Name: Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer single-molecule fluorescentiemicroscopie op levende bacteriële cellen om functionele moleculaire complexen te detecteren, volgen en kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in moleculaire dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen het soort donaties van bacteriestammen uit de groepen van prof. dr. Judith Armitage (Universiteit van Oxford, Verenigd Koninkrijk) en prof. dr. Conrad Mullineaux (Queen Mary Universiteit van Londen, Verenigd Koninkrijk). IMD wordt gezamenlijk gefinancierd door de Afdeling Biochemie (Oxford University) en OCISB, AR wordt gefinancierd door een Engineering en Exacte Wetenschappen Research Council (EPSRC) DTC studententijd, ND wordt gefinancierd uit de biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC); MCL is gefinancierd door een Royal Society Universiteit Research Fellowship.

<ol><li> Om te beginnen deze procedure, 50 ul van bevroren voorraden van fluorescerende eiwitten te drukken Escherichia coli bacteriële cellen worden eerst ontdooid en aëroob gegroeid met schudden in 5 ml LB groeimedia &#39;s nachts bij 37 graden C. In de ochtend, wordt 50 ul van deze verzadigde cultuur onttrokken en sub-gekweekt in de minimal M63 glucose cultuur media, incuberen bij 30 ° C gedurende 4 tot 6 uur. Hier laten we zien met twee verschillende cel-stammen, waarvan er een uitdrukking een elektron-transport van cytochroom gefuseerd met GFP, de andere die een eiwit dat betrokken is in het bacteriële flagellaire motor gefuseerd met GFP uitdrukt. </li><li> Cellen kunnen ofwel rechtstreeks geoogst uit de groeiende sub-cultuur als ze te bekijken als geïmmobiliseerd monsters, of ze kunnen worden geschoren om bacteriële flagella afkappen als het bekijken onder &quot;tethered&quot; voorwaarden. </li><li> Shearing bestaat uit het plaatsen meestal 1-5 ml van de sub-cultuur in een apparaat dat bestaat uit twee steriele spuiten verbonden door steriele leidingen. Het scheren wordt gedaan door afwisselend te drukken in elke spuit pomp naar de cultuur duwen door de smalle buis. Dit wordt gedaan 50-100 keer, afhankelijk van de mate van afschuiving vereist. De cultuur wordt dan gecentrifugeerd om pellet van de cellen, die wordt geresuspendeerd in minimale media flagellen fragmenten te verwijderen. </li><li> Vervolgens hebben we bereiden gereinigd BK7 dekglaasjes door onderdompeling in een verzadigde oplossing van KOH in ethanol voor 20 min, daarna grondig uitspoelen in gedeïoniseerd water en ethanol en het verlaten van te drogen aan de lucht gedurende ten minste 1 uur </li><li> Construeren we een simpele flow-cel naar de cellen huis in de microscoop. Het gaat om lijnen te trekken van de paraffine vet op een BK7 glas microscoopglaasje en vervolgens het maken van een tunnel-sandwich door het plaatsen van een van de gereinigde coverlips op de top, en drukken voorzichtig met een pincet, met een capaciteit celvolume van 5-10 ul . </li><li> Waar te nemen geïmmobiliseerde cellen vullen we de flow-cel door middel van injectie met een 0,1% w / v oplossing van poly-L-lysine, en laat het op kamertemperatuur incuberen gedurende tenminste een minuut. Daarna spoelen met behulp van 100 ui minimale media door het injecteren van de media van het ene uiteinde van de flow-cel en wicking met tissue papier uit de andere. </li><li> Vervolgens hebben we lont tot en met 20 ul van een 1:500 verdunning van 200 nm diameter latex microsferen (Polysciences) in een minimale media om het dekglaasje oppervlak te markeren. De flow-cel is omgekeerd zodanig dat de dekglaasje is naar beneden, op een platform geplaatst uit de buurt van het oppervlak in een eenvoudige vochtkamer geconfronteerd, en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Ongebonden parels worden vervolgens weggespoeld door wicking door middel van 100 pi minimale media. </li><li> Als we willen tethered cellen te observeren we weglaten van de poly-L-lysine voor stap en in plaats daarvan vullen de flow-cel met 5 mg / ml anti-flagelline antilichaam. De flow-cel is plaats in de luchtvochtigheid kamer gedurende 10 min en wordt vervolgens doorgespoeld door wicking. </li><li> 20 ul van de cel cultuur is dan slecht door de flow-cel, hetzij met behulp van de geschoren monster als het observeren van gebonden cellen of de unsheared monster in het bekijken van geïmmobiliseerde cellen. </li><li> De flow-cel is omgekeerd en geplaatst in de luchtvochtigheid kamer voor 20 minuten. Ongebonden cellen worden vervolgens gewassen door wicking door middel van 100 pi minimale media. </li><li> Een druppeltje immersie olie is geplaatst in het midden van de bovenkant van het dekglaasje en de stroom-cel wordt vervolgens voorzichtig op om het monster houder van de op maat gemaakte fluorescentie microscoop, het maken van optische contact met de hoge numerieke apertuur objectief. </li><li> De microscoop elektron-vermenigvuldigen camera is ingeschakeld en de camera ingesteld worden gekoeld tot -70 ° C, is de software ingesteld om beelden te verwerven in een typische frame rate van 25 Hz in frame-transfer mode, aanvankelijk disenabling de winst controle op de camera. </li><li> De helderveld verlichting wordt ingeschakeld en het beeld scherp is gesteld, het selecteren van een geschikte cel of groep cellen af ​​te beelden op basis van hun vast te zitten met hun lange as parallel aan de dekglaasje oppervlak. De focus ligt fijn aangepast om ervoor te zorgen dat de 200 nm latex bolletjes vast aan het dekglaasje oppervlak zijn alleen in focus. </li><li> Een beeld sequentie wordt verkregen in helderveld om de omtrek van het cellichaam te nemen. De helderveld verlichting is uitgeschakeld en de camera te krijgen is ingeschakeld om maximum. </li><li> Voor een standaard acquisitie met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (of TIRF) een laserstraal op juiste golflengte (hier, voor groen fluorescerend eiwit excitatie, gebruiken we een 473 nm laser) is zo ingesteld als moet worden geconcentreerd in de rug brandvlak van het objectief, maar zijdelings verplaatst van de optische as naar een evanescente veld voor fluorescentie excitatie in de cel monster te genereren. </li><li> De camera acquisitie wordt gestart en de laser sluiter geopend voor het fluorescerende eiwitten binnen de bacteriën te wekken. De parameters voor laser-intensiteit en snelheid van de overname moeten worden geoptimaliseerd voor de specifieke biologische systeem een ​​onderzoek door te experimenteren met verschillende waarden, maar een typische reeks relevant aan het bestuderen van mobiele eiwitcomplexen in het celmembraan zijn 1-10 mW laser macht over een cirkelvormig gebied met een diameter excitatie ~ 30 micrometer, met een belichtingstijd per frame van 5-40 ms. Monsters worden verlicht tot photobleached, typisch voor ~ 10 s. </li><li> Dit protocol kan gebruikt worden zowel voor aangebonden cellen waarin het lichaam van de cel draait over een punt van de hechting tussen het dekglaasje en een flagellaire stub, en voor de geïmmobiliseerde cellen die stevig zijn bevestigd aan het dekglaasje oppervlak. </li><li> Sommige mobiele stammen die een hoog kopie-aantal van de complexen hebben baat bij een eerste diffractie-beperkte gericht laser bleekwater op een pool van de cel voorafgaand aan de TIRF beeldvorming. Dat bleekmiddel is gelijk aan die gebruikt worden in fluorescentie herstel na fotobleken (of FRAP). Met behulp van onze op maat microscoop enkele van de excitatie laser licht kan worden gevoerd af in een tweede onafhankelijke pad gebruikt voor FRAP-type bleken. Typisch een-10mW laservermogen wordt gebruikt, met een typisch bleekmiddel tijd in het bereik 10-300 ms. Dit resulteert in veel hogere beeldvorming contrast in het gebleekte gebied van de cel waardoor individuele complexen die vervolgens diffuus in dat gebied om meer makkelijk kunnen worden gevisualiseerd worden. </li><li> Voor het visualiseren van complexen in de cel cytoplasma die diffuse veel sneller dan die in de celmembraan een andere belichting modus genaamd &quot;slimfield&quot; is gebruikt. Hier een gerichte laser wordt uitgebreid lateraal om gewoon omvatten een enkele cel. Dit levert een zeer intense veld waardoor veel sneller blootstelling van typisch een milliseconde te worden genomen. </li><li> Na de data-acquisitie, worden de beelden verwerkt in op maat geschreven software (gecodeerd in LabVIEW 8.5). Dit detecteert automatisch de posities van fluorescerende vlekken in de cellen met een precisie van een typisch enkele nanometers en extracten hun grootte en helderheid. De brightnessof de fotobleken te traceren met betrekking tot de tijd van een bijgehouden moleculair complex vervolgens wordt gebruikt om de stoichiometrie schatten, dat wil zeggen hoeveel afzonderlijke fluorescerende eiwitten vormen een enkele moleculaire complex. </li></ol> Representatieve resultaten: Wanneer het protocol is uitgevoerd juist de beelden van de cellen bekeken in helderveld is zeer duidelijk, met de grenzen van de cellichamen donker tegen een wit / grijs cellichaam (figuur 1a). In fluorescentie met behulp van geïmmobiliseerde cellen, zien we verschillende plekken de intensiteit, van typisch 250 tot 300 nm in de breedte (Figuur 1b). Gezonde, vastgebonden cellen zal worden gezien om te roteren rond het punt van de ketting bijlage in helderveld beelden. Onder fluorescentie excitatie een aantal moleculaire complexen in ons geval zou ook te zien op het moment van bevestiging, wijst op een lokalisatie van de gelabeld eiwit met de flagellaire motor. Deze vlekken zijn individuele moleculaire complexen en het aantal van hen gezien zal afhangen van de gebruikte verlichting mode en hoeveel van de complexen zijn eigenlijk in de cel aanwezig zijn op een bepaald moment. De mobiliteit van de plekken hangt af van de specifieke biologische systeem onder studie. Als de dichtheid van de plekken is aanvankelijk zeer hoog, evenals het geval is met de gelabelde cytochromen hier gebruikt, dan is het uitvoeren van een eerste FRAP bleekwater kan de beeldvorming contrast te verbeteren. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. (A) helderveld en (B) TIRF beeld (valse kleuren) voor een geïmmobiliseerd Escherichia coli cel die een eiwit gefuseerd met green fluorescent protein (GFP), waarvan bekend is dat betrokken is bij de flagellaire motoren van bacteriën. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Zorg moet worden genomen om geen &quot;over shear&quot; cel om naar te kijken aangebonden bacteriën, aangezien dit afbreuk doen aan de functionaliteit van de flagellaire motoren. Het is belangrijk om cellen die een keer te gebruiken voor veel langer dan een uur op de microscoop slide, omdat ze kunnen worden zuurstof uitgeput. Aanzienlijke optimalisatie kan nodig zijn om de beste imaging microscoop voorwaarden afgestemd op uw specifieke biologisch systeem in onderzoek. Het kan verstandig zijn om de beeldvorming met behul...

visualiseren single moleculaire complexen in vivo geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Volledig inzicht in de mechanismen van levende cellen kan alleen worden bereikt door het onderzoeken van de belangrijkste processen die uitlokken en gebeurtenissen direct op een cellulair niveau. Tot op heden is de schuifspanning complexiteit van biologische systemen heeft veroorzaakt precies single-molecule experimenten te ver veeleisend zijn, in plaats daarvan concentreren op studies van enkele systemen met behulp van relatief ruwe bulk ensemble-gemiddelde van metingen. Echter veel belangrijke processen zich voordoen in de levende cel op het niveau van slechts een of enkele moleculen; ensemble metingen over het algemeen het masker van de stochastische en heterogene karakter van deze gebeurtenissen. Hier, met behulp van geavanceerde optische microscopie en analytische beeldanalyse tools die we laten zien hoe eiwitten binnen een enkel levend bacteriële cel met een precisie van enkele moleculen en hoe we kunnen de dynamiek binnen de moleculaire complexen te observeren in het functioneren van biologische machines te controleren. De technieken zijn direct relevant zijn fysiologisch. Ze zijn minimaal-perturbatieve en niet-invasieve aan het biologische monster onder studie en zijn volledig afgestemd voor het onderzoek in levend materiaal, functies die niet direct beschikbaar zijn voor andere single-molecule benaderingen van biofysica. Daarnaast is de biologische monsters bestudeerde alle fluorescent-gelabelde eiwit te produceren op een niveau dat bijna identiek is aan de ongewijzigde celstammen (&quot;genoom encoding&quot;), in tegenstelling tot de meer gebruikelijke, maar minder ideale aanpak voor het genereren van aanzienlijk meer eiwitten dan zou van nature voorkomen (&#39;plasmide expressie&#39;). Dus de werkelijke biologische monsters die zullen worden onderzocht zijn aanzienlijk dichter bij de natuurlijke organismen, en dus de waarnemingen meer relevant zijn voor echte fysiologische processen.

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Volledig inzicht in de mechanismen van levende cellen kan alleen worden verkregen door de belangrijkste processen te onderzoeken die gebeurtenissen op cellulair niveau teweegbrengen en sturen...

Hier presenteren wij het protocol voor het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie op enkelvoudige moleculen in levende bacteriële cellen, om functionele moleculaire complexen te kunnen detecteren, volgen en kwantificeren. Dit protocol begint met het kweken van bacteriën die een eiwit produceren dat gekoppeld is aan een fluorescent kleurstofmolecuul. Na vier tot zes uur wordt een klein volume cellen uit de cultuur geëxtraheerd en worden hun flagelmenten afgekort door afschering.Een glazen dekglas in een flowcel wordt gecoat om cellen aan het oppervlak te laten hechten. Cellen worden in de flowcel geïnjecteerd en vastgezet via een gellaar-stompje, wat via fluorescentie wordt bekeken met behulp van laser-excitatiemicroscopie. Een camera met een hoge kwantumefficiëntie legt vervolgens de heldere brightfield- en fluorescentiebeelden van de gelabelde moleculaire complexen vast.Hallo, mijn naam is Ian Doy en ik werk samen met Mark Lee bij de afdeling Biochemie van de Universiteit van Oxford. Ik ben Alex Robertson en ik werk samen met Mark Lee bij de afdeling natuurkunde. Ik ben Nick De van het leak-lab, dat ook gevestigd is bij de afdeling natuurkunde.Vandaag laten we u de procedure zien voor het visualiseren van enkelvoudige moleculaire complexen in levende bacteriën met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie. We gebruiken deze procedure om deze in een functionele staat te bestuderen. Daarnaast gebruiken we deze methode om de real-time dynamiek van natuurlijke biologische machines op nanometerschaal te onderzoeken.Laten we beginnen. Ontdooi eerst 50 µL bevroren stammen van E. coli-bacteriën. Deze zijn genetisch gemodificeerd.Om een eiwit te labelen met een fluorescent kleurstofmolecuul, inoculeert u vijf milliliters LB-groeimedium en kweekt u de bacteriën aeroob onder schudomstandigheden gedurende de nacht bij 37 °C. De volgende ochtend neemt u 50 µL van de verzadigde cultuur en subcultiveert u deze in minimaal M 63 glucose-cultuurmedium; incubeer dit bij 30 °C gedurende vier tot zes uur. Hierbij worden twee verschillende cellijnen gebruikt.De één drukt een elektronentransporterend cytochroom uit dat gefuseerd is met GFP. De ander drukt een eiwit uit dat betrokken is bij de bacteriële flagellomotor. Cellen die gefuseerd zijn met GFP kunnen direct uit de groeiende subcultuur worden geoogst als ze als geïmmobiliseerde monsters worden bekeken, of ze kunnen worden afgebroken om de bacteriële flagellen in te korten als ze onder getetherde condities worden bekeken.Om de bacteriën te sheareren, brengt u één tot vijf milliliter van de subcultuur via steriele leidingen over in een apparaat bestaande uit twee steriele spuiten. Druk afwisselend op elke spuitpomp om de cultuur ongeveer 50 tot 100 keer door de nauwe buis te persen, afhankelijk van de gewenste mate van shearing. Centrifugeer vervolgens de cultuur om de cellen te pelletteren en resuspendeer de cellen daarna in minimaal medium om flagelfragmenten te verwijderen. Zodra de cellen gereed zijn, bereidt u gereinigde BK 7 glazen dekglasplaatjes voor door deze 20 minuten te dompelen in een verzadigde oplossing van kaliumhydroxide en ethanol.Spoel grondig af met gedeïoniseerd water en ethanol en laat minstens één uur aan de lucht drogen. Constructeer vervolgens een eenvoudige flowcel om de cellen in de microscoop te huisvesten. Doe dit door lijnen paraffinewas op een BK7-glasplaat van een microscoop te trekken en vervolgens een tunnel-sandwich te maken door een van de gereinigde dekglasjes erbovenop te plaatsen.Druk voorzichtig aan met een pincet. Dit moet resulteren in een flowcell-volume van 5 tot 10 µL. Om geïmmobiliseerde cellen te observeren, vult u de flowcell door een 0,1% oplossing van poly-L-lysine te injecteren en laat u dit gedurende ten minste één minuut incuberen bij kamertemperatuur.Spoel vervolgens de flowcel door door 100 µL minimaal medium aan één uiteinde van de flowcel te injecteren, terwijl het medium gelijktijdig aan het andere uiteinde met vloeipapier wordt weggezogen. Trek daarna 20 µL van een 1:500 verdunning van latex microsferen met een diameter van 200 nm in minimaal medium door de cel om het oppervlak van het dekglas te markeren. Plaats de flowcel in een eenvoudige bevochtigingskamer en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. De flowcel wordt omgekeerd zodat het dekglas naar beneden is gericht.De ongebonden kraaltjes worden vervolgens weggewassen door 100 µL minimaal medium met vloeipapier door de cel te trekken. Om aan het oppervlak gehechte cellen waar te nemen, wordt de incubatiestap met poly-L-lysine overgeslagen; vul de flowcel in plaats daarvan met een Anti-Flag gellan-antilichaamoplossing van 5 µg/mL en plaats deze vervolgens gedurende 10 minuten in een bevochtigingskamer. Spoel na incubatie de flowcel door door deze met vloeipapier leeg te trekken.Vervolgens worden 20 µL van de celcultuur via de flowcel met weefselpapier opgezogen (wicking), waarbij ofwel het geschoren monster wordt gebruikt om getetherde cellen waar te nemen, of het ongeschoren monster om geïmmobiliseerde cellen te bekijken; de flowcel wordt omgedraaid en gedurende 20 minuten in de bevochtigingskamer geplaatst. De niet-gebonden cellen worden vervolgens weggespoeld door 100 µL minimaal medium via wicking door te voeren. Plaats een druppel immersie-olie in het midden van het bovenste oppervlak van het dekglas.Plaats de flowcell voorzichtig op de monsterhouder van de op maat gebouwde fluorescentiemicroscoop. Hierdoor moet optisch contact ontstaan met het objectief met de hoge numerieke apertuur. Schakel vervolgens de elektron vermenigvuldigende camera van de microscoop in en stel de camera zo in dat deze wordt gekoeld tot -70 °C.De software is ingesteld om beelden vast te leggen met een typische framerate van 25 hertz. In frame-transfermodus. Schakel de brightfield-verlichting in en stel het beeld scherp.Selecteer een geschikte cel of groep cellen om te beelden op basis van hun aanhechting langs de lange as. Stel de focus parallel aan het oppervlak van het dekglas zo in dat de 200 nanometer latexbeads die aan het oppervlak van het dekglas kleven, net in focus zijn. Neem een beeldsequentie op in brightfield om de omtrek van het cellichaam vast te leggen.De veldlichtverlichting wordt vervolgens uitgeschakeld en de cameragevin wordt op maximum ingesteld voor beeldvorming met behulp van totale interne reflectiefluorescentie, ook wel TIRF genoemd. Start de camera-acquisitie en open het laserluik om de fluorescerende eiwitten in de bacteriën te exciteren. De parameters voor laserintensiteit en acquisitiesnelheid moeten worden geoptimaliseerd voor het specifieke biologische systeem.De te bestuderen monsters worden belicht tot ze zijn uitgebleekt, wat doorgaans ongeveer 10 seconden duurt. Zodra de gegevens zijn verzameld, worden de beelden ingevoerd in een speciaal geschreven analyseprogramma, dat automatisch de posities van fluorescerende vlekken in de cellen detecteert met een precisie van enkele nanometers en hun grootte en helderheid extraheert. De helderheid van het fotoblekingstraject ten opzichte van de tijd van het attractiemoleculaire complex wordt vervolgens gebruikt om de stoichiometrie te schatten.Met deze methode is het beeld van de cellen waargenomen in helderveld zeer duidelijk, zodanig dat de perimeters van de cellichamen donker afsteken tegen een witgrijs cellichaam bij gebruik van fluorescentie met geïmmobiliseerde cellen. Duidelijke intensiteitspunten met een breedte van doorgaans 250 tot 300 nanometer zijn hier in vals-kleuren weergegeven. Gezonde vastgehechte cellen kunnen in helderveldbeelden onder fluorescente excitatie worden gezien terwijl ze roteren rond het punt van de bevestiging.Sommige moleculaire complexen kunnen mogelijk worden waargenomen bij het aanhechtingspunt, wat duidt op een lokalisatie van het getagde eiwit bij de Geller-motor. Deze vlekken zijn individuele moleculaire complexen. Het aantal waargenomen complexen is afhankelijk van de gebruikte belichtingsmodus en van hoeveel van deze complexen op een bepaald moment daadwerkelijk in de cel aanwezig zijn.Als de densiteit van de spots aanvankelijk zeer hoog is, zoals het geval is bij de hier gebruikte gelabelde cytochromen, kan het uitvoeren van een initiële FRAP-bleking het beeldcontrast verbeteren. De mobiliteit van de spots hangt af van het specifieke biologische systeem dat wordt bestudeerd. We hebben u zojuist laten zien hoe u enkelvoudige moleculaire complexen kunt visualiseren met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om shear cells te vermijden, aangezien dit de functionaliteit van de flagellaire motor kan belemmeren. Het is daarnaast belangrijk om de cellen niet langer dan een uur op de microscopische objectglazen te laten, omdat ze anders zuurstofarm kunnen worden. Automatisering is vereist om de beste beeldvormingscondities te vinden.Het kan nuttig zijn om alleen gezuiverd GFP te gebruiken om de juiste lasersterkte voor uw specifieke microscoopsysteem vast te stellen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) in combinatie met single-molecule-tracking maakt directe observatie en kwantificering van eiwit-DNA-interacties in levende Escherichia coli cellen.

Visualiseren eiwit-DNA-interacties in levende bacteriële cellen met behulp Photoactivated Enkelmolecuul Tracking

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Een oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) methode wordt toegepast op afbeelding virus-geïnduceerde intracellulaire structuren via elektronenmicroscopie (EM) in de cellen die eerder door de lichte microscopie (LM) zijn geselecteerd. LM en EM worden gecombineerd als een hybride beeldvorming aanpak om een geïntegreerde visie van virus-gastheer interacties.

Oereenstemming lichte elektronenmicroscopie (CLEM) voor het bijhouden en Imaging virale eiwitten verbonden structuren in Cryo-geïmmobiliseerd cellen

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Leer single-molecule fluorescentiemicroscopie op levende bacteriële cellen om functionele moleculaire complexen te detecteren, volgen en kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in moleculaire dynamica.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen