Name: Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Leer TIRF-microscopie voor visualisatie van eiwitdynamiek aan het celcortex in bacteriën en gist. Deze methode biedt hoge contrastresolutie voor onderzoek naar membraanprocessen in microbiële celbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut.

<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

TIRF microscopie is de techniek bij uitstek om beeld perifere eiwitten. De lage penetratie diepte van de evanescente veld minimaliseert van onscherpe licht, wat leidt tot een zeer goede signaal-ruisverhouding en maakt het mogelijk data-acquisitie met een hoge frame rates, of beeldvorming van heel zwak tot expressie gebrachte eiwitten. De combinatie van hoog contrast en hoge frame rates maakt TIRF-microscopie een perfect hulpmiddel voor beeldvorming van spatio-temporele dynamiek van cortically gelokaliseerde eiwitten. In...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het gereedschap / reagens </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Gereedschap </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER </td></tr><tr><td> TIRF microscoop </td><td> Tot </td><td></td><td> Aangepaste installatie </td></tr><tr><td> Glazen container </td><td> Gereedschap </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> Keramische vlekken rack </td><td> Gereedschap </td><td> Thomas Sci. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavaline A </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Dekglaasjes # 1 (18 x 18 mm) </td><td> Microscoop </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> Microscoop Dia&#39;s </td><td> Microscoop </td><td> Menzel Glaser </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> Immersion Oil </td><td> Microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

visualisatie van cortex organisatie en dynamiek in micro-organismen, met behulp van total internal reflection fluorescence microscopy

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopie heeft zich ontpopt als een krachtig imaging technologie om spatio-temporele dynamiek van fluorescerende moleculen in vitro te bestuderen en in levende cellen 1. De optische verschijnsel van totale interne reflectie optreedt wanneer licht van een medium met hoge brekingsindex in een medium met lage brekingsindex een hoek groter dan een kenmerk grenshoek (bijvoorbeeld dichter bij parallel zijn met de grens). Hoewel al het licht wordt gereflecteerd terug onder zulke omstandigheden, is een vergankelijk golf gecreëerd die zich voortplant over en langs de grens, die exponentieel vervalt met de afstand, en alleen doordringt monster gebieden die 100-200 nm de buurt van de interface 2. Naast het leveren van een superieure axiale resolutie, de verminderde excitatie van onscherpe fluoroforen zorgt voor een zeer hoge signaal-ruis-ratio&#39;s en minimaliseert schadelijke effecten van fotobleken 2,3. Omdat het een groothoek techniek, TIRF maakt het ook mogelijk een snellere beeldverwerking acquisition dan de meeste op basis van het scannen van confocale setups. Op het eerste gezicht, de lage indringdiepte van TIRF niet compatibel is met beeldvorming van bacteriële en fungale cellen, die vaak zijn omgeven door een dikke celwanden. Integendeel, hebben we ontdekt dat de celwanden van gist en bacteriële cellen eigenlijk de bruikbaarheid van TIRF verbeteren en vergroten het bereik van waarneembare structuren 4-8. Veel cellulaire processen kan dus direct worden benaderd door TIRF in kleine, eencellige micro-organismen, die vaak bieden krachtige genetische manipulatie technieken. Dit stelt ons in staat om te presteren in vivo experimenten biochemie, waar kinetiek van eiwit interacties en activiteiten die direct kan worden beoordeeld in levende cellen. We beschrijven hier de individuele stappen die nodig zijn om hoge kwaliteit TIRF beelden te verkrijgen voor Saccharomyces cerevisiae of Bacillus subtilis cellen. Wij wijzen erop verschillende problemen die kunnen Affect TIRF visualisatie van fluorescerende probes in cellen en illustreren de procedure met een aantal toepassingsvoorbeelden. Tot slot laten we zien hoe TIRF beelden kunnen verder worden verbeterd met behulp van gevestigde beeld restauratietechnieken.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF-microscopie is ontstaan als een krachtige beeldvormingstechnologie om de spatio-temporele dynamiek van fluorescerende moleculen in vitro en in levende cellen te bestuderen1. ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van hoogwaardige beelden van celwandbevattende micro-organismen middels totale interne reflectie, fluorescentie of turf-beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst de dekglasjes en cellen voor te bereiden. De tweede stap bestaat uit het nauwkeurig uitlijnen van de microscoopopstelling voor een optimale beeldkwaliteit.Vervolgens worden de juiste incidentie, hoeken en beeldvormingscondities gekozen voor de acquisitie van beelden of films. De laatste stap is de post-imaging verwerking van de verkregen beelden. Uiteindelijk wordt turf-microscopie gebruikt om de dynamiek van eiwitlokalisatie bij de cellen-cortex te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele of confocale microscopie is dat het beeldcontrast bij deze microscopie zeer hoog is, wat snelle acquisitietijden en lage lichtintensiteiten mogelijk maakt. Deze methode kan zo helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar membranen, zoals de mechanismen van laterale eiwitsegregatie of de mobiliteit van membraaneiwitten. Dekglas voor TIRF-microscopie moet vóór gebruik worden gereinigd om stofdeeltjes te verwijderen.

visualization-cortex-organization-dynamics-microorganisms-using-total

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for visualizing exocytic events in cortical neurons. A pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) marker fluoresces upon vesicle fusion, with selective TIRF excitation capturing membrane-proximal exocytosis in time-lapse imaging.

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Visualization of Exocytic Events 

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.

Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Leer TIRF-microscopie voor visualisatie van eiwitdynamiek aan het celcortex in bacteriën en gist. Deze methode biedt hoge contrastresolutie voor onderzoek naar membraanprocessen in microbiële celbiologie.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Meer video's verkennen