Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

Het belang van dit protocol is dat het een label-vrije beeldvormingstechniek introduceert die in staat is om beelden met een hoog contrast te verkrijgen bij hoge framesnelheden die eenvoudiger en goedkoper zijn dan andere technieken zoals DIC en dark field. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk te implementeren en het is gemakkelijk te gebruiken. Het is goedkoop en het kan gemakkelijk worden gecombineerd met fluorescentiemicroscopen.

De methode is ontwikkeld voor het visualiseren van individuele microtubuli. Het heeft het potentieel om te worden gebruikt voor het visualiseren van grote eiwitcomplexen en nanodeeltjes. Het grootste probleem is de activeringsenergie die nodig is om te sleutelen aan de filterkubus om de half zilveren spiegel toe te voegen.

Mijn advies aan iemand die probeert de techniek voor de eerste keer is gewoon doen. Om te beginnen plaatst u met een geschikte filterkubus een 50/50-spiegel in het filterwiel van een fluorescerende microscoop. Behandel de spiegel met zorg zo vaak hebben ze een anti-reflectie codering.

Draai naar een hoge vergroting doelstelling die ook een hoge numerieke diafragma heeft. De hier getoonde is een 100x olie doelstelling met een numerieke diafragma van 1.3. Gebruik vervolgens een scheermesje en een microscoopplaat als een rechte rand om drie millimeter brede stroken plastic paraffinefilm te snijden.

Plaats twee van de plastic paraffine film strips drie millimeter uit elkaar op een schone 22 bij 22 millimeter cover slip, dan plaats een 18 bij 18 millimeter cover slip op de top van de stroken om een kanaal te vormen. Breng de afdekslag 10 tot 30 seconden naar een warmteblok bij 100 graden Celsius om de paraffinefilm een gesloten kanaal te vormen. Met behulp van een pipet, stroom in 50 microgram per milliliter van een anti-rhodamine antilichaam door perfusie en incubeer de dia gedurende 10 minuten.

Na incubatie was je het kanaal vijf keer met gefilterde BRB80 en stroom je vervolgens in 1%Poloxamer 407 in de gefilterde BRB80 om het oppervlak te blokkeren tegen niet-specifieke binding en de dia gedurende 10 minuten uit te broeden. Nogmaals, was het kanaal vijf keer met behulp van gefilterde BRB80. Om te voorkomen dat het monster uitdroogt, voegt u twee druppels van de gefilterde BRB80 aan de uiteinden van het kanaal toe en voegt u indien nodig meer buffer toe.

Plaats het monster op het microscooppodium en zet de lichtbron van epiverlichting aan. Focus op de paraffine filmrand om het monsteroppervlak te vinden en beweeg het veld om de weergave in te stellen naar het midden van de kamer. U zult meerdere oppervlakken observeren als het doel op en neer wordt bewogen als gevolg van rugreflectie van licht van optica binnen het optische pad.

Vervolgens centreert u het velddiafragma in het gezichtsveld door het halverwege te sluiten en de afstelschroeven te gebruiken. Zodra het middenrif goed is uitgelijnd, opnieuw openen. Schuif vervolgens in de Bertrand-lens om het achterste brandvlak te bekijken, ook wel bekend als de uitgangsleerling van het doel.

Sluit het diafragmadiafragma voorbij de randen van de uitgangsleerling en gebruik de afstelschroeven om het diafragmadiafragma ten opzichte van de uitgangsleerling te centreren. Controleer door het diafragma diafragma te openen en de randen te matchen met die van de uitgangsleerling. Stel vervolgens het diafragmamembraan in op ongeveer twee derde van het numerieke diafragma van de doelstelling.

Om te beginnen stelt u de belichtingstijd van de camera in op 10 milliseconden en past u de verlichting aan om het dynamisch bereik van de camera bijna te verzadigen. Gebruik vervolgens een pipet om 10 microliter gmpcpp-gestabiliseerde microtubuli in 0,22 micrometer gefilterde BRB80 te laten stromen. Controleer de microtubuli binding op de beeldvorming van het oppervlak.

Zodra 10 tot 20 microtubuli zijn gebonden binnen het gezichtsveld, was het monster twee keer met de gefilterde BRB80. Verkrijg 10 beelden van de microtubuli door het instellen van een time lapse met een 10 milliseconde belichting en een vertragingsperiode van één seconde voor een totaal van 10 seconden. Verwerf vervolgens achtergrondafbeeldingen door het podium te verplaatsen met behulp van de podiumcontroller langs de lange as van het kanaal, terwijl u 100 afbeeldingen zonder vertraging verwerft.

Om beeld microtubbule dynamiek met behulp van de hersenen tubuline, beginnen met het instellen van de steekproef kachel temperatuur op 37 graden Celsius. Met behulp van een pipet, stroom in 10 microliters van GMPCPP-gestabiliseerde microtubuli zaden en controleren ze binding aan het oppervlak door het beeld van het oppervlak live. Zodra 10 tot 20 zaden zijn gebonden binnen het gezichtsveld, was het monster met behulp van twee keer het kanaal volume van voorverwarmde en gefilterde BRB80.

Vervolgens stroom in 10 microliter van de polymerisatiemix. Om de groei van microtubuli te meten, stelt u een timelapse in met behulp van de acquisitiesoftware om elke vijf seconden gedurende 15 minuten een beeld te verkrijgen. Verbeter het contrast door het verwerven van een gemiddelde afbeelding van 10 op elk tijdstip.

Achtergrondafbeeldingen verkrijgen zoals weergegeven in de vorige sectie. Bereken de mediaan door naar de afbeelding te gaan, stapel te selecteren, vervolgens Z-project en vervolgens mediaan. Trek de bijbehorende achtergrond af door te gaan verwerken, naar de afbeeldingscalculator te gaan en af te trekken uit het vervolgkeuzemenu.

Controleer of de optie 32-bits floatresultaat is ingeschakeld. Voor krimp van microtubulier, verwerf beelden op 100 frames per seconde door de vertraging op nul in te stellen en de belichtingstijd op 10 milliseconden te houden. Een belangrijke factor voor het verkrijgen van beelden met een hoog contrast met de interferentie inductiemicroscopie is het goed instellen van de numerieke diafragma van de verlichting.

Dit kan worden gedaan door het begeleiden van de grootte van de verlichtingsstraal bij de uitgangsleerling van de doelstelling, die wordt gecontroleerd door de diafragmagrootte. Met behulp van een monster van florescently-gelabelde gestabiliseerde microtubuli, breng de microtubuli in beeld met behulp van de focus van de microscoop knop, terwijl fluorescerend imaging hen. Stel de belichting van de camera in op 10 milliseconden en sluit het diafragma van het diafragma op de kleinste opening.

Pas ook de verlichting aan om het dynamisch bereik van de camera bijna te verzadigen of totdat het maximum is bereikt. Verkrijg 10 afbeeldingen door een gezichtsveld met 10 of meer microtubuli te streamen. Verwerf vervolgens een achtergrondafbeelding.

Verander de grootte van het middenrif en pas de verlichtingsintensiteit aan die overeenkomt met wat eerder werd bepaald. Verwerf 10 nieuwe afbeeldingen en een nieuwe achtergrond. Herhaal dit proces totdat het volledige bereik van het middenrif is voltooid.

Voor elk verworven gezichtsveld trekt u de bijbehorende achtergrond af en gemiddelde de resulterende achtergrond afgetrokken afbeeldingen zoals eerder is weergegeven. Bereken vervolgens de gemiddelde signaal-naar achtergrondruisverhouding van de microtubuli voor elke openingsgrootte. Stel de grootte van het middenrif in op degene die de verhouding hoogste signaal naar achtergrondruis produceert.

Het is mogelijk dat er een reeks maten is die vergelijkbaar contrast produceren, zoals hier wordt getoond. Met een goed uitgelijnde microscoop moeten microtubuli zichtbaar zijn zonder achtergrondaftrekken. Aftrekken van de achtergrond, echter, verbetert het contrast van de microtubbule.

Om het contrast verder te verbeteren, kunnen gemiddelden, 4a-filtering of een combinatie van beide worden gebruikt. De hier getoonde lijnscans beschrijven de incrementele verbetering van de beeldkwaliteit. Deze beschrijven een merkbare vermindering van achtergrondgeluid bij elke verwerkingsstap.

Microtubuli dynamiek kan worden gemeld in kinografen, die worden gegenereerd uit time lapse films. Een voorbeeld kinograph verworven met een framerate van 0,2 frames per seconde wordt hier weergegeven. De stippellijnen markeren de zaden.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te werken met hoge numerieke diafragmadoelstellingen. Het is ook belangrijk om de grootte van het frame van de diafragmadiameter correct uit te lijnen en in te stellen. Het is gemakkelijk om IRM te combineren met fluorescentiebeeldvorming om bijvoorbeeld microtubbulebindende eiwitten te bestuderen en hoe ze de microtubulidynamiek wijzigen.

De techniek vermindert fotoschade aanzienlijk en zorgt voor een hogere framerate-acquisitie, waardoor het gemakkelijker wordt om gelabelde biopolymeren zoals microtubuli voor langere tijd te bestuderen met een hoge temporele resolutie en een goede trackingprecisie.