Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren wij het protocol voor het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie op enkelvoudige moleculen in levende bacteriële cellen, om functionele moleculaire complexen te kunnen detecteren, volgen en kwantificeren. Dit protocol begint met het kweken van bacteriën die een eiwit produceren dat gekoppeld is aan een fluorescent kleurstofmolecuul. Na vier tot zes uur wordt een klein volume cellen uit de cultuur geëxtraheerd en worden hun flagelmenten afgekort door afschering.

Een glazen dekglas in een flowcel wordt gecoat om cellen aan het oppervlak te laten hechten. Cellen worden in de flowcel geïnjecteerd en vastgezet via een gellaar-stompje, wat via fluorescentie wordt bekeken met behulp van laser-excitatiemicroscopie. Een camera met een hoge kwantumefficiëntie legt vervolgens de heldere brightfield- en fluorescentiebeelden van de gelabelde moleculaire complexen vast.

Hallo, mijn naam is Ian Doy en ik werk samen met Mark Lee bij de afdeling Biochemie van de Universiteit van Oxford. Ik ben Alex Robertson en ik werk samen met Mark Lee bij de afdeling natuurkunde. Ik ben Nick De van het leak-lab, dat ook gevestigd is bij de afdeling natuurkunde.

Vandaag laten we u de procedure zien voor het visualiseren van enkelvoudige moleculaire complexen in levende bacteriën met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie. We gebruiken deze procedure om deze in een functionele staat te bestuderen. Daarnaast gebruiken we deze methode om de real-time dynamiek van natuurlijke biologische machines op nanometerschaal te onderzoeken.

Laten we beginnen. Ontdooi eerst 50 µL bevroren stammen van E. coli-bacteriën. Deze zijn genetisch gemodificeerd.

Om een eiwit te labelen met een fluorescent kleurstofmolecuul, inoculeert u vijf milliliters LB-groeimedium en kweekt u de bacteriën aeroob onder schudomstandigheden gedurende de nacht bij 37 °C. De volgende ochtend neemt u 50 µL van de verzadigde cultuur en subcultiveert u deze in minimaal M 63 glucose-cultuurmedium; incubeer dit bij 30 °C gedurende vier tot zes uur. Hierbij worden twee verschillende cellijnen gebruikt.

De één drukt een elektronentransporterend cytochroom uit dat gefuseerd is met GFP. De ander drukt een eiwit uit dat betrokken is bij de bacteriële flagellomotor. Cellen die gefuseerd zijn met GFP kunnen direct uit de groeiende subcultuur worden geoogst als ze als geïmmobiliseerde monsters worden bekeken, of ze kunnen worden afgebroken om de bacteriële flagellen in te korten als ze onder getetherde condities worden bekeken.

Om de bacteriën te sheareren, brengt u één tot vijf milliliter van de subcultuur via steriele leidingen over in een apparaat bestaande uit twee steriele spuiten. Druk afwisselend op elke spuitpomp om de cultuur ongeveer 50 tot 100 keer door de nauwe buis te persen, afhankelijk van de gewenste mate van shearing. Centrifugeer vervolgens de cultuur om de cellen te pelletteren en resuspendeer de cellen daarna in minimaal medium om flagelfragmenten te verwijderen. Zodra de cellen gereed zijn, bereidt u gereinigde BK 7 glazen dekglasplaatjes voor door deze 20 minuten te dompelen in een verzadigde oplossing van kaliumhydroxide en ethanol.

Spoel grondig af met gedeïoniseerd water en ethanol en laat minstens één uur aan de lucht drogen. Constructeer vervolgens een eenvoudige flowcel om de cellen in de microscoop te huisvesten. Doe dit door lijnen paraffinewas op een BK7-glasplaat van een microscoop te trekken en vervolgens een tunnel-sandwich te maken door een van de gereinigde dekglasjes erbovenop te plaatsen.

Druk voorzichtig aan met een pincet. Dit moet resulteren in een flowcell-volume van 5 tot 10 µL. Om geïmmobiliseerde cellen te observeren, vult u de flowcell door een 0,1% oplossing van poly-L-lysine te injecteren en laat u dit gedurende ten minste één minuut incuberen bij kamertemperatuur.

Spoel vervolgens de flowcel door door 100 µL minimaal medium aan één uiteinde van de flowcel te injecteren, terwijl het medium gelijktijdig aan het andere uiteinde met vloeipapier wordt weggezogen. Trek daarna 20 µL van een 1:500 verdunning van latex microsferen met een diameter van 200 nm in minimaal medium door de cel om het oppervlak van het dekglas te markeren. Plaats de flowcel in een eenvoudige bevochtigingskamer en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. De flowcel wordt omgekeerd zodat het dekglas naar beneden is gericht.

De ongebonden kraaltjes worden vervolgens weggewassen door 100 µL minimaal medium met vloeipapier door de cel te trekken. Om aan het oppervlak gehechte cellen waar te nemen, wordt de incubatiestap met poly-L-lysine overgeslagen; vul de flowcel in plaats daarvan met een Anti-Flag gellan-antilichaamoplossing van 5 µg/mL en plaats deze vervolgens gedurende 10 minuten in een bevochtigingskamer. Spoel na incubatie de flowcel door door deze met vloeipapier leeg te trekken.

Vervolgens worden 20 µL van de celcultuur via de flowcel met weefselpapier opgezogen (wicking), waarbij ofwel het geschoren monster wordt gebruikt om getetherde cellen waar te nemen, of het ongeschoren monster om geïmmobiliseerde cellen te bekijken; de flowcel wordt omgedraaid en gedurende 20 minuten in de bevochtigingskamer geplaatst. De niet-gebonden cellen worden vervolgens weggespoeld door 100 µL minimaal medium via wicking door te voeren. Plaats een druppel immersie-olie in het midden van het bovenste oppervlak van het dekglas.

Plaats de flowcell voorzichtig op de monsterhouder van de op maat gebouwde fluorescentiemicroscoop. Hierdoor moet optisch contact ontstaan met het objectief met de hoge numerieke apertuur. Schakel vervolgens de elektron vermenigvuldigende camera van de microscoop in en stel de camera zo in dat deze wordt gekoeld tot -70 °C.

De software is ingesteld om beelden vast te leggen met een typische framerate van 25 hertz. In frame-transfermodus. Schakel de brightfield-verlichting in en stel het beeld scherp.

Selecteer een geschikte cel of groep cellen om te beelden op basis van hun aanhechting langs de lange as. Stel de focus parallel aan het oppervlak van het dekglas zo in dat de 200 nanometer latexbeads die aan het oppervlak van het dekglas kleven, net in focus zijn. Neem een beeldsequentie op in brightfield om de omtrek van het cellichaam vast te leggen.

De veldlichtverlichting wordt vervolgens uitgeschakeld en de cameragevin wordt op maximum ingesteld voor beeldvorming met behulp van totale interne reflectiefluorescentie, ook wel TIRF genoemd. Start de camera-acquisitie en open het laserluik om de fluorescerende eiwitten in de bacteriën te exciteren. De parameters voor laserintensiteit en acquisitiesnelheid moeten worden geoptimaliseerd voor het specifieke biologische systeem.

De te bestuderen monsters worden belicht tot ze zijn uitgebleekt, wat doorgaans ongeveer 10 seconden duurt. Zodra de gegevens zijn verzameld, worden de beelden ingevoerd in een speciaal geschreven analyseprogramma, dat automatisch de posities van fluorescerende vlekken in de cellen detecteert met een precisie van enkele nanometers en hun grootte en helderheid extraheert. De helderheid van het fotoblekingstraject ten opzichte van de tijd van het attractiemoleculaire complex wordt vervolgens gebruikt om de stoichiometrie te schatten.

Met deze methode is het beeld van de cellen waargenomen in helderveld zeer duidelijk, zodanig dat de perimeters van de cellichamen donker afsteken tegen een witgrijs cellichaam bij gebruik van fluorescentie met geïmmobiliseerde cellen. Duidelijke intensiteitspunten met een breedte van doorgaans 250 tot 300 nanometer zijn hier in vals-kleuren weergegeven. Gezonde vastgehechte cellen kunnen in helderveldbeelden onder fluorescente excitatie worden gezien terwijl ze roteren rond het punt van de bevestiging.

Sommige moleculaire complexen kunnen mogelijk worden waargenomen bij het aanhechtingspunt, wat duidt op een lokalisatie van het getagde eiwit bij de Geller-motor. Deze vlekken zijn individuele moleculaire complexen. Het aantal waargenomen complexen is afhankelijk van de gebruikte belichtingsmodus en van hoeveel van deze complexen op een bepaald moment daadwerkelijk in de cel aanwezig zijn.

Als de densiteit van de spots aanvankelijk zeer hoog is, zoals het geval is bij de hier gebruikte gelabelde cytochromen, kan het uitvoeren van een initiële FRAP-bleking het beeldcontrast verbeteren. De mobiliteit van de spots hangt af van het specifieke biologische systeem dat wordt bestudeerd. We hebben u zojuist laten zien hoe u enkelvoudige moleculaire complexen kunt visualiseren met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om shear cells te vermijden, aangezien dit de functionaliteit van de flagellaire motor kan belemmeren. Het is daarnaast belangrijk om de cellen niet langer dan een uur op de microscopische objectglazen te laten, omdat ze anders zuurstofarm kunnen worden. Automatisering is vereist om de beste beeldvormingscondities te vinden.

Het kan nuttig zijn om alleen gezuiverd GFP te gebruiken om de juiste lasersterkte voor uw specifieke microscoopsysteem vast te stellen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.