Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens
17 december 2015
Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.
Het algemene doel van dit experiment is om de dynamica van corticale actine te kwantificeren door middel van beeldcorrelatiespectroscopie na aanschaf door totale interne reflectie, gestructureerde belichtingsbeeldvorming of turf sim. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biofysica, zoals welke rol corticale actine stroom heeft bij het reguleren van interacties in de immunologische synaps. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat deze nanometer schaalresolutie combineert met compatibiliteit met levensstijl, waardoor kleinere schaalprocessen kunnen worden waargenomen en geanalyseerd in vergelijking met conventionele instantiemicroscopietechnieken.
George Ashdown, een promovendus uit mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Voeg voor een testmonster vijf microliter van een subdiffractie fluorescente microsfeer stockoplossing met een diameter van 100 nanometer toe aan het oppervlak van een verse ongecoate deksel. Verspreid vervolgens de microsfeer oplossing over het deksel met een pipettenpunt en laat het drogen.
Voeg 200 microliter montagemedium toe aan het testdeksel om voorbereiding voor beeldvorming te beginnen, zet de incubatie aan voor de trapverwarming van het turf SIM systeem en vul de reservoir met gedistilleerd water om de basis van het verwarmingselement volledig te bedekken. Laat het water gelijkmatig worden naar 37 graden Celsius. Verbind de verwarmingskraag met het objectief en stel deze in op 37 graden Celsius.
Bevestig vervolgens de turf 4 88 compatibele gradatieblok in de lichtbaan van de microscoop om ervoor te zorgen dat de juiste optische baan is geactiveerd. Schakel de kanaalmodus op de laserbed naar de enkele positie. Herhaal deze actie voor de glasvezelkabel op de microscooptrap.
Verwacht een foutmelding in het softwarevenster als deze stappen niet worden uitgevoerd. Nadat de modus is ingesteld, verlaagt u het objectief naar het laagste Z-vlak en plaatst u een druppel olie erop. Plaats het testmonsterdeksel met de fluorescente microsferen op de microscooptrap.
Selecteer vervolgens de perfecte focus systeem of PFS functie op de microscoopbehuizing. Beweeg het objectief geleidelijk omhoog door het Z-vlak en stop wanneer de PFS knop ophoudt te knipperen, wat aangeeft dat het brandpuntsvlak is bereikt in de besturingssoftware. Schakel over naar live view om de microsferen op het scherm weer te geven.
Maak fijne aanpassingen aan de focus door de PFS micro manipulator wiel te gebruiken. Observeer een uniforme verlichting zonder uit-focus fluorescente inzending boven de 75 nanometer geurgolf. Bevestig ten slotte dat gestructureerde verlichting is bereikt door een fluctuerend verlichtingspatroon te observeren van het fluorescente microsfeer monster voor T-celstimulatie cope de kamers van een acht.
Dek het putje af met 200 microliter van een anti CD drie en anti CD 28 antilichaammengsel en incubeer het deksel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Nadat het deksel is gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol, plaats het op de microscooptrap en zoek vervolgens de turf brandpunt. Pipetteer vervolgens voorzichtig 200 microliter van getransfecteerde T-cellen in een van de putjes op het deksel.
Gebruik epifluorescentie om de GFP-actine getransfecteerde cellen te volgen terwijl ze op het deksel landen. Zodra de cellen zijn bezonken, schakel over naar live modus met behulp van de N SimPad en controleer of de cellen op de monitor scherp staan. Om een tijdsverloop op te nemen, opent u het ND acquisitievenster en selecteert u het tijdtabblad.
Klik vervolgens op toevoegen en stel het interval in op geen vertraging. Stel de duur in op 10 minuten. Start ten slotte de registratie van de gegevens door in het ND-acquisitievenster Nu uit te voeren te selecteren.
Om de afbeeldingen te reconstrueren, opent u eerst de analysesoftware die de juiste analysemodule bevat. Klik op toepassingen en selecteer vervolgens het toon eindsim venster. Stel de modulatiecontrast van de verlichting en hoge resolutie ruisonderdrukking in op één en reconstrueer de turf SIM dataset om een complete SIM-afbeelding te produceren vanaf de beeldstatusbalk.
Bevestig dat de pixelgrootte 30 nanometer is en exporteer vervolgens de gegevens als TIF-bestanden voor stickanalyse. Nadat u de sticks MATLAB softwarepakket hebt gedownload en uitgepakt, opent u het script. Definieer vervolgens de invoerparameters zoals beschreven in het tekstprotocol voor de immobiele verwijderingsfilter.
In regel 23, stel de filterparameter in op bewegend gemiddelde en gebruik in regel 24 21 als de bewegende gemiddelde parameter om één vectorkaart te genereren. Stel de temporele subregio in regel 31 in op het maximale aantal frames, in dit geval 63. Stel vervolgens in regel 32 de temporele verschuiving in op één in regels 33 tot en met 35.
Voer de namen van de uitvoerbestanden in, de titels van de uitvoervectorkaarten en het uitvoerpad van de directory. Definieer vervolgens het formaat waarin de vectorkaartafbeeldingen moeten worden opgeslagen. In dit geval png.
Open in het MATLAB editorvenster het script. Voer één kanaalsticks uit en laad de beeldserie door lijnen één tot en met 23 van het script uit te voeren. Voer vervolgens lijnen 29 tot en met 35 van één kanaalsticks uit.
Om de stickanalyse te starten, volg de prompt en selecteer een polygoon om een gebied van interesse of ROI te definiëren, indien gewenst. Om de vectorkaarten weer te geven, voert u lijnen 38 tot en met 52 uit. Voer vervolgens lijnen 53 tot en met 72 uit om de snelheidsmagnitude histogram weer te geven die hier is weergegeven, een OT T-cel die GFP gelabeld F-actine uitdrukt, die is geïmagerd met het turf sim-protocol.
Beschaving in de tekst vijf minuten nadat deze cel werd geïntroduceerd op een deksel bedekt met anti CD drie en anti CD 28 antilichamen bedoeld om de vorming van immunologische synapsen te stimuleren. Er werd een tijdsverloop van genomen, zodat de moleculaire stroom van f-actine kon worden gevisualiseerd. Nadere analyse van deze gegevens met behulp van dit sticks programma maakte de kwantificering van F-actine moleculaire stroom mogelijk, zoals afgebeeld door de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de dynamiek van corticaal actine bij de immunologische synaps van T-cellen met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken. Door gebruik te maken van super-resolutie live-cell imaging en total internal reflection fluorescence worden de stroomsnelheden en de directionaliteit van filamenteus actine gekwantificeerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Corticaal actine speelt een cruciale rol bij cellulaire interacties.
- Inzicht in de actinedynamiek kan licht werpen op immunologische processen.
- Conventionele microscopietechnieken leggen kleinschalige processen mogelijk niet effectief vast.
- Beeldcorrelatiespectroscopie biedt een nieuwe benadering om deze dynamiek te bestuderen.
Doel van de studie
- Om de stroom van corticaal actine bij de immunologische synaps te kwantificeren.
- Om de rol van actine bij de regulatie van T-celinteracties te onderzoeken.
- Om de voordelen van geavanceerde beeldvormingstechnieken aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Superresolutie-beeldvorming van levende cellen
- Totale interne reflectie-fluorescentie
- Spatio-temporele beeldcorrelatiespectroscopie
- Beeldvorming met gestructureerde illuminatie
Belangrijkste resultaten
- Stroomsnelheden en de directionaliteit van filamenteus actine werden succesvol gekwantificeerd.
- De studie leverde inzichten op in de dynamiek van actine bij de immunologische synaps.
- Geavanceerde beeldvormingstechnieken onthulden fijnere details in vergelijking met conventionele methoden.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van T-celactivatie en -interactie.
Conclusies
- De combinatie van beeldvormingstechnieken verbetert de studie naar actinedynamiek.
- De bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar immuunresponsen informeren.
- Verdere verkenning van de rol van actine zou kunnen leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Het kwantificeren van de corticale actinestroom bij de immunologische synaps biedt mechanistisch inzicht in de T-celactivatie, een kritiek proces bij de modulatie van de immuunrespons. Deze mogelijkheid ondersteunt de validatie van targets door cytoskeletdynamiek te koppelen aan de resultaten van receptorsignalering, waardoor het risico van immunomodulerende drugcandidates kan worden verminderd. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve data met sub-diffractieresolutie te leveren over de proteinstroomdynamiek die relevant is voor de vorming en stabiliteit van de synaps.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar actinestroom mogelijk als regulator van de stabiliteit van de immunologische synaps en de efficiëntie van signalering.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve snelheidshistogrammen en vectorkaarten om cytoskeletdynamiek te correleren met functionele immuunoutputs.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesetesten van cytoskeletdoelen in T-cel-gemedieerde pathways voor screening van immunomodulatoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen van de richting en grootte van de F-actine-stroom onder gestimuleerde omstandigheden.
- Operationele waarde: Levert kwantificeerbare resultaten (snelheidshistogrammen, vectorkaarten) die geschikt zijn voor high-content analyse en het benchmarken van assays.
- Strategische waarde: Maakt screening mogelijk van verbindingen die de retrograde actine-stroom moduleren als functionele readout voor immunomodulerende activiteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt de dynamiek van de actinnestroom met de vorming van de immunologische synaps, een sleutelgebeurtenis bij T-celactivatie en antigeenpresentatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt het modelleren van ziekte-relevante systemen door cytoskeletresponsen in primaire of gemanipuleerde T-cellen te kwantificeren.
- Strategische waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie van biologicals of kleine moleculen die gericht zijn op immuuncheckpoints of adhesiepaden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door kwantitatieve imaging-uitlezingen te bieden die een brug slaan tussen moleculaire dynamiek en functionele immuunresponsen, wat de overgang van target engagement naar fenotypische screening ondersteunt.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk van de rol van actine bij de regulatie van receptorclustering en signaaltransductie bij de immuunsynaps.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve stroommetrieken die de reproduceerbaarheid van assays en de vergelijking van compound-effecten ondersteunen.
- Analytics: Produceert snelheidshistogrammen en vectorkaarten die statistische vergelijking van stroomcondities tussen experimentele groepen mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt cytoskeletdynamiek met synaptische stabiliteit, wat de continuïteit ondersteunt van ontdekking tot preklinische validatie van immunomodulatoren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare imaging- en analysepipeline voor het bestuderen van cytoskeletdynamiek in immuuncellen en andere celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de actine-gemedieerde regulatie van de vorming van de immuunsynaps en de signaalvoortplanting.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde beeldacquisitie- en STICS-gebaseerde kwantificeringsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door cytoskeletmodulatie in een vroeg stadium van ontdekking te koppelen aan functionele immuunuitkomsten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van effecten op actine-stroomdynamiek in ziekterelevante T-celmodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in superresolutie-imaging van levende cellen en analyse via beeldcorrelatiespectroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot gestructureerde illuminatiemicroscopie en compatibele computationele tools voor STICS-verwerking.
- Vereist standaardisatie van celpreparatie, stimulatie en imaging-condities voor reproduceerbare stroommetingen.
- Aanpassing aan primaire T-cellen of ziektegegevens kan optimalisatie van transfectie- en stimulatieprotocollen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op fotobleken tijdens langdurige time-lapse acquisitie en variabiliteit in de selectie van de ROI bij het genereren van vectorkaarten.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Microscope Set-up
3:20
Cell Imaging
4:44
Structured Illumination Microscopy (SIM) Image Reconstruction and Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy (STICS) Analysis
7:12
Results: Representative Structured Illumination Data and STICS Output
8:36
Conclusion
