In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten
November 23rd, 2011
De In situ Hybridisatie protocol hier beschreven maakt een directe lokalisatie van mRNA en kleine RNA-expressie op het cellulaire niveau met een hoge gevoeligheid en specificiteit. De procedure is geoptimaliseerd voor paraffine-ingebedde weefselcoupes plant, is van toepassing op een breed scala aan planten en weefsels, en kan worden voltooid binnen de tien dagen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om mRNA-expressiepatronen op cellulair niveau met hoge gevoeligheid en specificiteit te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst formele en gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselsecties door een reeks oplossingen te leiden om de was door de weefsels te permeabiliseren en positief geladen minderwaardige groepen in de weefsels te blokkeren die een achtergrondsignaal kunnen opleveren. Vervolgens wordt een DIG-gelabelde RNA-probe specifiek voor het gen van belang in de weefselsecties geïnfiltreerd en worden de slides overnacht gehybridiseerd.
Vervolgens worden de slides behandeld met RNA's. A om niet-specifiek gebonden probe van de secties te verwijderen en vervolgens geïncubeerd met anti DIG-antilichaam. Dat maakt de visualisatie van de gehybridiseerde probe mogelijk door een kleimetrische chemische reactie.
De resultaten tonen een donkerblauw signaal dat detecteerbaar is door lichtmicroscopie specifiek in die cellen binnen het weefsel waarin het gen van belang wordt tot expressie gebracht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze andere expressieanalyses, zoals R-T-P-C-R, microarray of Next Generation Sequencing benaderingen, is dat het I Hybridisatieprotocol dat hier wordt getoond, het expressiepatroon van een gen van belang in zijn weefselcontext onthult. Deze methoden omvatten veel stappen die het best worden geleerd door visuele demonstraties.
We zullen laten zien hoe weefsel moet worden gesneden en ingebed, evenals belangrijke stappen in het Al Hybridisatie pro-protocol die moeilijk zelfstandig onder de knie te krijgen zijn. De methode voor het inbedden van met paraldehyde gefixeerd weefsel zal variëren afhankelijk van het type weefsel dat geanalyseerd moet worden. Het belangrijkste punt hier is om ervoor te zorgen dat de monsters correct zijn georiënteerd voor latere sectievorming.
Een methode voor het inbedden is om plastic mallen en ringen te gebruiken. Om deze procedure te beginnen, warm de mallen op een verwarmingsplaat van 60 graden Celsius en giet vervolgens gesmolten paraffine in de mallen. Gebruik vervolgens verwarmde pincetten om een weefselmonster in elke mal over te brengen en richt het in de gewenste positie.
Verplaats voorzichtig de mal van de plaat naar de werkbank en plaats de witte ring op de mal. Voeg extra mol en was toe. Laat de was geleidelijk afkoelen en harden voordat je gaat secteren.
Verwarm de blokken tot kamertemperatuur en snijd vervolgens elke blok in een trapeziumvorm, waarbij ongeveer één millimeter was rond het monster wordt achtergelaten. Plaats de bijgesneden blok op de microtoom zodat de langere van de twee parallelle vlakken onderaan is. Breng de blok voorzichtig naar de mes en zorg ervoor dat het oppervlak van de blok parallel is aan de messectie.
Als dikte van acht tot 10 micron. Lijn de waslinten uit op een antiaanbaklaag, zoals aluminiumfolie, en selecteer geïnteresseerde secties onder een dissectiescoop. Markeer vervolgens prob bon plus-slides met een potlood.
Gebruik geen pennen of markers omdat deze tijdens het INI-hybridisatieprotocol zullen worden gewist. Verdeel één milliliter schoon milli Q-water over elke slide. Drijf voorzichtig de geïnteresseerde secties op het oppervlak van het water bij kamertemperatuur.
Zorg ervoor dat de glanzende kant naar het water toe gericht is. Breng de slide langzaam over op een slide-warmer. Zet op 35 tot 37 graden Celsius.
Dit temperatuurbereik in tegenstelling tot de veelgebruikte 42 graden Celsius voorkomt de vorming van bellen onder de secties. Giet na vijf minuten het water voorzichtig maar in een vloeiende beweging af zodat het lint naar beneden op de slide daalt. Laat de slides minstens enkele uren of een nacht op 37 graden Celsius drogen zodat het weefsel zich kan hechten om weefselsecties voor te bereiden.
Voor in situ-hybridisatie worden ze eerst ontparaffineerd en gerehydrateerd voor depa-finalisatie. Incubeer de slides in twee wijzigingen van histische heldere oplossing gedurende 10 minuten per keer. Om de weefselsecties te gerehydrateren, voer de slides door een reeks afnemende concentraties ethanol gedurende 30 seconden per keer.
Tijdens de protease-behandeling, die niet in deze video wordt getoond, bereid een glazen schaal voor met 0,1 molair triathlon amine-oplossing en zet deze op een roerplaat in een afzuigkap. Voeg onmiddellijk voordat je de metalen slide-rack in de oplossing plaatst, 1,25 milliliter azijnanhydride toe aan de triathlon amine, buffer en trapkast. Stel bovendien het klemmsysteem en het statief in voor het vasthouden van de slide-rack.
Verlaag de snelheid van de Starr-klem, kleef de slide-rack op het statief en laat de rack in de oplossing zakken, waarbij deze boven de roerstaaf wordt gehouden. Blijf langzaam roeren gedurende 10 minuten nadat het in PBS is gespoeld en opnieuw gedehydrateerd door een ethanolserie. De weefselsecties zijn klaar voor hybridisatie.
Plaats de slides op een schone ondergrond en laat ze vijf tot 10 minuten volledig aan de lucht drogen. Bereid het probe-hybridisatiebuffermengsel voor door de gedenatureerde probe toe te voegen aan 80 microliters hybridisatiebuffer. Meng voor elke slide goed door pipetteren plus, vermijd het maken van bellen.
Pipetteer de probe-hybridisatiebuffer. Meng op de rechterrand van de slide. Laat geleidelijk een dekglas op de slide zakken, zorg ervoor dat de hybridisatieoplossing alle secties bedekt zonder enige bellen.
Tik lichtjes met uw vinger op het dekglas waar bellen zich vormen om ze van alle weefselsecties te verplaatsen. Trek het dekglas niet af, want dit zal de secties beschadigen. Plaats de slides in een vochtigheidskamer met watmanpapier bevochtigd met UE-water en grotendeels bedekt met param.
Versluit de doos goed, incubeer de slides bij de gewenste hybridisatietemperatuur, meestal 50 tot 55 graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. Na voltooiing van het hybridisatieprotocol verwijdert u voorzichtig de dekglazen van de slides. Het dekglas kan eenvoudig vallen wanneer de slide rechtop wordt geplaatst, maar als dit niet het geval is, trek he
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd in situ hybridisatieprotocol voor het visualiseren van mRNA expressiepatronen in paraffine-ingebedde plantweefsels. De methode is geoptimaliseerd voor hoge gevoeligheid en specificiteit, waardoor onderzoekers genexpressie kunnen observeren binnen zijn weefselcontext.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Plantkunde
- Genexpressie Analyse
Achtergrond
- In situ hybridisatie maakt lokalisatie van mRNA en kleine RNA mogelijk.
- Het protocol is toepasbaar op verschillende plantweefsels.
- Het biedt een methode om genexpressiepatronen direct te visualiseren.
- Hoge gevoeligheid en specificiteit zijn belangrijke voordelen van deze techniek.
Doel van de Studie
- Om mRNA expressiepatronen op cellulair niveau te visualiseren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het analyseren van genexpressie in plantweefsels.
- Om de voordelen van in situ hybridisatie te demonstreren ten opzichte van andere expressieanalysemethoden.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van paraffine-ingebedde weefselsecties.
- Infiltratie van DIG gelabelde RNA proben in weefselsecties.
- Hybridisatie van proben en visualisatie door colorimetrische reacties.
- Gebruik van specifieke was- en blokkeeroplossingen om achtergrondsignaal te verminderen.
Belangrijkste Resultaten
- Donkerblauwe signalen werden waargenomen in cellen die het gen van belang tot expressie brengen.
- De methode onthulde genexpressiepatronen binnen de weefselcontext.
- Succesvolle visualisatie werd bereikt met behulp van lichtmicroscopie.
- Het protocol kan binnen tien dagen worden voltooid.
Conclusies
- Het in situ hybridisatieprotocol is effectief voor het bestuderen van genexpressie in planten.
- Het biedt een duidelijk voordeel ten opzichte van andere methoden zoals RT-PCR en microarrays.
- Juiste monstervoorbereiding en oriëntatie zijn cruciaal voor succesvol sectioenen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Precise spatial localization of gene transcripts in plant tissues is critical for de-risking target validation and understanding gene function in developmental and stress-response pathways. In situ hybridization enables high-resolution mapping of mRNA and small RNA expression, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by clarifying gene activity within relevant cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of gene expression at cellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing spatial and temporal expression patterns in situ.
- Facilitates hypothesis testing for gene function in developmental and stress-response models.
- Improves predictive confidence for advancing gene targets in plant biotechnology pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated tissue-based systems for downstream molecular and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, quantitative spatial readouts for assay standardization.
- Enables rapid evaluation of multiple gene targets without the need for transgenic lines.
- Supports scalable screening by applying the protocol across diverse plant species and tissues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression data with disease-relevant or stress-response phenotypes in plants.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by confirming endogenous gene activity.
- Reduces risk of false positives by distinguishing specific from background signals in tissue context.
- Supports biomarker identification for translational research in crop improvement and trait development.
Pipeline & Workflow Integration
In situ hybridization fits between early discovery and preclinical validation, bridging high-throughput transcriptomics with spatially resolved expression analysis.
- Discovery Biology: Confirms gene expression hypotheses and clarifies pathway localization in plant tissues.
- Screening: Provides robust, reproducible spatial data to inform downstream functional assays.
- Analytics: Generates quantitative and qualitative readouts for comparing gene expression across conditions and genotypes.
- Translational Research: Links molecular findings to phenotypic outcomes in relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across plant species and gene targets, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes spatial gene expression analysis with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated tissue-specific expression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of gene targets and traits in plant biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue embedding, sectioning, and probe design for optimal results.
- Needs access to microtomy, hybridization, and colorimetric detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable but may require optimization for different plant species or tissue types.
- Signal specificity and background minimization are critical for reliable interpretation.
