Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Het algemene doel van de volgende procedure is om de submitochondriale lokalisatie van een normaal nucleair celcycluskinase te bepalen en vervolgens te analyseren hoe de mitochondriale lokalisatie de progressie van de celcyclus beïnvloedt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van mitochondriaal onderzoek, zoals hoe de kern communiceert met de mitochondriën tijdens de celcyclus. Door eiwitten te labelen met een mitochondriënleidende sequentie, kunnen we profiteren van specifieke overexpressies in eiwitten in de mitochondriën, zodat we hun mitochondria-specifieke functies kunnen bestuderen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mitochondriëntargeting van bepaalde eiwitten, kan deze ook worden toegepast op andere organellen, zoals de kern, ER, golgi en een lysosome. Na het kweken, homogeniseren en pelleten van cellen volgens het tekstprotocol, brengt u het supernatant over in een nieuwe buis. En centrifugeer het monster bij 7.000 g en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gebruik vervolgens 200 microliter ijskoud IBC-buffer om het pellet te resuspenderen en verdeel het homogenaat in twee aliquots. Centrifugeer de monsters opnieuw bij 7.000 g en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. En herhaal de wassing.

Na het weggooien van het supernatant, voegt u 30 microliter cellysebuffer toe aan een van de pellets en bewaart u het lysate bij 80 graden Celsius voor immunoblotting. Om natriumcarbonaatextractie met het tweede pellet uit te voeren om oplosbare en membraangebonden eiwitten te scheiden, voegt u 250 microliter 0,1 molair natriumcarbonaat pH 11,0 toe en incubeert u het op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 100.000 g.

Verzamel vervolgens het supernatant en voeg een gelijk volume vers bereid 20% trichloroazijnzuur toe om de eiwitten te bezinken. Laat 30 minuten op ijs staan. Voeg ondertussen 30 microliter cellysebuffer toe aan het pellet en soniceer volgens het tekstprotocol voordat u het bij 80 graden Celsius bewaart voor immunoblotting.

Na de 30 minuten TCA-incubatie, centrifugeert u de reactie bij 15.000 g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en gebruik vervolgens 80 microliter cellysebuffer om het pellet te resuspenderen. Na het isoleren van mitochondriale fracties uit cellen zoals beschreven in het tekstprotocol, scheidt u de mitochondriale fracties in 10 gelijke porties.

Pellet de monsters bij 7.000 g en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Gebruik 30 microliter van een reeks concentraties hypotone sucrosebuffers met of zonder trypsine om elk pellet op te lossen. En incubeer 30 minuten op ijs.

Voeg 3 microliter 10 millimolair PMSF toe aan de trypsine-bevattende flesjes om de trypsine-digestie te stoppen. En incubeer 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters bij 14.000 g en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten.

En breng het supernatant over in een nieuwe buis. Voeg 30 microliter cellysebuffer toe om het pellet te lyzeren. Soniceer de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol en bewaar bij 80 graden Celsius.

Om mitochondriëngerichte GFP/RFP-gelabelde cyclinB-1 Cdk-1-vectoren te construeren, kloneert u de mitochondriëntargetingsequentie van de precursor van humaan cytochroom-c oxidase-subeenheid 8A en plaatst u deze in het kader met het n-terminus van GFP of RFP op de Nhe1- en bAmH1-sites van pEGFP-N1 of pERFP-N1, met behulp van standaard moleculaire kloneringtechnieken. Gebruik de primers die in het tekstprotocol worden beschreven om de Cdk1- en cyclinB1-genen te versterken volgens standaardtechnieken. Gebruik vervolgens BamH1 om de PCR-producten te verteren.

Voer de reacties uit op een 1% agarosegel, voordat u een scheermesje gebruikt om de DNA-fragmenten van de juiste grootte uit te snijden. Gebruik vervolgens een gelextractiekit om het DNA te zuiveren. Bewerk vervolgens een microgram MTS-pEGFP-N1 en MTS-pERFP-N1-plasmiden met 1 microliter BamH1 bij 37 graden Celsius gedurende 2 uur.

Voeg vervolgens 1 microliter kalfsintestinale alkalische fosfatase toe en incubeer 30 minuten bij 37 graden Celsius. Nadat u de verteringsproducten op een 1% agarosegel hebt gedraaid en het DNA zoals zojuist beschreven hebt gezuiverd, zet u een ligatiereactie op met behulp van de reagentia die in het tekstprotocol worden vermeld. Incubeer vervolgens de reactie gedurende een nacht bij 4 graden Celsius.

Transformeer e. coli dH5-alpha competente cellen met 10 microliter van de ligatiemixtuur. En kweek de bacteriën op platen met LB-agar plus 10 milligram per milliliter kanamycine bij 37 graden Celsius gedurende een nacht.

De volgende dag gebruikt u een steriele pipettetip om een kolonie van een plaat te kiezen. En steekt u de tip in een buis met 5 milliliter LB-kanamycine. Incubeer de cultuur gedurende een nacht en gebruik vervolgens 's ochtends een mini-prepkit volgens het tekstprotocol om het plasmide te isoleren.

Om exponentieel groeiende MCF-10A-cellen te transfecteren, gebruikt u Cdk1 of cyclinB-1-plasmiden om plasmidetransfectie-reagens voor te bereiden in een verhouding van 1:2 in 100 microliter serum- en antibioticavrij medium. Transfecteer de cellen en incubeer ze 48 uur bij 37 graden Celsius. Kleur en visualiseer de mitochondriën volgens het tekstprotocol.

Om celsortering uit te voeren, transfecteert u 2 keer 10 tot de 5e cellen met de gewenste vectoren in een 6-wellplaat met een 1:2 verhouding van DNA naar transfectiemiddel bereid in 2,5 milliliter serum- en antibioticavrij medium. Na 48 uur incubatie van de transfectie, gebruikt u flowcytometrie om de cellen die stabiel de GFP-gelabelde Cdk-1 en RFP-gelabelde clyclinB1-eiwitten tot expressie brengen te sorteren volgens het tekstprotocol. Om de celcycluslengte te meten met behulp van de EdU-labeling flowcytometrie-assay, zaait u gesorteerd cellen in 6-wellplaten met een dichtheid van 2,5