Name: In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Leer in situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van mRNA in plantenweefsels met hoge gevoeligheid. Deze methode maakt visualisatie van genexpressie op cellulair niveau mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in het laboratorium van MT wordt ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (DBI-0820610 en de IOS-1022102) en de NY Department of Health (NYSTEM-C024308). CM postdoctorale beurzen ontvangen van het Spaanse Ministerie van Onderwijs en Wetenschappen (2007-0937) en de Stichting Rafael del Pino, Spanje.

<ol><li>Rensink, W. A., Buell, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+expression+profiling+resources+for+plant+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant.+Sci%22%5BJournal%5D)">Microarray expression profiling resources for plant genomics.</a> Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).</li>
<li>Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).</li>
<li>Galbraith, D. W., Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+studies+of+cell+type-specific+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Global studies of cell type-specific gene expression in plants.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).</li>
<li>Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+analysis+of+the+shoot+apical+meristem+of+maize+%28Zea+mays+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.).</a> Plant. J. 52, 391-404 (2007).</li>
<li>Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-mediated+repression+of+rolled+leaf1+specifies+maize+leaf+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity.</a> Nature. 428, 84-88 (2004).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
<li>Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+meristem+maintenance+is+controlled+by+a+GRAS-gene+mediated+signal+from+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells.</a> Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).</li>
<li>Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+domain+of+PHANTASTICA+determines+leaflet+placement+in+compound+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves.</a> Nature. 424, 438-443 (2003).</li>
<li>Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaboration+of+B+gene+function+to+include+the+identity+of+novel+floral+organs+in+the+lower+eudicot+Aquilegia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia.</a> Plant Cell. 19, 750-766 (2007).</li>
<li>Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+compound+inflorescence+in+tomato+and+related+nightshades%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades.</a> PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).</li>
<li>Kidner, C., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+as+a+tool+to+study+the+role+of+microRNAs+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development.</a> Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).</li>
<li>Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+labeling+of+KNOTTED1+mRNA+and+protein+reveals+multiple+potential+sites+of+protein+trafficking+in+the+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot.</a> 129, 1423-1429 (2002).</li>
<li>Jensen, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJensen%2C+WA+%22Botanical+Histochemistry%22">Botanical Histochemistry</a>. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Pathology%3A+A+Practical+Approach%22">Molecular Plant Pathology: A Practical Approach</a>. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).</li>
<li>Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+via+small+RNA+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation via small RNA mobility.</a> Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).</li>
<li>Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+procedure+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+mouse+embryos+and+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies.</a> Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+phyllotaxy+in+maize+by+the+abphyl1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene.</a> Development. , 126-315 (1999).</li>
<li>Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+SBP-box+transcription+factor+encoded+by+tasselsheath4+regulates+bract+development+and+the+establishment+of+meristem+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries.</a> Development. 137, 1243-1250 (2010).</li>
<li>Long, J. A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li>
<li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De in situ hybridisatie methode hier beschreven staat de directe visualisatie van de spatiotemporele expressiepatroon van een gen van belang met grote cellulaire resolutie, hoge gevoeligheid en specificiteit. Het protocol staat niet toe dat een kwantitatieve vergelijking van expressie niveaus tussen genen. Echter, de methode de hoge gevoeligheid en resolutie onthullen gradiënten van de genexpressie binnen een weefsel 8, 18, ​​wat niet mogelijk is met de meeste andere methoden voor de analyse van genexpressie. Het protocol bevat een groot aantal stappen, die kan maken trouble shooting problematisch. De meest kritische stappen van het protocol zijn de fixatie van het weefsel en de selectie en de etikettering van de sonde. Slecht geïnfiltreerd weefsels en sondes met een lage DIG oprichting levert zeer zwakke signalen die misschien moeilijk te detecteren boven de achtergrond. Voor elke nieuwe gen van belang, is het raadzaam om te proberen een paar verschillende probes afgeleid van diffehuur regio&#39;s van het transcript. Af en toe kunnen twee of drie probes gericht is op verschillende kleinere regio van het gen moeten worden gecombineerd om een ​​sterke en specifieke hybridisatie-signaal te krijgen. Daarnaast, de hybridisatie omstandigheden, zoals de temperatuur en samenstelling van de hybridisatie buffer, geoptimaliseerd kan worden voor elk gen of weefsel te verlagen of te verhogen de hybridisatie strengheid. Ook de protease behandeling stap is een variabel en kan worden veranderd om het protocol aan te passen voor verschillende plantensoorten of voor het opsporen van de transcripten met een zeer lage abundantie heeft. De opname van zowel positieve als negatieve controle probes zal nuttig zijn bij het identificeren van problematische punten van het protocol. De procedure is geoptimaliseerd voor paraffine-ingebedde weefselcoupes plant, maar met kleine aanpassingen kan ook gebruikt worden voor hele-mount in situ hybridisatie. Hoewel het veel gebruikt in onderzoek op dieren 19, ganse berg in situ hybridisatie worden limited te planten weefsels die gemakkelijk kan worden geïnfiltreerd, zoals embryo&#39;s, wortels of jong meristematisch weefsels 20,21. Het protocol kan ook eenvoudig worden aangepast om tegelijkertijd te detecteren twee verschillende mRNA&#39;s of lokaliseren transcripten naast eiwitten 15,22,23. Tot slot is het mogelijk om de toepassing van deze methode uit te breiden tot het visualiseren van kleine RNA-expressie patronen in planten. miRNA expressie patronen zijn bepaald met behulp van dit protocol in zowel maïs en Arabidopsis 8,14. Meer recent hebben de in vitro getranscribeerde sondes is vervangen door commercieel beschikbare DIG-gelabelde geblokkeerd nucleïnezuur (LNA) oligo probes die verhoging van het signaal gevoeligheid van 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Product </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Opmerkingen </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4oz </td><td> Visser </td><td> 23-244-256 </td><td> Op basis van tolueen 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Visser </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Path Paraplast Plus </td><td> Visser </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + nylon membraan Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase uit; 40 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase; een U / pl </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-gelabelde RNA-controle </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA etikettering mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA-polymerase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA polymerase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA-polymerase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> oplossen in glycerol 50% Tris 100mm pH8.0 </td></tr><tr><td> Het blokkeren van Reagens </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Warmen tot 70 ° C in TBS-buffer </td></tr><tr><td> Anti-Digoxygenin-AP, Fab-fragmenten van schapen 150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP stockoplossing </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> mini-Quick Spin RNA Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA van E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Gedeïoniseerd formamide </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Protease Streptomyces griseus van Type XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Verdunnen in milliQ water en pre-verteren 4 uur bij 37 ° C </td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Verdunnen met water, breng aan pH8.0 met HCl </td></tr><tr><td> Azijnzuuranhydride </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfaat natriumzout van Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Dextransulfaat moet worden verwarmd tot 80 ° C op te lossen. </td></tr><tr><td> Denhardt&#39;s Solution 50x Concentrate </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine van runderen serum - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosine Y dinatriumzout </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Los op in 96 tot 100% ethanol tot verzadiging </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol absolute 200 proof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fenol / chloroform </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base mallen </td><td> Elektronische Microsocpy Wetenschap </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Inbedding ringen </td><td> Visser </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml wegwerp scintillatieflesjes, met dop </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Probe-on-plus dia&#39;s </td><td> Visser </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Micro dekglaasjes 24x50 mm </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman papier 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Drie glazen schalen en een stainless stalen schuif rek </td><td> Elektronische Microsocpy Wetenschap </td><td> 71420-25 </td><td> Twee glazen opgedist nodig zijn voor histoclear behandeling en de laatste wordt gebruikt voor de behandeling van azijnzuuranhydride </td></tr><tr><td> 18 schone plastic containers </td><td> Elektronische Microsocpy Wetenschap </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 of 3 grote platte plastic dozen met afsluitbare deksels </td><td></td><td></td><td> nodig zijn voor de hybridisatie en antilichaam stappen </td></tr><tr><td> Fijne penselen </td><td></td><td></td><td> Help inleveren wax linten </td></tr><tr><td> Microtoom </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Self-cleaning droog vacuümsysteem </td><td> Bedriegen </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Slide warmer </td><td> Visser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Verwarmingsblok </td><td></td><td></td><td> nodig zijn bij 60 ° C en 85 ° C</td></tr><tr><td> Incubator bij 58-60 ° C </td><td> Visser </td><td></td><td> Voor stappen met gesmolten Paraplast </td></tr><tr><td> Ovens of waterbaden voor de 55 ° C en 37 ° C </td><td> Visser </td><td></td><td> Moeten twee als gevolg van de snelle wisselen tussen temperaturen </td></tr><tr><td> Centrifuge (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zuurkast </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Met de vooruitgang in het genomics-onderzoek van de afgelopen tien jaar heeft plantenbiologie gezien tal van studies presenteren van grootschalige kwantitatieve analyse van genexpressie. Microarray en de volgende generatie sequencing methoden worden gebruikt om de ontwikkeling, fysiologie en stress respons processen te onderzoeken, epigenetische en kleine RNA paden ontleden, en grote gen regulerende netwerken 1-3 te bouwen. Hoewel deze technieken te vergemakkelijken de gelijktijdige analyse van grote genen sets, ze geven doorgaans een zeer beperkte tijd-ruimtelijke resolutie van genexpressie veranderingen. Deze beperking kan gedeeltelijk worden ondervangen door met behulp van profiling methode in combinatie met lasermicrodissection of fluorescentie-geactiveerde cel sortering 4-7. Echter, volledig te begrijpen van de biologische rol van een gen, kennis van de spatio-temporele patroon van meningsuiting in een cellulair resolutie is essentieel. In het bijzonder, bij het bestuderen van de ontwikkeling of de effecten van milieu-stiMuli en mutanten kunnen de gedetailleerde analyse van expressie van een gen patroon van essentieel geworden. Zo kan subtiele kwantitatieve verschillen in de expressie niveaus van de belangrijkste regulerende genen leiden tot een dramatische fenotypes bij worden geassocieerd met het verlies of de winst van meningsuiting in specifieke celtypen. Verschillende methoden worden routinematig gebruikt voor het gedetailleerde onderzoek van genexpressie patronen. Een is via de analyse van transgene reporter lijnen. Een dergelijke analyse kan echter worden tijdrovende bij het analyseren van meerdere genen of werken in planten recalcitrant tot transformatie. Bovendien is een onafhankelijke validatie om ervoor te zorgen dat de transgenexpressie patroon dat van het endogene gen nabootst typisch vereist. Immunohistochemische eiwit lokalisatie of mRNA in situ hybridisatie heden relatief snel alternatieven voor de directe visualisatie van genexpressie in cellen en weefsels. De laatste heeft de duidelijke voordeel dat het gemakkelijk kan worden used op elk gen van belang. In situ hybridisatie kan de aanwezigheid van doelwit mRNA&#39;s in cellen door hybridisatie met een gelabelde anti-sense RNA probe verkregen door in vitro transcriptie van het gen van interesse. Hier schetsen we een protocol voor de in situ lokalisatie van gen-expressie in planten, dat is zeer gevoelig en specifiek. Het is geoptimaliseerd voor gebruik met paraformaldehyde vaste, paraffine ingebedde coupes, die een uitstekende conservering van histologie geven, en DIG-gelabelde probes die worden gevisualiseerd door immuno-detectie en alkalische fosfatase-colorimetrische reactie. Dit protocol is met succes toegepast op een aantal weefsels uit een breed scala aan plantensoorten, en kan gebruikt worden om de expressie van mRNA&#39;s en kleine RNA&#39;s 8-14 te analyseren.

De<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie protocol hier beschreven maakt een directe lokalisatie van mRNA en kleine RNA-expressie op het cellulaire niveau met een hoge gevoeligheid en specificiteit. De procedure is geoptimaliseerd voor paraffine-ingebedde weefselcoupes plant, is van toepassing op een breed scala aan planten en weefsels, en kan worden voltooid binnen de tien dagen.

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Met de vorderingen in het genomica-onderzoek van het afgelopen decennium heeft de plantbiologie talloze studies gezien die grootschalige kwantitatieve analyses van genen presenteren ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om mRNA-expressiepatronen op cellulair niveau te visualiseren met een hoge sensitiviteit en specificiteit. Dit wordt bereikt door eerst gefixeerde en in paraffine ingebedde weefselcoupes door een reeks oplossingen te leiden om de was te verwijderen, de weefsels te permeabiliseren en positief geladen aminogroepen in de weefsels te blokkeren die een achtergrondsignaal kunnen veroorzaken. Vervolgens wordt een DIG-gelabelde RNA-probe, specifiek voor het gen van belang, in de weefselcoupes geïnfiltreerd en worden de slides gedurende de nacht gehybridiseerd.Vervolgens worden de coupes behandeld met RNAse A om niet-specifiek gebonden probes uit de secties te verwijderen en daarna geïncubeerd met anti-DIG-antilichamen. Dit maakt de visualisatie van de gehybridiseerde probe mogelijk via een colorimetrische chemische reactie.De resultaten tonen een donkerblauw signaal aan dat met lichtmicroscopie detecteerbaar is, specifiek in die cellen binnen het weefsel waarin het gen van belang tot expressie komt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze andere expressieanalyses, zoals R-T-P-C-R, microarray of Next Generation Sequencing-benaderingen, is dat het hier getoonde In Situ Hybridisatie-protocol het expressiepatroon van een gen van belang onthult in de context van het weefsel. Deze methoden omvatten veel stappen die het beste via visuele demonstraties kunnen worden aangeleerd.We laten zien hoe we weefsels snijden en inbedden, evenals de belangrijkste stappen in het AI-hybridisatieprotocol die moeilijk zelf onder de knie te krijgen zijn. De methode voor het inbedden van met paraldehyde gefixeerde weefsels varieert afhankelijk van het type weefsel dat wordt geanalyseerd. Het belangrijkste punt hier is om ervoor te zorgen dat de monsters correct zijn georiënteerd voor het latere snijden.Een methode voor het inbedden is het gebruik van plastic mallen en ringen. Om deze procedure te starten, worden de mallen opgewarmd op een warmteplaat van 60 °C, waarna gesmolten paraffine in de mallen wordt gegoten. Gebruik vervolgens verwarmde pincetten om een weefselmonster in elke mal over te brengen en positioneer dit in de gewenste oriëntatie.Verplaats de mal voorzichtig van de plaat naar de werkbank en plaats de witte ring op de mal. Voeg extra mal en was toe. Laat de was geleidelijk afkoelen en uitharden voordat er coupes worden gemaakt.Verwarm de blokken tot kamertemperatuur en trim vervolgens elk blok tot een trapezuimvorm, waarbij ongeveer één millimeter was rond het monster wordt gelaten. Plaats het getrimde blok op de microtoom zodanig dat de langere van de twee parallelle zijden aan de onderkant bevindt. Breng het blok voorzichtig naar het mes en zorg ervoor dat het oppervlak van het blok parallel loopt aan het vlak van het mes.Met een dikte van acht tot 10 microns. Leg de waslinten uit op een anti-aanbak oppervlak, zoals aluminiumfolie, en selecteer de secties van belang onder een dissectiescoop. Markeer vervolgens de prob bon plus slides met een potlood.Gebruik geen pennen voor markeringen, omdat deze gewist worden tijdens het INI twee hybridisatieprotocol. Verdeel één milliliter schoon milli Q-water over elke objectglas. Laat de relevante coupes voorzichtig drijven op het wateroppervlak bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de glanzende zijde naar het water is gericht. Verplaats de slide langzaam naar een slide-warmer. Stel deze in op 35 tot 37 graden Celsius.Dit temperatuurbereik voorkomt, in tegenstelling tot de gangbare 42 graden Celsius, de vorming van luchtbellen onder de coupes. Giet na vijf minuten het water voorzichtig maar in één vloeiende beweging af, zodat het lint op de objectglas wordt neergelaten. Laat de objectglazen ten minste enkele uren of overnacht drogen bij 37 graden Celsius, zodat het weefsel hecht om weefselcoupes voor te bereiden.Voor in situ hybridisatie worden ze eerst gedeparaffiniseerd en gehydrateerd voor de afronding van de deparaffinisering. Incubeer de coupes in twee opeenvolgende baden met histic clear-oplossing gedurende elk 10 minuten. Om de weefselcoupes te rehydreren, worden de coupes door een reeks afnemende concentraties ethanol gehaald voor elk 30 seconden.Tijdens de proteasebehandeling, die niet in deze video wordt getoond, bereidt u een glazen schaal met 0,1 molaire triathlonamine-oplossing voor en plaatst u deze op een roerplaat in een zuurkast. Voeg vlak voordat u het metalen objectglashouderrek in de oplossing plaatst 1,25 milliliter azijnzuumhydride toe aan het triathlonamine, de buffer en het roersysteem. Daarnaast stelt u het klem- en statiefsysteem in voor het vasthouden van het glashouderrek.Verminder de snelheid van de roerder, klem het objectglaskader aan het statief en laat het kader in de oplossing zakken, waarbij het boven de magneetroerstaaf wordt gehouden. Blijf langzaam roeren gedurende 10 minuten nadat de coupes zijn gespoeld in PBS en opnieuw zijn gedehydrateerd via een ethanolserie. De weefselcoupes zijn nu klaar voor hybridisatie.Plaats de objectglazen op een schoon oppervlak en laat ze vijf tot 10 minuten volledig aan de lucht drogen. Bereid het mengsel van de hybridisatiebuffer voor de probe voor door de gedenatureerde probe toe te voegen aan 80 µL hybridisatiebuffer. Meng dit voor elk objectglas goed door te pipetteren, waarbij luchtbellen worden vermeden.Pipetteer de probe-hybridisatiebuffer. Meng dit op de rechterrand van de objectglas. Laat voorzichtig een dekglas op het objectglas zakken, waarbij u ervoor zorgt dat de hybridisatieoplossing alle secties bedekt zonder luchtbellen.Tik voorzichtig met uw vinger op het dekglas waar luchtbellen ontstaan om deze uit alle weefselcoupes te verdrijven. Trek het dekglas niet los, aangezien dit de coupes kan beschadigen. Plaats de coupes in een bevochtigingskamer met watmanpapier dat is bevochtigd met UE-water en grotendeels is bedekt met parafilm.Sluit de doos stevig af en incubeer de coupes op de gewenste hybridisatietemperatuur, gewoonlijk 50 tot 55 graden Celsius gedurende 16 tot 20 uur. Verwijder na voltooiing van het hybridisatieprotocol voorzichtig de dekglasjes van de coupes. Het dekglasje kan simpelweg afvallen wanneer de coupe rechtop wordt geplaatst, maar als dat niet gebeurt, mag u het dekglasje niet lostrekken, omdat dit de secties zal beschadigen.Dompel de slide in plaats daarvan één of twee minuten onder in warme 0,2× SSC om het dekglas af te wassen. Nadat de dekglasjes zijn verwijderd, plaatst u de slides in een rek en wast u deze meerdere keren met 0,2× SSC bij 55 °C. Na een RNAse-behandeling brengt u de slides vanuit het rek over naar de bodem van een platte plastic bak en bedekt u deze met een minimaal volume blokkeeroplossing. Blokkeer de slides gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op een langzaam schuddend platform.Breng vervolgens een minimaal volume antilichamenoplossing direct aan op elke slide. Incubeer de slides gedurende twee tot drie uur bij kamertemperatuur in het donker. Wanneer de incubatie is voltooid, worden de slides overgebracht naar een schone, platte doos en vier keer gewassen met een minimaal volume wasbuffer op een schudplatform bij kamertemperatuur.Spoel de objectglazen één keer met TBS en twee keer met TN-buffer voordat de vers bereide kleuringsoplossing op de objectglazen wordt aangebracht. Giet eerst de kleuringsoplossing in een klein plastic weegschaaltje. Plaats vervolgens twee objectglazen tegen elkaar aan, zodanig dat de coupes naar elkaar toe zijn gericht.Dompel de sandwich in de oplossing en laat de capillaire werking de oplossing opzuigen. Laat de slides uitlekken op een Kimwipe. Vul de slides met kleuringsoplossing.Teken opnieuw dat de slides mogelijk moeten worden aangetikt terwijl de oplossing instroomt om bubbels te voorkomen; plaats de slides in een plastic doos en bewaar deze bij kamertemperatuur in het donker. Hier worden representatieve resultaten getoond die zijn behaald met verschillende probes en arabidopsis-weefsels. Het paarse signaal biedt een directe visualisatie op cellulaire resolutie van het expressiepatroon van het gen van belang.Paneel A toont de lokalisatie van shoot Meli one-transcripten in de vegetatieve scheutapex. Let op de aanwezigheid van een paarsblauw signaal in het onbepaalde deel van het meristeem en het gebrek aan signaal in de omliggende bladeren. Panelen B tot en met D zijn doorsneden van arabidopsis-embryo's in het torpedo-stadium, waarbij B de expressie van covata drie toont in de weinige embryonale stamcellen.C toont een expressie van T ML one in de epidermale laag, en D toont het gebrek aan signaal in secties die zijn onderzocht met een willekeurige negatieve controle-RNA. De volgende afbeeldingen tonen resultaten verkregen met verschillende probes op maïsweefsels. Paneel E toont de lokalisatie van de STM Humalog knotted one in de ontwikkelende maïs embryo.Let op dat het sterke signaal specifiek in de embryonale messtengel en de longitudinale doorsneden van de wortel door de apex van de vegetatieve scheut aantoont dat ARF three A tot expressie komt aan het axiale onderste bladoppervlak in paneel F en dat de ATML one homolog OCL four specifiek tot expressie komt in de epidermis in paneel G. Zoals verwacht werd er geen hybridisatiesignaal waargenomen voor de negatieve controleprobe in paneel H. De verwachte resultaten van de verschillende controlepunten tijdens de in vitro transcriptie van probes worden hier getoond. De in situ hybridisatieprobes worden gecontroleerd op een standaard agarosegel na in vitro transcriptie, na DNAse-behandeling en daaropvolgende zuivering van de in vitro transcriptiereactie, en na carbonaathydrolyse wanneer ze gereed zijn voor gebruik voor probes met een lengte van meer dan 250 basenparen, zoals probe 1; de carbonaathydrolyse zal in dat geval een reeks kleinere probefragmenten opleveren.Deze figuur toont de resultaten van de kleur- en metriekkwalificatie van probes via dot blot-analyse. Verdunningen variërend van 10⁻¹ tot 10⁻⁵ van een controleprobe van 100 ng/µL en van drie nieuw gelabelde DIG-gelabelde probes zijn gespot op een transfermembraan dat is geïncubeerd met anti-DIG-antilichamen en assay. De analyse suggereert een geschatte concentratie van 100 ng/µL voor probe twee, 10 ng/µL voor probe drie en 1 ng/µL voor probe four, wat aangeeft dat probe four waarschijnlijk geen goed in situ hybridisatiesignaal zal opleveren. Tot slot bieden deze longitudinale doorsneden door de vegetatieve scheutapex van Mais een vergelijking tussen een aspecifiek achtergrondsignaal en een goed functionerend probepanel.A toont een aspecifiek achtergrondsignaal, terwijl paneel B een specifiek in situ twee-hybridisatiesignaal voor de OC vijf-sonde in de buitenste cellaag laat zien. Na het bekijken hiervan zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u veel van de lastige stappen in de initiële hybridisatieprotocollen uitvoert, zodat u de precieze ruimtelijke en temporele expressiepatronen van uw favoriete genen kunt bepalen.

in-situ-hybridization-for-precise-localization-transcripts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

Dit protocol wordt met succes gebruikt om kwantitatief te detecteren niveaus en ruimtelijke patronen van mRNA-expressie in verschillende weefsels vormen over gewervelde soorten. De methode kan detecteren lage abundantie transcripties en maakt het verwerken van honderden dia's tegelijk. We presenteren dit protocol met behulp van expressie profilering van aviaire embryonale hersenen formatie als voorbeeld.

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige Hybrid-Cut methode voor weefselsecties die nuttig is voor moeilijk verwerkbare plantweefsels. Goede kwaliteit weefselsecties maken anatomische studies en andere biologische studies mogelijk, inclusief in situ hybridisatie (ISH).

Hybride-Cut: een verbeterde Sectioning Methode voor Recalcitrante plantenweefsel Samples

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Leer in situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van mRNA in plantenweefsels met hoge gevoeligheid. Deze methode maakt visualisatie van genexpressie op cellulair niveau mogelijk.

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Meer video's verkennen