Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
May 1st, 2012
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige, totale interne reflectie, fluorescentie of turf-beelden van celwanddragende micro-organismen te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst de dekglasjes en cellen voor te bereiden. De tweede stap is om de microscoopopstelling nauwkeurig uit te lijnen voor optimale beeldkwaliteit.
Vervolgens worden de juiste incidentiehoeken en beeldvormingsomstandigheden gekozen voor het verkrijgen van afbeeldingen of video's. De laatste stap is het post-beeldverwerking van de verkregen beelden. Uiteindelijk wordt turf-microscopie gebruikt om de dynamica van eiwitlokalisatie in de celcortex te bestuderen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van overschrijdende metalen zoals conventionele of confocale microscopie is dat de beeldcontrast in de microscopie erg hoog is, waardoor snelle tijden en laag licht mogelijk zijn. Als zodanig kan deze methode helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van membraanonderzoek, zoals de mechanismen van laterale eiwitsegregatie of de mobiliteit van membraaneiwitten. Dekglasjes voor turf-microscopie moeten worden schoongemaakt van stofdeeltjes voor gebruik.
Omdat turf gevoelig is voor achtergrondsignalen die ontstaan door stof op een vuile dekglas, is een schoongemaakt dekglas met minder achtergrond nodig om te beginnen met het schoonmaken van dekglasjes. Gebruik een pincet om dekglasjes in een keramische houder met een deksel te plaatsen.
Vervolgens vult u een glazen container met een molair natriumhydroxide. Dit natriumhydroxide kan meerdere keren worden hergebruikt. Plaats de keramische houder met de dekglasjes in het natriumhydroxide en incubeer de dekglasjes gedurende twee uur onder langzame continue rotatie.
Incubeer niet langer dan acht uur, omdat dit na twee uur ondoorzichtige dekglasjes zal creëren. Was de dekglasjes twee keer gedurende vijf minuten onder langzame continue rotatie met gedestilleerd water, bewaar de schoongemaakte dekglasjes in de keramische houder gedekt in 100% ethanol. Om bacillus subtilis cellen voor turf-microscopie voor te bereiden, verdunt u tot een OD 600 van 0,01 tot 0,05 in vijf milliliters van geschikte groeimedia en laat u groeien tot exponentiële fase. Bereid 1,25% aros in synthetisch medium, los aros poeder op in een 1,5 milliliter plastic buis bij 95 graden Celsius en bewaar in een verwarmingsblok bij 72 graden Celsius.
Voeg een kleine druppel aros toe aan het midden van een dia en drukt met een tweede dia de aros in een vlakke pad na minimaal twee minuten, scheid de dia's voorzichtig. Spuit 500 microliters van bacillus subtilis cellen in een microcentrifuge bij 12.000 RPM gedurende één minuut. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet in 50 microliters medium.
Voeg twee tot vier microliters cellen toe aan het midden van de aros-pad. Gebruik vervolgens een pincet om een schoongemaakt dekglas uit de met ethanol gevulde container te verwijderen en droog het met geperste lucht. Plaats het dekglas voorzichtig op het monster.
Laat de cellen minimaal twee minuten bezinken voorafgaand aan microscopie. Voor langdurige beeldvorming, verzegel de randen van het dekglas met de verwarmde mengsel van vaseline, lanoline en paraffine of Val app. Om Saccharomyces visi cellen voor turf-microscopie voor te bereiden, verdunt u een voorcultuur en groeit in geschikte media gedurende minimaal vijf uur.
Tot exponentiële fase, neem een dekglas uit de met ethanol gevulde container en droog het met geperste lucht met een pipetten verspreiding. Vijf microliters, conval en een of con a oplossing op de cover. Slip en droog met geperste lucht con A bindt aan koolhydraten van de gistcelwand en immobiliseert gistcellen.
Vervolgens brengt u 4,5 microliters van een schorsing van gistcellen over naar één zijde van de con, een gecoate dekglas. Plaats voorzichtig het dekglas met de monsterzijde naar beneden op een microscoopdia, beginnend met één rand en het laten druppelen. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen.
Laat cellen minimaal twee minuten bezinken voorafgaand aan microscopie verzegel randen van dekglas met val app voor langdurige beeldvorming. Alle experimenten getoond in deze video worden uitgevoerd op een aangepaste turf opstelling gebaseerd op een volledig geautomatiseerde IMEX stand met een Olympus 100 x 1.45 NA objectief. De gebruikte lichtbronnen zijn 75 milliwatt diode, gepompte vaste staat of DPSS lasers bij 488 nanometer en 561 nanometer.
Turf hoeken en fluorescentie. Herstel na fotobleken of frat positie kan onmiddellijk worden aangepast via twee galvanometers. Een derde galvanometer wordt gebruikt om te schakelen tussen epi, fluorescentie, frap en turf.
De galvanometers, die direct worden bestuurd vanuit de live acquisitie software, maken eenvoudige meting van lokalisatiekinetiek mogelijk voor objecten die in turf-beelden worden getraceerd. De beelden worden verzameld met een EM CCD camera en een twee x vergroting lens voor de camera. De acquisitie wordt ook bestuurd door de live acquisitie software. Voordat u met de laser gaat werken, trek laserveiligheidsbril aan, projecteer de laser op het plafond in turf-modus en kalibreer de nulgraadspositie zodanig dat de laser in een rechte lijn staat.
Met het objectief, focus de laserspot tot een minimale grootte na optimale aanpassing, de laserprofiel moet een goed gedefinieerde vlek met een ruwweg ronde vorm vormen. Voer calibratie uit voor elke sessie. Om optimale beeldkwaliteit te verkrijgen, is uitlijning van de turf-microscoop cruciaal voor het succes van deze procedure.
De correcte incidentie, hoeken en parameters voor beeldacquisitie moeten zorgvuldig worden aangepast voor optimale beeldkwaliteit. Om beeldacquisitie te starten, identificeert u de positie van cellen met behulp van lichtveldverlichting. Rode LED's zijn bijzonder goed omdat ze geen significante fotobeschadiging veroorzaken.
Schakel over naar laserverlichting en selecteer geschikte lasers en filtercombinaties om de fluoroforen van keuze te exciteren, zorg ervoor dat de turf-hoek subkritisch is. Anders worden signalen die afkomstig zijn van GFP-fusie-eiwitten niet gedetecteerd. Zoek het bovenste gedeelte van de cel
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie wordt gebruikt om structuren nabij het celoppervlak met hoge contrast en tijdelijke resolutie te observeren. Deze techniek is bijzonder effectief voor het bestuderen van eiwitdynamiek in door celwanden omsloten micro-organismen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microscopie
- Celbiologie
- Eiwitdynamiek
Achtergrond
- TIRF-microscopie maakt hoge resolutie beeldvorming van cellulaire structuren mogelijk.
- Het is vooral nuttig voor het observeren van de dynamiek van eiwitten in de celcortex.
- Deze techniek is toepasbaar op zowel bacteriële als schimmelcellen.
- Voorbereiding en uitlijning van de microscoop zijn cruciaal voor optimale beeldvorming.
Doel van het onderzoek
- Om hoge kwaliteit TIRF-beelden van celwanddragende micro-organismen te verkrijgen.
- Om de lokalisatie en dynamiek van eiwitten in de celcortex te bestuderen.
- Om de effectiviteit van TIRF-microscopie in biologisch onderzoek te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van dekglasjes en cellen voor beeldvorming.
- Precieze uitlijning van de microscoopopstelling.
- Selectie van geschikte incidentiehoeken en beeldvormingscondities.
- Post-beeldvorming verwerking van verworven beelden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verwerving van hoge kwaliteit TIRF-beelden.
- Observatie van eiwitlokalisatie dynamiek in de celcortex.
- Demonstratie van TIRF-microscopie's mogelijkheden in het bestuderen van micro-organismen.
- Inzichten in het gedrag van eiwitten in door celwanden omsloten cellen.
Conclusies
- TIRF-microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitdynamiek.
- Het biedt hoge resolutie inzichten in cellulaire processen.
- Deze techniek kan ons begrip van microbiële celbiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
TIRF microscopy enables high-contrast, real-time visualization of protein dynamics at the cell cortex in microorganisms, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By providing quantitative spatial and temporal data on membrane-associated processes, it enhances target validation and predictive confidence in antimicrobial and antifungal research. This capability is particularly valuable for studying cell wall synthesis, secretion systems, and signal transduction pathways in yeast and bacterial models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of protein localization and dynamics at the cell surface, clarifying mechanisms of membrane protein segregation and mobility.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of therapeutic targets involved in cell wall synthesis and membrane organization with high signal-to-noise ratio.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target function by visualizing cortical protein behavior in live cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts suitable for assessing compound effects on protein localization and dynamics.
- Operational Value: Enables reproducible, high-throughput compatible imaging of microbial cells due to rapid acquisition and low phototoxicity.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of standardized, wall-bearing microorganism samples for consistent imaging performance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by validating targets in disease-relevant microbial systems with genetic tractability.
- Operational Value: Supports longitudinal studies of protein dynamics critical for understanding resistance mechanisms and virulence.
- Translational Continuity: Enables correlation of molecular observations with phenotypic outcomes in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
TIRF microscopy fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for antimicrobial and antifungal programs where cortical protein dynamics are central to mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing protein dynamics at the cell membrane with minimal out-of-focus interference.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on protein localization and mobility, enabling reliable compound screening in microbial systems.
- Analytics: Provides kinetic and spatial measurements (e.g., FRAP, co-localization) that allow comparison of protein behavior across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects molecular dynamics to preclinical relevance by enabling study of targets in living, wall-containing microorganisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multiple projects studying membrane-associated targets in yeast and bacteria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in membrane protein function and localization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging with high signal-to-noise ratio and minimal photobleaching, supporting consistent data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct visual evidence of target engagement and mechanism in live cells.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial and antifungal candidates based on mechanistic de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, sample preparation, and laser safety protocols for working with microorganisms.
- Needs a TIRF-capable microscope with stable laser alignment, EM-CCD camera, and environmental control for long-term imaging.
- Demands standardization of cover slip cleaning, cell immobilization, and sealing procedures across teams to ensure reproducibility.
- Requires adaptation for different microbial systems (yeast vs. bacteria) due to variations in cell wall composition and size.
- Limited by shallow penetration depth (~100-200 nm), restricting use to cortical and surface-associated processes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Sample Preparation: Preparing Cover Slips
2:27
Sample Preparation: Preparing Bacillus subtilis Cells
3:58
Sample Preparation: Preparing Saccharomyces cerevisiae Cells
5:03
Image Acquisition
9:44
Results: Visualization of Cortex Organization and Dynamics
13:41
Conclusion
