De EDE methode heeft bewezen betrouwbare, consistente en potentieel voor high-throughput analyse 15 zijn. Tenslotte, to bepalen de mitochondriale substraten Cdk1, gebruikten we een proteomics tool genaamd 2D-DIGE, die is een verbeterde versie van de klassieke twee-dimensionale gelelektroforese. Tweedimensionale elektroforese scheidt proteïnen op basis van hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie en het molecuulgewicht in de tweede. Aangezien post-translationele modificaties als fosforylatie beïnvloeden het isoelektrisch punt en het molecuulgewicht van de eiwitten, kan 2D gels verschillen tussen fosforylatie status van eiwitten in verschillende monsters te detecteren. De grootte (stippellijn intensiteit) eiwit vlekken verandert met het expressieniveau van eiwitten, waardoor kwantitatieve vergelijking tussen meerdere monsters. Met behulp van deze methode, waren we in staat om de gefosforyleerde eiwitten te onderscheiden in wild-type versus mutant-mitochondriën gerichte Cdk1 tot expressie brengen. De specifieke eiwit plekken die toonde in het wild-type, maar ontbraken in de mitochondriën gerichte mutant Cdk1 voorbereiding werden geïsoleerd engeïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. In traditionele 2D-gels worden trifenylmethaankleurstoffen gebruikt om de eiwitten zichtbaar op de gel. 2D-DIGE gebruikt fluorescent eiwit labels met minimaal effect op proteïne elektroforetische mobiliteit. Ander eiwit monsters kunnen worden gelabeld met verschillende fluorescente kleurstoffen, gemengd en gescheiden door de identieke gels, waardoor de co-elektroforese van meerdere monsters op één gel 16. Dit minimaliseert de gel naar gel variaties wat een kritiek probleem in gel-gebaseerde proteomics onderzoek.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse secundaire antilichaam</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 geconjugeerd</td></tr><tr><td>Anti-konijn secundaire antilichaam</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 geconjugeerd</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Voor in vitro kinase assay</td></tr><tr><td>Cdk1 antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 kinase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Voor celcyclusanalyse met EdU-labeling</td></tr><tr><td>COX IV antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4844S</td><td>Voor mitochondriale immunokleuring</td></tr><tr><td>Cyclin B1 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>CyclinB1/Cdk1 enzymcomplex</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Vermijd bevriezen/ontdooien</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Fluor Labeling Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel en DIGE Buffer Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Voor plaatsgerichte mutagenese</td></tr><tr><td>Dpn I enzym</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Voor plaatsgerichte mutagenese</td></tr><tr><td>Dry Strip cover vloeistof</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Gebruikt als minerale olie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Gebruikt als vacuümcentrifuge concentrator</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Anti-fade montageoplossing</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>Voor celcyclusanalyse met EdU-labeling</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Voor in vitro kinase assay</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Voor het zuiveren van DNA-fragmenten uit agarose gels</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Gels</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>IEF (iso-elektrisch focussen) strips</td></tr><tr><td>Geïmmobiliseerd glutathion</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Glutathione-agarose kralen</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Iso-elektrisch Focussen Unit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor strip houders</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranosid&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Voor CyDye labelen</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red/Green</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Mitochondriale fluorescente kleurstoffen</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>GFP-expresserende vector</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>GST-expresserende vector</td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 dialyse slang</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>als poreuze membraanslang voor dialyse</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Fosfoproteïne Gel Kleur</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Voor het kleuren van fosfoproteïnen op 2D gels</td></tr><tr><td>Proteinase remmercocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>QuikChange plaatsgerichte mutagenese kit</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep Plasmid Isolatiekoffertje</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1 remmer</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Complex I remmer</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>Natriumpyrofosfaat decahydraat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>Natrium &beta;-glycerofosfaat</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Voor cellyse buffer</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>Microplaatlezer</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Weefselmolen stamper</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Voor mitochondria isolatie</td></tr><tr><td>Weefselmolen buis</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Voor mitochondria isolatie</td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Laser gel scanner voor 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus kinase, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Hoewel mitochondriën hun eigen transcriptionele machinerie bezitten, wordt slechts 1% van de mitochondriale eiwitten gesynthetiseerd binnen het orgaan. De nucleair gecodeerde eiwitten worden in mitochondriën getransporteerd, geleid door hun mitochondriale doelwitsequenties (MTS); echter, een meerderheid van de mitochondriale gelokaliseerde eiwitten mist een identificeerbare MTS. Niettemin biedt het feit dat MTS eiwitten kan instrueren om de mitochondriën binnen te gaan een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van mitochondriale functies van normaal nucleaire en/of cytoplasmatische eiwitten. We hebben recent de celcycluskinase CyclinB1/Cdk1 complex in de mitochondriën geïdentificeerd. Om de mitochondriale functies van dit complex specifiek te bestuderen, waren mitochondriale overexpressie en knock-down van dit complex essentieel zonder interferentie met zijn nucleaire of cytoplasmatische functies. Door CyclinB1/Cdk1 te labelen met MTS, konden we mitochondriale overexpressie van dit complex bereiken om zowel zijn mitochondriale doelen als functies te bestuderen. Door dominant-negatief Cdk1 met MTS te labelen, werd remming van Cdk1-activiteit bereikt, met name in de mitochondriën. Potentiële mitochondriale doelen van het CyclinB1/Cdk1 complex werden geïdentificeerd met behulp van een gel-gebaseerde proteomics aanpak. In tegenstelling tot traditionele 2D gel-analyse, gebruikten we 2-dimensionale verschilgel-elektroforese (2D-DIGE) technologie gevolgd door fosfoproteïnestering om differentieel gefosforyleerde eiwitten in mitochondriale Cdk1 expressiecellen fluorescentielabel te geven. Identificatie van fosfoproteïne vlekken die veranderd waren in wild type versus dominant-negatief Cdk1 dragende mitochondriën onthulde de identiteit van mitochondriale doelen van Cdk1. Ten slotte, om het effect van CyclinB1/Cdk1 mitochondriale lokalisatie in celcyclus progressie te bepalen, werd een celproliferatie assay gebruikt met behulp van een synthetisch thymidine analoog EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) om de cellen te monitoren terwijl ze door de celcyclus gaan en hun DNA repliceren. Alles bij elkaar hebben we een verscheidenheid aan benaderingen gedemonstreerd die beschikbaar zijn om mitochondriale lokalisatie en activiteit van een celcycluskinase te bestuderen. Dit zijn geavanceerde, maar gemakkelijk te volgen methoden die nuttig zullen zijn voor veel celbiologie onderzoekers.

Sub-mitochondriale lokalisatie van CyclinB1 en Cdk1 Natriumcarbonaat extractie wordt bepaald of een eiwit bevindt zich in de mitochondriën of op het buitenoppervlak, namelijk buitenste membraan. Zodra een proteïne blijkt te lokaliseren binnen de mitochondria, kan nadere bepaling van sub-mitochondriale lokalisatie worden gezet mitoplasting combinatie met protease vertering. Om de sub-mitochondriale lokalisatie ...

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om de submitochondriale lokalisatie van een normaal gesproken nucleaire celcycluskinase te bepalen en vervolgens te analyseren hoe de mitochondriale lokalisatie de voortgang van de celcyclus beïnvloedt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het mitochondriale onderzoek, zoals de wijze waarop de nucleus communiceert met de mitochondriën tijdens de celcyclus. Door eiwitten te labelen met een mitochondriale leidingsequentie kunnen we gebruikmaken van specifieke overexpressie van eiwitten in de mitochondriën, zodat we hun mitochondrie-specifieke functies kunnen bestuderen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mitochondriale targeting van bepaalde eiwitten, kan deze ook worden toegepast op andere organellen, zoals de nucleus, het ER, het golgi-apparaat en een lysosoom. Breng na het kweken, homogeniseren en pelleten van de cellen volgens het tekstprotocol het supernatant over in een nieuwe buis. Centrifugeer het monster vervolgens bij 7.000 g en 4 °C gedurende 10 minuten.Gebruik vervolgens 200 µL ijskoud IBC-buffer om het pellet opnieuw te suspenderen en verdeel het homogenaat in twee aliquoten. Centrifugee

experimental-approaches-to-study-mitochondrial-localization-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.

Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Dit artikel beschrijft het gebruik van confocale microscopie en ImageJ om de dynamiek van mitochondriale splijting/fusie te beoordelen via Dendra2 fotoschakelende fluorescentie.

Beoordeling van mitochondriale splijting/fusiedynamiek in proximale tubulaire cellen van de nier

Verken experimentele methoden om mitochondriale lokalisatie en functie van de nucleaire celcycluskinase Cdk1 te bestuderen. Deze aanpak onthult inzichten in nucleo-mitochondriale communicatie tijdens de celcyclus.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Meer video's verkennen