Een protocol voor Computer-Based Protein Structure en functie Voorspelling

Het doel van deze procedure is om computationeel de driedimensionale structuren en de biologische functie van eiwitmoleculen te voorspellen op basis van hun aminozuursequenties. Dit wordt bereikt door eerst de secundaire structuur van de eiwitten via machine learning te voorspellen. De sequenties en de voorspelde secundaire structuur worden vervolgens vergeleken met de opgeloste structuren in de PDB-bibliotheek om de best mogelijke structurele templates te identificeren.

Deze procedure wordt threading genoemd. Na de threading-procedure zal het IT AER-programma de templates opdelen in fragmenten op basis van de uitlijningen van de sequentietemplates, om deze fragmenten vervolgens in de derde stap te herassembleren tot modellen van volledige lengte. Volledige atomaire modellen worden geconstrueerd door verfijningen op atomair niveau om waterstofbindingsnetwerken te optimaliseren en sterische overlap te verwijderen.

De laatste stap van de procedure is het identificeren van de biologische functie van de eiwitten door de voorspelde structuren te koppelen aan eiwitten met een bekende functie in de functiebibliotheek. Het belangrijkste voordeel van ITER ten opzichte van bestaande methoden voor structuurmodellering is de inherente benadering van structurele fragmentassemblage, waardoor de threading-alignments consistent dichter bij de natuurlijke toestand kunnen worden gebracht. Deze hoogwaardige strukturmodellen vormen bovendien de basis voor nauwkeurige, op structuren gebaseerde functionele annotaties om het gebruik van ITER binnen de wetenschappelijke gemeenschap te bevorderen.

Ons laboratorium heeft een website beschikbaar gesteld waar eiwitsequenties kunnen worden ingediend bij iter. Deze website fungeert als een knooppunt via welke gebruikers wereldwijd een interface kunnen registreren naar een computercluster dat ITER-simulaties beheert en uitvoert. Een ITER-simulatiejob bestaat uit meer dan een dozijn kleinere subsimulaties.

Wanneer deze simulaties op een enkele computer met één processorkern worden uitgevoerd, kan dit meer dan honderd uur duren. De computercluster van het Zang-lab neemt deze subsimulaties over en verdeelt ze over honderden computers, waardoor het mogelijk is om meer dan 2000 simulaties uit te voeren. Dankzij onze computercluster zijn wij in staat om elke dag honderden I taster-simulaties te voltooien.

Zelfs met deze capaciteit moet er nog veel werk worden verzet om het systeem te optimaliseren en de wachttijd voor onze online IT AER-gebruikers te minimaliseren. Om te beginnen met het experiment voor structuur- en functiemodellering, logt u in op de IT AER-webpagina. De URL-adressen van alle relevante webpagina's die hier worden besproken, zijn te vinden in het geschreven protocol.

Kopieer en plak de aminozuursequentie in het opgegeven formulier, of upload de sequentie direct door op de knop 'bladderen' te klikken. Geef een e-mailadres en een naam voor de taak op. Gebruikers kunnen optioneel externe contact- of afstandbeperkingen tussen residuen specificeren.

Voeg een extra template toe of sluit bepaalde template-eiwitten uit tijdens het proces van structuurmodellering. Klik op de knop 'run it taser' om de sequentie te verzenden. Controleer de status van de ingediende taak door de IT taser-wachtrijpagina te bezoeken.

Klik op het zoektabblad en gebruik het job-ID-nummer of de querysequentie om naar de ingediende job te zoeken. Nadat de modellering van de structuur en functie is voltooid, wordt er een notificatie-e-mail verzonden naar het opgegeven e-mailadres, met daarin een afbeelding van de voorspelde structuren en een weblink. Klik op deze link om de resultaten te bekijken en te downloaden.

Begin de structuuranalyse door de voorspelling van de secundaire structuur te bestuderen, waarbij H staat voor alfa-helix, S voor bèta-strand en C voor coil. Houd daarnaast rekening met de betrouwbaarheidsscore van de voorspelling voor elk residu. Zoek naar regio's met lange sequenties van regelmatige voorspellingen voor de secundaire structuur om de kernregio in het eiwit te schatten.

De structurele klasse van het eiwit kan ook worden geanalyseerd op basis van de distributie van secundaire structurele elementen. Bekijk de voorspelde oplosmiddeltoegankelijkheid om begraven en aan het oplosmiddel blootgestelde regio's vast te stellen. In de query variëren de waarden van de voorspelde oplosmiddeltoegankelijkheid van een score van nul voor een begraven residu tot een score van negen voor een blootgesteld residu.

Regio's die voornamelijk uit begraven residuen bestaan, kunnen worden gebruikt om de kernregio in het eiwit af te bakenen, terwijl regio's met solvent-geëxponeerde en hydrofiele residuen potentiële hydratatie- of functionele sites zijn. Om de voorspelde tertiaire structuren van het query-eiwit te bekijken, scrolt u naar beneden naar de getoonde interactieve JMO Appt links. Klik op de applet om het uiterlijk van de weergegeven structuur te wijzigen.

Zoom in op een specifieke regio, selecteer specifieke residutypes in het voorspelde model of bereken afstanden tussen residuen. Analyseer de betrouwbaarheidsscores van de structurele modellering om de kwaliteit van de voorspelde structuren te schatten. Csco-waarden liggen doorgaans in het bereik van min vijf tot twee, waarbij een hogere score duidt op een model van betere kwaliteit.

De geschatte TM-score en RMSD van het eerste model worden weergegeven als de geschatte nauwkeurigheid van model één. Klik op de link voor meer informatie over csco. Om de csco-clustergrootte en clusterdichtheid van alle modellen te analyseren, moeten de top 10 threading-templates van het query-eiwit worden geanalyseerd, zoals geïdentificeerd door low mets threading-programma's.

Door naar beneden te scrollen op de resultatenpagina, kunt u de genormaliseerde Z-score bekijken om de kwaliteit van de threading-alignments te analyseren. Alignments met een genormaliseerde csco groter dan één weerspiegelen een betrouwbare alignment en hebben zeer waarschijnlijk dezelfde vouwing als het query-eiwit. Onderzoek de sequentie-identiteit in het threading-aligned gebied en voor de gehele keten om de homologie tussen de query- en template-eiwitten te beoordelen.

Een hoge sequentie-identiteit is een indicator voor de evolutionaire verwantschap tussen de query- en template-eiwitten. Bekijk de in kleur weergegeven threading-uitgelijnde residuen om geconserveerde residuen of motieven in de query- en template-eiwitten visueel te identificeren; een hogere sequentie-identiteit in het threading-uitgelijnde gebied vergeleken met de uitlijning van de gehele keten wijst ook op de aanwezigheid van geconserveerde structurele motieven of domeinen in de query. Beoordeel de dekking van de threading-uitlijning door de uitlijning te inspecteren.

Als de dekking van de beste alignering laag is en beperkt blijft tot slechts een klein gebied van het query-eiwit, of afwezig is voor een lang segment van de query-sequentie, wijst dit erop dat het query-eiwit meer dan één domein bevat. In dat geval wordt aanbevolen om de sequentie te splitsen en de domeinen individueel te modelleren. Bekijk de volgende tabel op de resultatenpagina om de top 10 structurele analogen van het eerste voorspelde model te bepalen, zoals geïdentificeerd door het structurele aligneringsprogramma TM align.

Een TM-score groter dan 0,5 geeft aan dat de gedetecteerde analoog en het model een vergelijkbare topologie hebben en gebruikt kunnen worden om de structurele klasse of eiwitfamilie van het query-eiwit te bepalen. Waarden met een TM-score lager dan 0,3 duiden op een willekeurige structurele gelijkenis. Analyseer de sequentie-identiteit en RMSD in het structureel uitgelijnde gebied om de conservering van ruimtelijke motieven in het model en de structurele analoog te beoordelen.

Inspecteer visueel de gekleurde en uitgelijnde residuparen in de alignering om deze structureel geconserveerde residuen en motieven te identificeren. Raadpleeg de tabel met voorspelde EC-nummers om de top vijf potentiële enzym-OG's van het query-eiwit te bekijken. Het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelling van het EC-nummer met behulp van deze templates wordt weergegeven als de EC-score op basis van benchmarkanalyse.

Functionele overeenkomst tussen het query-eiwit en het template-eiwit kan betrouwbaar worden geïnterpreteerd met een EC-score groter dan 1,1. Zoek vervolgens naar een consensus over de functie tussen de templates die een vergelijkbare vouwing hebben als het query-eiwit. Als meerdere templates hetzelfde EC-nummer hebben en de EC-score groter is dan 1,1, is het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelling zeer hoog.

Wanneer de EC-score echter hoog is, maar er een gebrek is aan consensus tussen de geïdentificeerde hits, wordt de voorspelling minder betrouwbaar en wordt gebruikers aangeraden de gene ontology te raadplegen. In het overzicht van de termvoorspellingen kan de tabel met voorspelde gene ontology-termen worden bekeken om de top 10 homologen van het query-eiwit in de PDB-bibliotheek te identificeren die zijn geannoteerd met gene ontology-termen; elk eiwit is gewoonlijk geassocieerd met meerdere gene ontology-termen die de moleculaire functies, biologische processen en cellulaire locatie beschrijven. Klik op elke term om naar de Amigo-website te gaan en de definitie en lineage te analyseren.

Analyseer de kolom met de functionele homologiescore om de functionele gelijkenis tussen de query- en template-eiwitten vast te stellen. Ook het betrouwbaarheidsniveau voor de overdracht van functionele annotaties van deze eiwitten kan worden geschat. Bekijk de tabel met de consensusvoorspelling van gene-ontologietermen om de overeenkomst in functie tussen de templates te analyseren.

Deze veelgebruikte functies worden gebruikt om de gene ontology-termen van het query-eiwit te voorspellen en om het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelde geo-termen te beoordelen. Scroll ten slotte naar beneden naar de onderkant van de pagina om de top 10 voorspellingen van ligandbindingsplaatsen voor het query-eiwit te bekijken; de voorspelde bindingsplaatsen zijn gerangschikt op basis van het aantal voorspelde ligandconformaties die een gemeenschappelijke bindingspocket delen. De best geïdentificeerde bindingsplaats wordt al weergegeven in de JM OL appt.

Klik op de keuzerondjes om andere voorspellingen te analyseren en de interagerende residuen van het ligand te visualiseren. De BS-score onthult de lokale gelijkenis tussen de bindingsplaats van het model en die van de templates. Een BS-score hoger dan 1,1 wijst op een hoge sequentie- en structurele gelijkenis nabij de voorspelde bindingsplaats.

In het model vergeleken met de bekende bindingsplaats in het sjabloon, is de IT een hoofdpagina die links bevat naar andere nuttige functies. De forumfunctie stelt de gebruiker in staat om een online account aan te maken en hulp te zoeken bij andere ITER-gebruikers met betrekking tot structuurmodellering of hulp bij het interpreteren van de resultaten. De downloadfunctie stelt gebruikers in staat om iter en gerelateerde pakketten te downloaden en op hun computer te installeren.

Dit helpt de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de modelleringsexperimenten te verkorten. Dankzij de wachtrijfunctie kan de status van alle ingediende taken op de IT a Q-pagina worden bekeken. Gebruikers kunnen daarnaast de afbeeldingen van de gemodelleerde structuren voor voltooide taken visueel inspecteren.

Op deze pagina worden ook de verwachte CSCO TM-score en de verwachte RMSD van het eerste model getoond, evenals de indieningsdatum; hier is een uittreksel te zien van de IT AER-resultatenpagina met de querysequentie in faster-formaat, de voorspelde secundaire structuur, de bijbehorende betrouwbaarheidsscores en de voorspelde solventtoegankelijkheid van de residuen. De geanalyseerde kernregio en de potentiële hydratatieplaats in de query zijn respectievelijk gemarkeerd met cyaan- en rode rechthoeken. Hier worden de voorspellingen van de tertiaire structuur voor de query-eiwitten getoond.

De voorspelde modellen worden weergegeven in een interactieve JML-app-outlet, waardoor de gebruiker de weergave van het molecuul kan wijzigen. De modellen kunnen ook worden gedownload door op de downloadlinks te klikken; de betrouwbaarheidsscore om de kwaliteit van het model te schatten wordt vermeld als de csco. Er wordt een voorbeeld getoond van de itta A-resultatenpagina met de top 10 geïdentificeerde threading-templates en alignments door Loomis threading-programma's.

De kwaliteit van de threading-alignments wordt geëvalueerd op basis van de genormaliseerde Z-score, waarbij een waarde groter dan één duidt op een betrouwbare alignment. Gealigneerde residuen in het template die identiek zijn aan de overeenkomstige query-residuen zijn in kleur gemarkeerd om de aanwezigheid van een geconserveerd residu of motief aan te geven. Omgekeerd duidt het ontbreken van een alignment in de meeste top-templates op de aanwezigheid van meerdere domeinen in het query-eiwit, waarbij de niet-gealigneerde residuen overeenkomen met domeinlinkerregio's.

Deze tabel toont de top 10 geïdentificeerde structurele analogen en structurele uitlijningen die zijn gevonden door het TM aligned Structural alignment Program. De rangschikking van de analogen is gebaseerd op de TM-score van de structurele uitlijning. Een TM-score groter dan 0,5 geeft aan dat de twee vergeleken structuren een vergelijkbare topologie hebben.

Een TM-score van minder dan 0,3 duidt op een gelijkenis tussen twee willekeurige structuren. Structureel uitgelijnde residu-paren zijn in kleur gemarkeerd op basis van hun aminozuureigenschap, terwijl niet-uitgelijnde regio's zijn aangegeven met een streepje. Hier is een voorbeeld van de ITR-resultatenpagina waarop geïdentificeerde enzymhomologen van het query-eiwit in de PDB-bibliotheek worden getoond.

Het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelling van het EC-nummer wordt geanalyseerd op basis van de EC-score, waarbij een EC-score groter dan 1,1 duidt op functionele gelijkenis tussen het query-eiwit en het template-eiwit. De tabel met voorspellingen van gene ontology-termen voor het query-eiwit bevat functionele homologen voor het query-eiwit uit de gene ontology template-bibliotheek, gerangschikt op basis van hun functionele homologiescore. Gemeenschappelijke functionele kenmerken van deze hoogst scorende hits worden afgeleid om de uiteindelijke voorspellingen van gene ontology-termen voor het query-eiwit te genereren.

De kwaliteit van de voorspelde gene ontology-termen wordt geschat op basis van de geo-score, waarbij een geo-score groter dan 0,5 duidt op een betrouwbare voorspelling; hier wordt als voorbeeld de resultatenpagina van IT AZA getoond met de top 10 voorspellingen van eiwitligand-bindingsplaatsen met behulp van het cofactor-algoritme. De rangschikking van de voorspelde bindingsplaatsen is gebaseerd op het aantal voorspelde ligandconformaties die een gemeenschappelijke bindingspocket delen. In de query is de BS-score een maat voor de lokale sequentie- en structuursimiliteit tussen de voorspelde bindingsplaats en de template-bindingsplaats, wat nuttig is voor het analyseren van de conservatie van bindingspocket-plaatsen.

Hoewel ISER een van de meest efficiënte algoritmen is voor de voorspelling van proteïnestructuur en -functie, is het belangrijk om te onthouden dat het slechts een voorspelling is op basis van computeralgoritmen. Elke vorm van experimentele gegevens of functionele inzichten, zoals informatie over bindingen tussen residuen, zal uiterst nuttig zijn om de nauwkeurigheid van de voorspellingen te verhogen. De IT AER-server beschikt over een portaal om deze informatie tijdens de modelleringsprocedure op te nemen om aan de toenemende interesse hierin tegemoet te komen.

Het Zang-lab heeft de IT AER-software gratis beschikbaar gesteld voor niet-commercieel onderzoek. Wij werken actief aan de verdere ontwikkeling en verbetering van IT AER en de eye taster, in de hoop dat de beschikbaarheid ervan zal leiden tot grootschalige toepassing buiten het Zang-lab en verdere research binnen de wetenschappelijke gemeenschap zal stimuleren en bevorderen.