In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Het algemene doel van het volgende experiment is om mRNA-expressiepatronen op cellulair niveau te visualiseren met een hoge sensitiviteit en specificiteit. Dit wordt bereikt door eerst gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselcoupes door een reeks oplossingen te leiden om de was te verwijderen, de weefsels te permeabiliseren en positief geladen aminogroepen in de weefsels te blokkeren die een achtergrondsignaal kunnen veroorzaken. Vervolgens wordt een DIG-gelabelde RNA-probe, specifiek voor het gen van belang, in de weefselcoupes geïnfiltreerd en worden de slides gedurende de nacht gehybridiseerd.

Vervolgens worden de coupes behandeld met RNAse A om niet-specifiek gebonden probes uit de secties te verwijderen en daarna geïncubeerd met anti-DIG-antilichamen. Dit maakt de visualisatie van de gehybridiseerde probe mogelijk via een colorimetrische chemische reactie.

De resultaten tonen een donkerblauw signaal aan dat met lichtmicroscopie detecteerbaar is, specifiek in die cellen binnen het weefsel waarin het gen van belang tot expressie komt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze andere expressieanalyses, zoals R-T-P-C-R, microarray of Next Generation Sequencing-benaderingen, is dat het hier getoonde In Situ Hybridisatie-protocol het expressiepatroon van een gen van belang onthult in de context van het weefsel. Deze methoden omvatten veel stappen die het beste via visuele demonstraties kunnen worden aangeleerd.

We laten zien hoe we weefsels snijden en inbedden, evenals de belangrijkste stappen in het AI-hybridisatieprotocol die moeilijk zelf onder de knie te krijgen zijn. De methode voor het inbedden van met paraldehyde gefixeerde weefsels varieert afhankelijk van het type weefsel dat wordt geanalyseerd. Het belangrijkste punt hier is om ervoor te zorgen dat de monsters correct zijn georiënteerd voor het latere snijden.

Een methode voor het inbedden is het gebruik van plastic mallen en ringen. Om deze procedure te starten, worden de mallen opgewarmd op een warmteplaat van 60 °C, waarna gesmolten paraffine in de mallen wordt gegoten. Gebruik vervolgens verwarmde pincetten om een weefselmonster in elke mal over te brengen en positioneer dit in de gewenste oriëntatie.

Verplaats de mal voorzichtig van de plaat naar de werkbank en plaats de witte ring op de mal. Voeg extra mal en was toe. Laat de was geleidelijk afkoelen en uitharden voordat er coupes worden gemaakt.

Verwarm de blokken tot kamertemperatuur en trim vervolgens elk blok tot een trapezuimvorm, waarbij ongeveer één millimeter was rond het monster wordt gelaten. Plaats het getrimde blok op de microtoom zodanig dat de langere van de twee parallelle zijden aan de onderkant bevindt. Breng het blok voorzichtig naar het mes en zorg ervoor dat het oppervlak van het blok parallel loopt aan het vlak van het mes.

Met een dikte van acht tot 10 microns. Leg de waslinten uit op een anti-aanbak oppervlak, zoals aluminiumfolie, en selecteer de secties van belang onder een dissectiescoop. Markeer vervolgens de prob bon plus slides met een potlood.

Gebruik geen pennen voor markeringen, omdat deze gewist worden tijdens het INI twee hybridisatieprotocol. Verdeel één milliliter schoon milli Q-water over elke objectglas. Laat de relevante coupes voorzichtig drijven op het wateroppervlak bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat de glanzende zijde naar het water is gericht. Verplaats de slide langzaam naar een slide-warmer. Stel deze in op 35 tot 37 graden Celsius.

Dit temperatuurbereik voorkomt, in tegenstelling tot de gangbare 42 graden Celsius, de vorming van luchtbellen onder de coupes. Giet na vijf minuten het water voorzichtig maar in één vloeiende beweging af, zodat het lint op de objectglas wordt neergelaten. Laat de objectglazen ten minste enkele uren of overnacht drogen bij 37 graden Celsius, zodat het weefsel hecht om weefselcoupes voor te bereiden.

Voor in situ hybridisatie worden ze eerst gedeparaffiniseerd en gehydrateerd voor de afronding van de deparaffinisering. Incubeer de coupes in twee opeenvolgende baden met histic clear-oplossing gedurende elk 10 minuten. Om de weefselcoupes te rehydreren, worden de coupes door een reeks afnemende concentraties ethanol gehaald voor elk 30 seconden.

Tijdens de proteasebehandeling, die niet in deze video wordt getoond, bereidt u een glazen schaal met 0,1 molaire triathlonamine-oplossing voor en plaatst u deze op een roerplaat in een zuurkast. Voeg vlak voordat u het metalen objectglashouderrek in de oplossing plaatst 1,25 milliliter azijnzuumhydride toe aan het triathlonamine, de buffer en het roersysteem. Daarnaast stelt u het klem- en statiefsysteem in voor het vasthouden van het glashouderrek.

Verminder de snelheid van de roerder, klem het objectglaskader aan het statief en laat het kader in de oplossing zakken, waarbij het boven de magneetroerstaaf wordt gehouden. Blijf langzaam roeren gedurende 10 minuten nadat de coupes zijn gespoeld in PBS en opnieuw zijn gedehydrateerd via een ethanolserie. De weefselcoupes zijn nu klaar voor hybridisatie.

Plaats de objectglazen op een schoon oppervlak en laat ze vijf tot 10 minuten volledig aan de lucht drogen. Bereid het mengsel van de hybridisatiebuffer voor de probe voor door de gedenatureerde probe toe te voegen aan 80 µL hybridisatiebuffer. Meng dit voor elk objectglas goed door te pipetteren, waarbij luchtbellen worden vermeden.

Pipetteer de probe-hybridisatiebuffer. Meng dit op de rechterrand van de objectglas. Laat voorzichtig een dekglas op het objectglas zakken, waarbij u ervoor zorgt dat de hybridisatieoplossing alle secties bedekt zonder luchtbellen.

Tik voorzichtig met uw vinger op het dekglas waar luchtbellen ontstaan om deze uit alle weefselcoupes te verdrijven. Trek het dekglas niet los, aangezien dit de coupes kan beschadigen. Plaats de coupes in een bevochtigingskamer met watmanpapier dat is bevochtigd met UE-water en grotendeels is bedekt met parafilm.

Sluit de doos stevig af en incubeer de coupes op de gewenste hybridisatietemperatuur, gewoonlijk 50 tot 55 graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. Verwijder na voltooiing van het hybridisatieprotocol voorzichtig de dekglasjes van de coupes. Het dekglasje kan simpelweg afvallen wanneer de coupe rechtop wordt geplaatst, maar als dat niet gebeurt, mag u het dekglasje niet lostrekken, omdat dit de secties zal beschadigen.

Dompel de slide in plaats daarvan één of twee minuten onder in warme 0,2× SSC om het dekglas af te wassen. Nadat de dekglasjes zijn verwijderd, plaatst u de slides in een rek en wast u deze meerdere keren met 0,2× SSC bij 55 °C. Na een RNAse-behandeling brengt u de slides vanuit het rek over naar de bodem van een platte plastic bak en bedekt u deze met een minimaal volume blokkeeroplossing. Blokkeer de slides gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op een langzaam schuddend platform.

Breng vervolgens een minimaal volume antilichamenoplossing direct aan op elke slide. Incubeer de slides gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur in het donker. Wanneer de incubatie is voltooid, worden de slides overgebracht naar een schone, platte doos en vier keer gewassen met een minimaal volume wasbuffer op een schudplatform bij kamertemperatuur.

Spoel de objectglazen één keer met TBS en twee keer met TN-buffer voordat de vers bereide kleuringsoplossing op de objectglazen wordt aangebracht. Giet eerst de kleuringsoplossing in een klein plastic weegschaaltje. Plaats vervolgens twee objectglazen tegen elkaar aan, zodanig dat de coupes naar elkaar toe zijn gericht.

Dompel de sandwich in de oplossing en laat de capillaire werking de oplossing opzuigen. Laat de slides uitlekken op een Kimwipe. Vul de slides met kleuringsoplossing.

Teken opnieuw dat de slides mogelijk moeten worden aangetikt terwijl de oplossing instroomt om bubbels te voorkomen; plaats de slides in een plastic doos en bewaar deze bij kamertemperatuur in het donker. Hier worden representatieve resultaten getoond die zijn behaald met verschillende probes en arabidopsis-weefsels. Het paarse signaal biedt een directe visualisatie op cellulaire resolutie van het expressiepatroon van het gen van belang.

Paneel A toont de lokalisatie van shoot Meli one-transcripten in de vegetatieve scheutapex. Let op de aanwezigheid van een paarsblauw signaal in het onbepaalde deel van het meristeem en het gebrek aan signaal in de omliggende bladeren. Panelen B tot en met D zijn doorsneden van arabidopsis-embryo's in het torpedo-stadium, waarbij B de expressie van covata drie toont in de weinige embryonale stamcellen.

C toont een expressie van T ML one in de epidermale laag, en D toont het gebrek aan signaal in secties die zijn onderzocht met een willekeurige negatieve controle-RNA. De volgende afbeeldingen tonen resultaten verkregen met verschillende probes op maïsweefsels. Paneel E toont de lokalisatie van de STM Humalog knotted one in de ontwikkelende maïs embryo.

Let op dat het sterke signaal specifiek in de embryonale messtengel en de longitudinale doorsneden van de wortel door de apex van de vegetatieve scheut aantoont dat ARF three A tot expressie komt aan het axiale onderste bladoppervlak in paneel F en dat de ATML one homolog OCL four specifiek tot expressie komt in de epidermis in paneel G. Zoals verwacht werd er geen hybridisatiesignaal waargenomen voor de negatieve controleprobe in paneel H. De verwachte resultaten van de verschillende controlepunten tijdens de in vitro transcriptie van probes worden hier getoond. De in situ hybridisatieprobes worden gecontroleerd op een standaard agarosegel na in vitro transcriptie, na DNAse-behandeling en daaropvolgende zuivering van de in vitro transcriptiereactie, en na carbonaathydrolyse wanneer ze gereed zijn voor gebruik voor probes met een lengte van meer dan 250 basenparen, zoals probe 1; de carbonaathydrolyse zal in dat geval een reeks kleinere probefragmenten opleveren.

Deze figuur toont de resultaten van de kleur- en metriekkwalificatie van probes via dot blot-analyse. Verdunningen variërend van 10⁻¹ tot 10⁻⁵ van een controleprobe van 100 ng/µL en van drie nieuw gelabelde DIG-gelabelde probes zijn gespot op een transfermembraan dat is geïncubeerd met anti-DIG-antilichamen en assay. De analyse suggereert een geschatte concentratie van 100 ng/µL voor probe twee, 10 ng/µL voor probe drie en 1 ng/µL voor probe four, wat aangeeft dat probe four waarschijnlijk geen goed in situ hybridisatiesignaal zal opleveren. Tot slot bieden deze longitudinale doorsneden door de vegetatieve scheutapex van Mais een vergelijking tussen een aspecifiek achtergrondsignaal en een goed functionerend probepanel.

A toont een aspecifiek achtergrondsignaal, terwijl paneel B een specifiek in situ twee-hybridisatiesignaal voor de OC vijf-sonde in de buitenste cellaag laat zien. Na het bekijken hiervan zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u veel van de lastige stappen in de initiële hybridisatieprotocollen uitvoert, zodat u de precieze ruimtelijke en temporele expressiepatronen van uw favoriete genen kunt bepalen.