Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van hoogwaardige beelden van celwandbevattende micro-organismen middels totale interne reflectie, fluorescentie of turf-beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst de dekglasjes en cellen voor te bereiden. De tweede stap bestaat uit het nauwkeurig uitlijnen van de microscoopopstelling voor een optimale beeldkwaliteit.

Vervolgens worden de juiste incidentie, hoeken en beeldvormingscondities gekozen voor de acquisitie van beelden of films. De laatste stap is de post-imaging verwerking van de verkregen beelden. Uiteindelijk wordt turf-microscopie gebruikt om de dynamiek van eiwitlokalisatie bij de cellen-cortex te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele of confocale microscopie is dat het beeldcontrast bij deze microscopie zeer hoog is, wat snelle acquisitietijden en lage lichtintensiteiten mogelijk maakt. Deze methode kan zo helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar membranen, zoals de mechanismen van laterale eiwitsegregatie of de mobiliteit van membraaneiwitten. Dekglas voor TIRF-microscopie moet vóór gebruik worden gereinigd om stofdeeltjes te verwijderen.

Aangezien turf gevoelig is voor achtergrondsignalen die ontstaan door stof op een vuil dekglas, is een gereinigd dekglas met minder achtergrond vereist om de procedure voor het reinigen van dekglazen te starten. Gebruik een pincet om de dekglazen in een keramische houder met een deksel te plaatsen.

Vul vervolgens een glazen container met één molair natriumhydroxide. Dit natriumhydroxide kan meerdere keren worden hergebruikt. Plaats de keramische houder met de dekglasjes in het natriumhydroxide en incubeer de dekglasjes gedurende twee uur onder langzame, continue rotatie.

Incubeer niet langer dan acht uur, omdat de dekglasjes na twee uur ondoorzichtig worden; was de dekglasjes twee keer gedurende vijf minuten met gedestilleerd water onder langzame continue rotatie en bewaar de gereinigde dekglasjes in de keramische houder bedekt met 100% ethanol. Om Bacillus subtilis-cellen voor turf-microscopie voor te bereiden, dient men deze te verdunnen tot een OD 600 van 0,01 tot 0,05 in vijf milliliter geschikt groeimedium en te kweken tot de exponentiële fase. Bereid 1,25% agar in synthetisch medium door agarpoeder op te lossen in een plastic buisje van 1,5 milliliter bij 95 °C, en bewaar dit vervolgens in een heating block bij 72 °C.

Voeg een kleine druppel aros toe aan het midden van een objectglas en druk met een tweede objectglas de aros na minimaal twee minuten plat, waarna de glazen voorzichtig van elkaar worden gescheiden. Centrifugeer 500 microliters Bacillus subtilis-cellen in een microcentrifuge bij 12.000 RPM gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 50 microliters medium.

Voeg twee tot vier µL cellen toe aan het midden van het aros-pad. Gebruik vervolgens een pincet om een schoongemaakt dekglas uit de met ethanol gevulde container te halen en droog dit met perslucht. Plaats het dekglas voorzichtig op het monster.

Laat de cellen ten minste twee minuten bezinken voorafgaand aan de microscopie. Voor langetermijnbeeldvorming worden de randen van het dekglas afgedicht met het verhit mengsel van vaseline, lanoline en paraffine of Val app. Om Saccharomyces visi-cellen voor turf-microscopie voor te bereiden, wordt een precultuur verdund en gedurende ten minste vijf uur gekweekt in geschikte media.

Neem voor de exponentiële fase een dekglas uit de met ethanol gevulde container en droog dit met perslucht met behulp van een pipetspreider. Breng 5 µL van een Con A-oplossing aan op het dekglas en droog dit met perslucht. Con A bindt aan de koolhydraten van de gistcelwand en immobiliseert de gistcellen.

Breng vervolgens 4,5 µL van een gistcelsuspensie aan op één zijde van de con, een gecoat dekglas. Plaats het dekglas voorzichtig met de monsterzijde naar beneden op een objectglas, beginnend bij één rand en laat het langzaam zakken. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen.

Laat de cellen ten minste twee minuten bezinken vóór de microscopie; verzegel de randen van het dekglas met val app voor langetermijn-imaging. Alle in deze video getoonde experimenten zijn uitgevoerd op een aangepaste turf-opstelling gebaseerd op een volledig geautomatiseerde IMEX-stand met een Olympus 100 x 1.45 NA objectief. De gebruikte lichtbronnen zijn 75 milliwatt diode-gepompte solid-state of DPSS-lasers bij 488 nanometers en 561 nanometers.

Turf-hoeken en fluorescentie. Herstel na fotobleken of de FRAP-positie kan onmiddellijk worden aangepast via twee galvanometers. Een derde galvanometer wordt gebruikt om te schakelen tussen epi, fluorescentie, FRAP en turf.

De galvanometers, die rechtstreeks worden aangestuurd via de live acquisitiesoftware, maken een eenvoudige meting mogelijk van de lokalisatiekinetiek voor objecten die zijn getraceerd in turf-beelden, welke zijn verzameld met een EM CCD-camera en een lens met een tweevoudige vergroting voor de camera. De acquisitie wordt eveneens aangestuurd door de live acquisitiesoftware. Draag vóór het werken met de laser een laserveiligheidsbril, projecteer de laser op het plafond in turf-modus en kalibreer de nulgradenpositie zodanig dat de laser in een rechte lijn staat.

Met als doel de laserstraal na optimale afstelling op een minimale grootte te focussen, moet het laserprofiel een goed gedefinieerde spot met een ongeveer ronde vorm vormen. Voer vóór elke sessie een kalibratie uit. Voor een optimale beeldkwaliteit is de uitlijning van de turfmicroscoop van cruciaal belang voor het succes van deze procedure.

De juiste instelling, hoeken en parameters voor de beeldacquisitie moeten zorgvuldig worden afgesteld voor een optimale beeldkwaliteit. Om te beginnen met de beeldacquisitie, moet de positie van de cellen worden bepaald met behulp van brightfield-verlichting. Rode LED's zijn hiervoor bijzonder geschikt, omdat ze geen significante fotobeschadiging veroorzaken.

Schakel over naar laserverlichting en selecteer de juiste laser- en filtercombinaties om de gewenste fluoroforen te exciteren; zorg ervoor dat de hoek van de turf subkritisch is. Anders zullen signalen afkomstig van GFP-fusie-eiwitten niet worden gedetecteerd. Zoek de bovenkant van de cel, wat de zijde van de cel is die naar het dekglas is gericht.

Verhoog geleidelijk de invalshoek van de laserstraal totdat de signalen verdwijnen, en verlaag vervolgens langzaam de hoek tot het punt waarop fluorescentie aan het celoppervlak opnieuw verschijnt. Stel de Z-focus opnieuw in voor de optimale positie aan het oppervlak. Acceptabele hoeken veroorzaken geen wazige halo aan de rand van de cel, zoals geïllustreerd door dit voorbeeld van een gisteiwit.

PMA one GFP afgebeeld met afnemende invalshoeken van linksboven naar rechtsonder. De beelden tonen een plotseling verlies van signaal bij de kritieke hoek en een progressieve afname van structurele informatie en de signaal-ruisverhouding; pas de laserintensiteiten en de cameraversterking aan om het dynamisch bereik te maximaliseren. Gewoonlijk zijn E-M-C-C-D-camera's optimaal voor het detecteren van zeer lage signalen bij hoge signaal-ruisverhoudingen.

Turf-microscopie is zeer gevoelig voor kleine hoogteverschillen van het dekglas, waardoor slechts enkele cellen tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld. Deze afbeelding van een dichte suspensie van fluorescerende kralen is een voorbeeld van een ongelijkmatig gezichtsveld waarbij slechts een deel van het gezichtsveld in focus is.

Daarom kan het acquisitiegebied voor kleine cellen vaak worden beperkt tot een subregio die het gekozen object bevat. Bij experimenten met dubbele kleuren moet de bleed-through van fluoroforen voor RFP-GFP-paren worden geminimaliseerd. Gebruik afzonderlijke emissiefilters, aangezien RFP zwak wordt geëxciteerd door licht van 488 nanometer.

Een typische workflow om bleed-through en dubbele kleurbeeldvorming te voorkomen wordt hier getoond. Nadat de cellen met afzonderlijke filtersets zijn gefotografeerd, worden de beelden gedeconvolueerd en uitgelijnd met behulp van fluorescente beads voordat ze worden samengevoegd. Voor de analyse is een kritische parameter die de beeldkwaliteit beïnvloedt de laseruitlijning en een schoon objectief. Nadat de laser is uitgelijnd en is gefocust op de Z-positie die wordt gebruikt voor turf-beeldvorming, dient het monster te worden verwijderd en het objectief volledig te worden gereinigd van alle olie.

Residuele olie zal leiden tot diffractie van het laserlicht en spikkels in het bundelprofiel. Turf-microscopie kan worden gebruikt om de distributie van actine-homologen en celwandenzymen in bacteriële cellen te visualiseren. In dit representatieve resultaat werden Bacillus subtilis-cellen die GFP-fusies van de actine-homoloog MBL of de transpeptidase PBPH tot expressie brachten, afgebeeld met turf- en reguliere epi-fluorescentie.

De afbeeldingen hier representeren gemiddelde projecties van een tijdreeks om het gebied aan te geven dat bedekt wordt door motiele MBL-patches, gemonitord met verschillende beeldvormingsmodi. De blauwe omtrek in de overlay-afbeelding geeft de celgrens aan, gevisualiseerd vanuit een brightfield-afbeelding.

De wekelijks tot expressie gebrachte transpeptidase PBPH lokaliseert naar corticale patches die nauwelijks zichtbaar zijn met epi-fluorescentie, maar duidelijk onderscheiden kunnen worden met turf. De verminderde penetratie is het best waarneembaar voor het P-B-P-H-G-F-P-signaal bij de SEPTA die door de pijlen worden aangegeven, welke verschijnen als lijnen bij epi-fluorescentie, maar als stippen bij turf. Deze volgende set afbeeldingen toont een vergelijking tussen epi-fluorescentie en turf-verlichting van de TOR-complexcomponent, bit 61 in Saccharomyces visi.

Dit eiwit wordt zwak tot matig tot expressie gebracht en vormt kleine corticale patches met slechts enkele eiwitkopieën per patch. Bij epi-fluorescentie zijn slechts enkele patches zichtbaar boven de sterke achtergrond, terwijl patches in turf met een zeer goede signaal-ruisverhouding kunnen worden afgebeeld. Verdere verbetering van het beeldcontrast kan worden bereikt via diverse beeldbewerkingsstappen, zoals de aftrekking van Gaussian- of mediaan-geblurde beelden, terwijl lokale achtergrondaftrekking ruis verwijdert en structuren met een hoge intensiteit verscherpt.

Dit gaat vaak ten koste van het verlies van fijne structuren en een overmatige versterking van regio's met een hoge intensiteit. Zoals aangegeven door de pijl, is een superieure procedure 2D-deconvolutie, die kan worden uitgevoerd met gratis of commercieel beschikbare softwarepakketten. De toename van het contrast na deconvolutie wordt geïllustreerd door deze time-lapse film van GFP RAs twee, waarin afwisselend ruwe en gedeconvolueerde turf-beelden worden getoond.

Aangezien GFP RA's twee een snel bewegend eiwit is, zijn korte acquisitietijden essentieel om het dynamische gedrag ervan te kunnen analyseren. Beeldbewerking is bijzonder belangrijk voor colocalisatie-analyses, zoals geïllustreerd in deze time-lapse dubbelkleurenfilm van gisteiwitten, FET 3G FP en PMA één RFP.

De eerste 10 frames representeren ruwe beelden en de resterende frames zijn gedeconvolueerde beelden. Om analyse mogelijk te maken, is het essentieel om het contrast te maximaliseren en de wazige ruwe beelden te verscherpen. Turf en frap bieden een krachtige combinatie voor het bestuderen van de dynamiek van corticale eiwitten. Het gebruik van deze techniek in B subtlest-cellen die G-F-P-M-B-L tot expressie brengen, sloot treadmilling uit als het mechanisme voor de waargenomen motiliteit van MBL-bevattende patches.

De chm-grafiek van het bewegende vlak en het intensiteitsprofiel langs de chm-grafiek, aangegeven door de stippellijn, wordt op een vergelijkbare wijze getoond als de turf frap van het plasmamebraan van de gist. Een TPAs PMA one onthulde de langzame herrangschikkingen van gistplasmamebraanproteïnen, die zich na hun ontwikkeling verdelen in netwerkachtige domeinen die het gehele celoppervlak bedekken. Deze techniek plaveide de weg voor onderzoek in het veld van de bacteriële celbiologie om het mechanisme van celwandsynthese in B. subtilis te verkennen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u turf-afbeeldingen van micro-organismen zoals gist en bacteriën kunt verkrijgen, en hoe deze techniek kan helpen bij het bestuderen van de dynamische eigenschappen van corticale eiwitten.