Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie
September 8th, 2009
Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.
Hier demonstreren we het protocol voor het uitvoeren van enkelvoudige molecuulfluorescentiemicroscopie op levende bacteriecellen om functionele moleculaire complexen te detecteren, volgen en kwantificeren. Dit protocol begint met het kweken van bacteriën, die een eiwit maken dat is gelabeld met een fluorescerende kleurstofmolecuul. Na vier tot zes uur wordt een klein volume cellen uit de cultuur gehaald en worden hun flagella filamenten afgesneden door schudden.
Een glazen deksel in een flowcel is bedekt om cellen te laten plakken aan het oppervlak. Cellen worden in de flowcel geïnjecteerd en vastgebonden via een gellar stokje, die in fluorescentie wordt bekeken met behulp van laserexcitatiemicroscopie. Een camera met hoge kwantumefficiëntie neemt vervolgens de heldere heldere veld- en fluorescentiebeelden van de gelabelde moleculaire complexen op.
Hallo, mijn naam is Ian Doy en ik werk met Mark Lee op het Departement Biochemie aan de Universiteit van Oxford. Ik ben Alex Robertson die werkt met Mark Lee op de afdeling natuurkunde. Ik ben Nick De van het leklab, ook gevestigd op de afdeling natuurkunde.
Vandaag laten we je de procedure zien om enkelvoudige moleculaire complexen in levende bacteriën te visualiseren met behulp van geavanceerde fluorescentiemicroscopie. We gebruiken deze procedure om dit te bestuderen in een functionele toestand. We gebruiken het ook om realtime dynamica van natuurlijke biologische machines en nanometerlensschaal te onderzoeken.
Dus laten we beginnen. Om te beginnen ontdooi 50 microliter van bevroren staarten van e coli bacteriën. Deze zijn genetisch gemodificeerd.
Om een eiwit te labelen met een fluorescerende kleurstofmolecuul, inoculeer vijf milliliter LB-groeimedia en kweek de bacteriën aëroob met schudden gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend neem je 50 microliter van de verzadigde cultuur en stelt deze over in minimaal M 63 Glucose cultuurmedia en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende vier tot zes uur. Hier worden twee verschillende celstammen gebruikt.
De ene drukt een elektronentransporterend cytochroom uit dat is gefuseerd met GFP. De andere drukt een eiwit uit dat betrokken is bij de bacteriële flagella motor. Aan GFP gefuseerde cellen kunnen direct uit de groeiende subcultuur worden geoogst als ze als geïmmobiliseerde monsters worden bekeken, of ze kunnen worden gescheurd om bacteriële flagella af te snijden als ze onder vastgebonden omstandigheden worden bekeken.
Om de bacteriën te scheuren, plaats je een tot vijf milliliter van de subcultuur in een apparaat bestaande uit twee steriele spuiten door middel van steriele leidingen. Druk afwisselend op elke spuitpomp om de cultuur ongeveer 50 tot 100 keer door de smalle buis te forceren, afhankelijk van de mate van scheuring. Centrifugeer vervolgens de cultuur om de cellen te pellen en suspendeer de cellen vervolgens in minimaal media om flagella fragmenten te verwijderen. Zodra de cellen klaar zijn, bereid je gereinigde BK zeven glazen deksels voor door ze 20 minuten onder te dompelen in een verzadigde oplossing van kaliumhydroxide en ethanol.
Spoel grondig in gedeïoniseerd water en ethanol en laat ze minimaal een uur aan de lucht drogen. Maak vervolgens een eenvoudige flowcel om de cellen in de microscoop te huisvesten. Om dit te doen, teken lijnen van paraffinevet op een BK zeven glazen microscoopglasplaat en creëer vervolgens een tunnelsandwich door een van de gereinigde deksels erop te plaatsen.
Druk voorzichtig met een paar pincetten naar beneden. Dit zou een flowcelvolume van vijf tot tien microliter moeten geven. Om geïmmobiliseerde cellen te observeren, vul je de flowcel door te injecteren met een 0,1% oplossing van poly L lysine en laat deze ten minste een minuut op kamertemperatuur incuberen.
Vervolgens spoel je de flowcel uit door 100 microliter minimaal media vanaf het ene uiteinde van de flowcel te injecteren en gelijktijdig het media door de flowcel te wikkelen met tissuepapier vanaf het andere uiteinde. Daarna wikkel je 20 microliter van een verdunning van 1 op 500 van 200 nanometer diameter latex microsferen in minimaal media door om het oppervlak van het deksel te markeren. Plaats de flowcel in een eenvoudige vochtigheidskamer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. De flowcel wordt omgekeerd zodat het deksel naar beneden wijst.
De ongebonden kralen worden vervolgens weggewassen door 100 microliter minimaal media met tissuepapier te wikkelen. Om vastgebonden cellen te observeren, sla de stap van poly L lysine incubatie over, vul de flowcel met vijf microgram per milliliter Anti-Flag gellan antilichaam oplossing en plaats deze vervolgens gedurende 10 minuten in een vochtigheidskamer. Na incubatie spoel je de flowcel door middel van wikkelen met tissuepapier.
Vervolgens wikkel je 20 microliter van de celcultuur door de flowcel met tissuepapier, ofwel met behulp van het gescheurde monster om vastgebonden cellen te observeren of het ongedeelde monster om geïmmobiliseerde cellen te bekijken, de flowcel wordt omgekeerd en in de vochtigheidskamer geplaatst voor 20 minuten. De ongebonden cellen worden vervolgens weggewassen door middel van wikkelen door 100 microliter minimaal media. Plaats een druppel immunisatieolie in het midden van de bovenkant van het deksel.
Plaats de flowcel voorzichtig op de monsterhouder van de op maat gemaakte fluorescentiemicroscoop. Dit zou optisch contact moeten maken met de objectieflens met hoge numerieke opening. Schakel vervolgens de elektronen vermenigvuldigende camera van de microscoop in en stel de camera in om af te koelen tot min 70 graden Celsius.
De software is ingesteld om beelden te verzamelen met een typische framesnelheid van 25 hertz. In frame transfer modus. Schakel de heldere veldverlichting in en breng het beeld scherp.
Selecteer een geschikte cel of groep cellen om te worden geïmageer op basis van hun langs de lengteas vastzitten. Parallel aan het oppervlak van het deksel, pas de focus aan om ervoor te zorgen dat de 200 nanometer latexkralen die aan het oppervlak van het deksel vastzitten net scherp zijn. Verzamel een beeldsequentie in helder veld om de omtrek van het cellichaam op te nemen.
De heldere
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel toont protocollen voor single-molecuul fluorescentiemicroscopie op levende bacteriële cellen. De methode maakt de detectie, tracking en kwantificering van functionele moleculaire complexen mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Celbiologie
- Moleculair Beeldvorming
Achtergrond
- Single-molecuul fluorescentiemicroscopie maakt de observatie van individuele moleculen in levende cellen mogelijk.
- Deze techniek is essentieel voor het bestuderen van dynamische processen in cellulaire omgevingen.
- Het begrijpen van moleculaire complexen is cruciaal voor inzichten in cellulaire functies.
- Levende bacteriële cellen dienen als modelsysteem voor deze studies.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het uitvoeren van single-molecuul fluorescentiemicroscopie.
- Om onderzoekers in staat te stellen moleculaire complexen in levende cellen te visualiseren en kwantificeren.
- Om het begrip van moleculaire interacties in bacteriële cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het kweken van bacteriën die een eiwit tot expressie brengen dat is gemerkt met een fluorescerend kleurmiddel.
- Het extraheren van cellen en afkappen van flagella filamenten door schuivende bewegingen.
- Het coaten van een glazen dekglas in een flow cell om celadhesie te faciliteren.
- Het injecteren van cellen in de flow cell en het gebruik van laser excitatie microscopie voor beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van gemerkte moleculaire complexen in levende bacteriële cellen.
- Kwantificering van moleculaire interacties door middel van fluorescentie beeldvorming.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol in een levend-cel context.
- Beschikbaarstelling van een reproduceerbare methode voor onderzoekers in het veld.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde studies van moleculaire complexen in levende cellen mogelijk.
- Single-molecuul fluorescentiemicroscopie is een krachtig hulpmiddel voor cellulaire biologie.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende toepassingen in moleculaire beeldvorming.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing single molecular complexes in living bacterial cells enables mechanistic de-risking of target validation by revealing stochastic and heterogeneous dynamics masked in ensemble measurements. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing physiologically relevant, minimally perturbative observations of functional biological machines at near-native expression levels. The method enhances translational continuity from discovery through preclinical stages by delivering quantitative, reproducible data on molecular interactions in functional contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of single-molecule stoichiometry and dynamics in functional complexes.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of molecular interactions under near-native conditions, reducing reliance on overexpression artifacts.
- Strategic Value: Supports target confidence assessment by revealing heterogeneity and functional states invisible to bulk assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-precision spatial and temporal data on molecular complexes for assay benchmarking and validation.
- Operational Value: Delivers reproducible fluorescence-based outputs detectable via standard microscopy platforms.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization through quantifiable single-molecule brightness and bleaching kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining physiological relevance through genomic encoding of fluorescent tags.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of complex dynamics in live cells to inform mechanism-of-action studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular complex behavior with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-molecule resolution of target engagement and complex assembly, informing lead identification through mechanistic insights.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of molecular complex formation and disassembly in live cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of tethered or immobilized cells with quantifiable fluorescent spot detection.
- Analytics: Delivers nanometer-scale positional data and brightness trajectories for stoichiometry estimation and complex size quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving native expression levels and minimizing cellular perturbation during imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for multiple targets through adaptable fluorescent tagging and flow cell preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of stochastic molecular behavior in functional contexts.
- Operational Value: Standardization via reproducible cell preparation, flow cell assembly, and image acquisition parameters.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative single-molecule dynamics data.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, bacterial culture, and protein tagging.
- Instrumentation including high numerical aperture objectives, laser excitation, and cooled EMCCD cameras.
- Cross-team standardization of shearing protocols, flow cell preparation, and image analysis pipelines.
- Adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent tags, and target complexes.
- Practical limitations include photobleaching constraints and shear sensitivity of flagellar function.
