Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Ondanks vele voorbeelden van coördinatie, onderzoeken de meeste studies de actine- of microtubule-eiwitten individueel. Deze methode maakt de visualisatie van beide dynamische polymeren in één reactie mogelijk. Deze techniek stelt de gebruiker in staat om diverse regulerende eiwitten te beoordelen op emergente eigenschappen die alleen kunnen worden gezien met dynamische versies van actine en microtubuli.

Deze techniek kan worden uitgebreid met lipiden of extracten om dichter bij het bouwen van een synthetische cel te komen. Begin met het ontdooien van aliquots van PEG-Silaan en Biotine-PEG-Silaanpoeders en los de PEG-poeders op in 80% ethanol om de coatingvoorraadoplossingen van 10 milligram per milliliter mPEG-Silaan en twee tot vier milligram per milliliter Biotine-PEG-Silaan te genereren. Verwijder de schone afdekslip uit de ethanolopslag met behulp van een tang.

Droog met stikstofgas en bewaar in een schone petrischaal. Bedek de afdekslips met 100 microliter coatingoplossing en incubeer ze bij 70 graden Celsius gedurende ten minste 18 uur of tot gebruik. Knip 12 stroken dubbelzijdige tape met dubbele rug tot een lengte van 24 millimeter.

Verwijder één kant van de taperug en bevestig stukjes tape naast de zes groeven die aanwezig zijn op een schone beeldkamer. Verwijder het tweede stuk taperug om de kleverige kant van de tape langs elke kamergroef bloot te leggen en plaats de kamertape met de zijkant naar boven op een schoon oppervlak. Meng epoxyhars en verharderoplossingen één-op-één in een kleine weegboot en gebruik een P1000-tip om een druppel gemengde epoxy tussen de tapestrips aan het einde van elke groef van de beeldkamer te plaatsen.

Plaats vervolgens de kamer, tape of epoxy met de zijkant naar boven, op een schoon oppervlak. Verwijder een gecoate afdekslip uit de incubator van 70 graden Celsius en spoel de gecoate en ongecoate oppervlakken van de afdekslip zes keer af met dubbel gedestilleerd water. Droog met gefilterd stikstofgas en bevestig vervolgens aan de beeldkamer met de cover slip coating kant naar de tape.

Gebruik een P200- of P1000-pipetpunt om druk uit te oefenen op de interface van getapete glas om een goede afdichting tussen de tape en de afdekslip te garanderen. Incubeer de geassembleerde kamers bij kamertemperatuur gedurende ten minste vijf tot 10 minuten om de epoxy in staat te stellen de kamerputten volledig af te dichten voor gebruik. Perfusiekamers verlopen binnen 12 tot 18 uur na montage.

Gebruik een perfusiepomp en wissel sequentieel conditioneringsoplossingen uit in de perfusiekamer door 50 microliter van 1% BSA te laten stromen om de beeldkamer te primen. Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir van de kunstaasvergrendeling. Laat vervolgens 50 microliter van 0,005 milligram per milliliter streptavidin stromen en incubeer gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir. Stroom 50 microliter van 1% BSA om de niet-specifieke binding te blokkeren en gedurende 10 tot 30 seconden te incuberen. Verwijder de overtollige buffer uit het reservoir.

Vervolgens vloei 50 microliter warme 1x TIRF-buffer en vervolgens 50 microliter gestabiliseerde en 50% gebiotinyleerde microtubulizaden verdund in 1x TIRF-buffer. Stel het podium of het objectiefverwarmingsapparaat in om de temperatuur van 35 tot 37 graden Celsius gedurende 30 minuten te handhaven voordat de eerste biochemische reactie in beeld wordt gebracht. Stel vervolgens het acquisitie-interval in op elke vijf seconden gedurende 15 tot 20 minuten.

Stel vervolgens 488 en 647 laserblootstellingen in op 50 tot 100 milliseconden bij 5% tot 10% vermogen door eerst de polymerisatiereactie aan te passen om de actinefilamentassemblage te initiëren. Verkrijg de beelden op 647 nanometer en breng de juiste aanpassingen aan. Pas vervolgens de polymerisatiereactie aan in een tweede geconditioneerde perfusieput om de assemblage van microtubuli te initiëren.

Visualiseer op 488 nanometer en breng de juiste aanpassingen aan. Combineer drie microliter van 10 micromolair 488 tubuline met de 7,2 microliter aliquot van 100 micromolair fluorescerend ongelabeld tubuline niet meer dan 15 minuten voor gebruik. Combineer vervolgens drie microliter verdunde biotine-gerelateerde actine in geschikte volumes fluorescerend ongelabeld en gelabeld actine, zodat de uiteindelijke mix 12,5 micromolair totaal actine zal zijn met 10% tot 30% fluorescerend label.

Bereid het cytoskeletmengsel door twee microliter van de 12,5 micromolaire actinemix niet meer dan 15 minuten voorafgaand aan de beeldvorming te combineren met de tubuline-bouillonmix. Bewaren op ijs tot gebruik. Bereid de eiwitreactiemix voor door alle andere experimentele componenten en eiwitten te combineren, waaronder 2x TIRF-buffer, antibleekmiddel, nucleotiden, buffers en accessoire-eiwitten.

Incubeer het cytoskeletmengsel en de eiwitreactiemix afzonderlijk bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 seconden. Om de reactie in gang te zetten, voegt u de inhoud van het eiwitreactiemengsel toe aan het cytoskeletmengsel en mengt u het. Stroom 50 microliter van het reactiemengsel met 1x TIRF-buffer aangevuld met 15 micromolaire vrije tubuline, één millimol gtp, 0,5 micromolaire actinemonomeren en geschikte volumes bufferregelaars naar de perfusiekamer.

Neem een time-lapse-film op met behulp van microscoopsoftware om elke vijf seconden gedurende 15 tot 20 minuten te verkrijgen. Conditioneer een nieuwe perfusieput en vervang het buffervolume door het regulerende eiwit van belang en buffercontroles. Verwerven om de regulerende eiwitten voor emergente actine microtubule functies te beoordelen.

Voorbeeldmetingen van microtubuli en actinefilamentdynamiek worden in deze afbeeldingen getoond. De gemiddelde tijdprojectie van het tubulinekanaal visualiseert efficiënt de totale microtubulilengtes voor de lijnscans die worden gebruikt om de Kymograafplots te genereren. Zwarte stippellijnen komen overeen met de twee voorbeeld Kymografen van de dynamische microtubuli.

De groei- en demontagefasen van microtubuli worden op elke Kymograaf weergegeven. Twee voorbeelden van timelapse-beeldmontages van enkele actinefilamenten die actief polymeriseren, worden hier weergegeven. Reksnelheden worden berekend als de helling van de plots van de lengte van actinefilamenten in de loop van de tijd per micromolaire actine.

Er moet dus een correctiefactor van twee worden toegepast op 0,5 micromolaire actinereacties om de snelheden te vergelijken die typisch worden bepaald bij de ene micromolaire actineconcentratie. Voorbeelden van vijf filamenten worden hier getoond. Totale interne reflectiefluorescentie, of TIRF-beelden van de dynamische microtubuli in actinefilamenten die polymeriseren in afwezigheid of aanwezigheid van 250 nanomolaire Tau worden hier weergegeven.

Blauwe stippellijnen en pijlen markeren dat er een lijn is getekend voor de lijnscanplots die overeenkomen met elke voorwaarde. Overlap tussen de microtubuli in de actineregio's kan worden gescoord op een bepaald tijdstip per gebied. Cytoskeletale eiwitten, met name actine, microtubuli en hun regulatoren zijn erg gevoelig voor vries- / dooicycli.

Gebruik voor consistentie en succes zeer zuivere en goed opgeslagen eiwitten.