Name: Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer corticale actine-dynamiek kwantificeren in T-cellen met ruimtelijke en temporele beeldcorrelatiespectroscopie. Deze methode combineert nanometerschaalresolutie met levende-celcompatibiliteit voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.M.O. erkent de European Research Council-subsidie nr. 337187 en de Marie-Curie Career Integration Grant nr. 334303. P.W.W. erkent het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant-programma.

Opmerking: Stages 1 en 2 vinden plaats voor de dag van beeldvorming; ervoor zorgen dat alle media en supplementen om te worden gebruikt voor of op de dag van beeldvorming zijn evenwicht gebracht. Evenwichtstoestand is bereikt door verwarming van media en supplementen tot 37 ° C in een incubator ingesteld op 5% CO2. Alle celcultuur werk en dekglaasje plating stappen vinden plaats in steriele omstandigheden onder een laminaire stroming kap. 1. celtransfectie <ol><li> Transfecteren de T-cellen af ​​te beelden 24 uur voor het experiment met een plasmide dat codeert voor een fluorescent fusieconstruct van F-actine labeling GFP en beeldvorming. Opmerking: De cellen worden gesplitst 24 uur voor transfectie (48 uur voorafgaand aan beeldvorming) te garanderen cellen bij een optimale gezondheid en in hun logaritmische groeifase. <ol><li> Plaats 5 ml RPMI supplement (RPMI 1640 plus 10% FBS en 1% Pen-Strep (optioneel)) in een enkel putje van een 6-wells plaat in de incubator equilibreren. </li><li> Pellet 2 x 10 7 T-cellen cultreerd bij 37 ° C 5% CO2 in RPMI supplement met een centrifugebuis bij 327 g gedurende 5 minuten en was in een gelijk volume van voorverwarmde media elektroporatie. Opmerking: Electroporation medium is een gereduceerd serum medium met buffers en supplementen (zie consumables). </li><li> Na opnieuw het pelleteren bij 327 xg gedurende 5 min, resuspendeer de cellen in 500 pl elektroporatie media en langzaam aan een cuvette, voeg 5 ug van het plasmide PCR graad dH 2 O labeling F-actine. </li><li> Tik de cuvette op de kap werkruimte om verwijdering van luchtbellen in de media, die boog van de stroom kan leiden en aan de cellen gelijkmatig te verdelen binnen de media te verzekeren. </li><li> Zet de elektroporatie apparatuur en ingesteld voltage op 300 V en capaciteit tot 290 Ω. Electroporate monster met behulp van een exponentiële verval van 20 msec. Opmerking: optimalisatie kan vereist zijn voor verschillende cellen en verschillende plasmide constructen. </li><li> Nadat het transfectie protocolcompleet, slaan de cellen op ijs gedurende 1 minuut voordat u verder gaat. </li><li> Breng voorzichtig de cellen van de cuvette met de 6-wells plaat met 5 ml geëquilibreerd RPMI supplement uit stap 1.1.1. </li><li> Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C + 5% CO2. </li></ol></li></ol> 2. Coat Dekglaasjes en Pre-warm Imaging Supplement <ol><li> Coat dekglaasjes met antilichamen voor T-cel stimulatie induceren. <ol><li> Jas iedere kamer van een 8-well dekglaasje met 1 ug / ml aCD3 en αCD28 in 200 pi PBS. </li><li> Bewaren bij 4 ° CO / N. Alternatief, laag dekglaasjes 2 uur voorafgaand aan beeldvorming en in een incubator bij 37 ° houden C drift te verminderen tijdens het beeldvormingsproces door het minimaliseren van temperatuurveranderingen op het dekglaasje. </li></ol></li><li> Maak een dekglaasje proefmonster met 0,1 micrometer sub-diffractie fluorescerende microbolletjes. <ol><li> Draaikolk voorraad oplossing van kralen klonten voorkomen. </li><li> Op een nieuwe, schone dekglaasje van the hetzelfde type als gebruikt in stap 2.1.1 Pipetteer 5 ul fluorescerend microbolletje voorraadoplossing op het oppervlak (volgens de instructies van de fabrikant). </li><li> Verspreid microsfeer oplossing over het dekglaasje met een pipet tip. </li><li> Laten drogen, vervolgens 200 gl fixeermiddel zoals PBS toepassing. Let op: de montage medium moet overeenkomen met die gebruikt worden voor de beeldvorming cel monsters. </li></ol></li><li> Equilibreren HBSS (+ 20 mM HEPES, hierna &quot;HBSS supplement &#39;) in een centrifugebuis door in een incubator voorverwarmen O / N bij 37 ° C + 5% CO2. Let op: de toevoeging van HEPES buffer is om CO 2, bij gebruik van een incubatiekamer met CO 2-ingang sla deze suppletie. </li></ol> 3. Microscoop Set-up <ol><li> Zet het podium-top incubator van de TIRF-SIM microscoop en plaats voldoende water in het reservoir van de microscoop doorgronden van de voet van het verwarmingselement. Laat het water equilibrate tot 37 ° C. Voeg de verwarmingsmanchet de objectieflens, ook ingesteld op 37 ° C. Opmerking: Vanwege de gevoeligheid van de set-up, zijn deze stappen eerder gedaan &#39;s nachts, zodat de optische componenten zijn bij een stabiele temperatuur voorafgaand aan de beeldvorming. </li><li> Plaats de TIRF 488 compatibele raspen blok in het lichtpad van de microscoop en vast te zetten. <ol><li> Schakel de kanaal modus en de glasvezelkabel naar de &#39;Single&#39; positie op de laser bed en microscoop podium respectievelijk om de juiste optische pad voor de TIRF-SIM-modus in te schakelen. Opmerking: sla deze stap leidt tot een fout (figuur 1A) binnen de softwarevenster. </li></ol></li><li> Zet alle microscoop en computer componenten en de overname besturingssoftware openen. <ol><li> Open het OC panel, Ti Pad, N-SIM-Pad en ND Acquisition vensters (Figuur 1B). In de &#39;OC Panel&#39; de optie &#39;TIRF 488&#39; (Figuur 2B, gele pijl). </li&gt; <li> In het venster N-SIM-Pad, selecteert u de &#39;Moving&#39; settings (figuur 2C, gele pijlen) TIRF-SIM &#39;en. Selecteer de knop Instellingen (figuur 1C, gele doos) en selecteer &#39;TIRF 488 (voor 100x TIRF 488nm)&#39; uit het dropdown-menu, klik op &#39;Apply&#39; en &#39;OK&#39;. </li><li> Stel de camera-instellingen binnen de &#39;DU897 instellingen&#39; aan: Frame Rate 50 msec, afleestoestand, EM Gain 3 MHz 14-bit, en EM Gain Multiplier 300 met een Conversie Gain van 1 (figuur 1C, groene doos). Opmerking: zie representatieve resultaten voor de frame rate overwegingen. </li><li> Kalibreer belicht microscoop voor TIRF-SIM door 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF doelstelling selecteren, op het &quot;N-SIM Pad&quot; zet de 488 nm laservermogen tot 10%. Opmerking: Pixel grootte van de ruwe beelden is 60 nm, met een 512 x 512 pixel gezichtsveld. </li><li> Reinig het objectief met behulp van de lens weefsel om stof en olie te verwijderen. </li></ol></li&gt; <li> Vind de TIRF-SIM focal plane. <ol><li> Beginnen met het doel in de laagst mogelijke z-vlak. Breng een druppel olie op de lens objectief en voeg de fluorescerende microsfeer monster uit stap 2.2 de microscoop podium. </li><li> Selecteer de Perfect Focus System (PFS) functie op het lichaam van de microscoop. </li><li> Bewegen langzaam het doel omhoog door de z-vlak tot de PFS-knop stopt met knipperen om de focal plane bevestigen is bereikt. </li><li> Overschakelen op &#39;Live&#39; zicht op de besturingssoftware en het imago van de microbolletjes voor de laatste aanpassingen gemaakt met behulp van de PFS micro-manipulator wiel. </li></ol></li><li> Let op de gelijkmatige verlichting zonder out-of-focus fluorescentie-emissie boven de 75 nm uitdovende golf. Opmerking: Bevestig gestructureerde verlichting wordt vervuld door het observeren van een wisselende belichting patroon uit de fluorescerende microsfeer monster. </li><li> Meet fluorescerende microbolletjes monster en kwantificeren van de verbeterde beeldvorming Resolution door het observeren van de breedte op halve hoogte (FWHM) van het intensiteitsprofiel. <ol><li> Open de Analyze software (v4.20.01), met de NOS-N-SIM Analysis module geïnstalleerd en selecteer &#39;Applications&#39; -&gt; &#39;Toon N-SIM-venster&#39;. </li><li> Met de verlichting modulatie contrast (IMC) en hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) ingesteld op 1 voor TIRF-SIM datasets (figuur 2), te reconstrueren beeld microsferen monster om een gereconstrueerd beeld van 1024 x 1024 pixels genereren met een pixelgrootte van 30 nm. </li><li> Met behulp van de lijn profiel tool met een breedte van 1 pixel (Figuur 3A, gele doos), trek een lijn door het midden van een enkele microsfeer. </li><li> Selecteer de FWHM knop (figuur 3B, geel vakje) en klik op de intensiteit maxima van de Gauss distributie, gevolgd door de intensiteit minima. </li><li> Controleer de FWHM van de microsfeer in het bereik van 100 nm (figuur 3C). Opmerking: de resolutie achieved bij beeldvorming biologische monsters is afhankelijk van de signaal-ruisverhouding van merkingsrendement en achtergrondfluorescentie. </li></ol></li></ol> 4. Monstervoorbereiding for Imaging <ol><li> Coverslip voorbereiding. <ol><li> Ophalen αCD-gecoate dekglaasje uit stap 2.1 van de koelkast of incubator en verwijder PBS met aCD3 en αCD28 uit elk putje. </li><li> Voeg 200 ul voorverwarmde HBSS supplement van stap 2,3 aan elk putje van het dekglaasje. Wassen en te verwijderen om ervoor te zorgen minimale aCD3 en αCD28 blijft in oplossing. Voeg nog 200 ul van HBSS aanvulling op het dekglaasje putjes. </li><li> Reinig de onderzijde van het dekglaasje met lens tissue olie en deeltjes te verwijderen. </li></ol></li><li> Positie dekglaasje op de microscoop podium en vind de TIRF brandvlak van het dekglaasje met behulp van de PFS z-vlak als in stap 3.4. </li><li> Celpreparaat. <ol><li> Pipet 200 ul van de media conbevattende getransfecteerde cellen uit stap 1.1.8 in een micro-centrifugebuis. </li><li> Pellet cellen in een micro-centrifuge bij 268 xg gedurende 20 seconden en verwijder de cel media. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul voorverwarmde HBSS supplement vanaf stap 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Imaging Cellen <ol><li> Take-cel met HBSS aanvulling op de microscoop en voorzichtig pipetteren 200 ul in een van de wells. </li><li> Terwijl die nog in de TIRF focal plane op het dekglaasje (in de PFS-modus), met de microscopen oculair en epifluorescentie verlichting te fluorescerende cellen naderen van de dekglaasje volgen. </li><li> Zodra de cellen landen op de dekglaasje, over te schakelen naar &#39;Live&#39; modus in de N-SIM-Pad om het beeld te brengen op de monitor en controleer of de cellen in de focus op het computerscherm. </li><li> Om tijd-cursussen te nemen, het venster ND Verwerving en selecteer het tabblad &#39;Time&#39;, klikt u op &#39;Toevoegen&#39; en stel &#39;Interval&#39; om Geen vertraging, &#39;Duur&#39;tot 10 min, &#39;Loops&#39; op 1. Opmerking: Duur kan worden gewijzigd, afhankelijk van het proces van belang; de Stokjes software kan halen kwantitatieve resultaten met afbeelding stapels van ≈10 frames wanneer gevangen met &#39;No Delay&#39;. </li><li> Met identieke overname instellingen naar de kraal monster, beginnen met het opnemen van gegevens door het selecteren van &#39;nu Run&#39; in het venster ND Acquisition. </li></ol> 6. Reconstructing SIM Afbeeldingen <ol><li> Na beeldvorming is voltooid, opent de Analyze software (v4.20.01), met de NOS-N-SIM Analysis module geïnstalleerd en selecteer &#39;Applications&#39; -&gt; &#39;Toon N-SIM-venster&#39;. </li><li> Met de belichting modulatie contrast (IMC) en hoge resolutie ruisonderdrukking (HRNS) ingesteld op 1 voor TIRF-SIM datasets (figuur 2), reconstrueren één (of meerdere met het Batch tool) ruwe SIM bestand naar een gereconstrueerd beeld SIM produceren. </li><li> Bevestig de gereconstrueerde bestand heeft een pixelgrootte van 30 nm, die in deimage statusbalk. Opmerking: pixelgrootte geen invloed Stokjes analyse, maar het moet ten minste 2x kleiner in omvang dan de PSF ruimtelijke resolutie in om het ruimtelijk verband tussen pixels te waarborgen. </li><li> De gegevens te exporteren als .tiff bestanden, klaar voor Stokjes analyse. </li></ol> 7. Stokjes Analyse <ol><li> Download en pak de STIC (C) S Matlab softwarepakket (Wiseman lab; beschikbaar als aanvullende informatie). Het script stics_vectormapping.m is de kern van een enkel kanaal Stokjes analyse en de eerste 30 regels code worden gebruikt om de input parameters te definiëren als bedoeld in artikel 2.1 van de handleiding. Open deze script en definiëren de input parameters voor TIRF-SIM data-analyse. Er wordt voorgesteld om ook de S folder STIC (C) toe met submappen aan de lokale machine Matlab pad, zoals beschreven in de bijlage van de handleiding. <ol><li> Definieer de input parameters voor de data-analyse door het bewerken van de desbetreffende regels van de code </li><li> Om ana voerenlysis van de TIRF-SIM data genereren 1 vector kaart, stelt de tijdelijke parameters tijdelijke subregio in de lijn 31 om het maximale aantal frames en de tijdelijke verschuiving in de lijn 32 naar 1. Om een ​​tijdreeks van vector kaarten te verkrijgen variëren van deze parameters . </li><li> Voor de immobiele verwijderen filter, stel de parameter &#39;filtering&#39; (lijn 23) naar &#39;Moving gemiddeld&#39; en stel parameter &#39;MoveAverage&#39; (lijn 24) naar 21. Opmerking: Deze instelling is aangetoond werken langzamer bewegende en grote fluorescentiesignalen, aangezien het berust op het aftrekken serie frames uit het frame worden geanalyseerd. </li><li> Verander lijnen 33-38 om de naam van de output bestanden en titels van de output vector kaarten, evenals de output directory pad te stellen en te bepalen in welk formaat de vector kaart afbeeldingen moeten worden opgeslagen. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Pixelgrootte (pm) </td><td> 0,03 micrometer </td><td> Lijn 19 </td></tr><tr><td> Frame rate (sec) </td><td> 1 seconde </td><td> Lijn 20 </td></tr><tr><td> Maximale vertragingstijd (frames) </td><td> 20 frames </td><td> Lijn 21 </td></tr><tr><td> Subregio grootte (pixels) </td><td> 8 pixels </td><td> Lijn 29 </td></tr><tr><td> Subregio afstand (pixels) </td><td> 1 pixel </td><td> Lijn 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Open het script run1ChannelSTICS in het venster Matlab editor. Laad de afbeelding serie van lopende sporen 1-23 van dit script. Opmerking: Dit script kan worden gebruikt voor het laden en pre-proces afbeelding serie, plot van de vector kaarten en snelheid histogrammen en uitvoeren van een batch processing te veel bestanden. Indien nodig, bij te snijden op de afbeelding om een ​​gebied van belang met behulp van de lijn 24-26 van dit script. <ol><li> Run lijnen 29-35 van run1ChannelSTICS om Stokjes analyse beginnen. Wanneer u wordt gevraagd, selecteert u een polygoon tot een bepaalde regio van belang (ROI) te geven, indien gewenst. Zorg ervoor dat de ROI niet overlapt met de cel rand, zoals grens artefacten optreden wanneer Stokjes analyseert deze reregio&#39;s. </li><li> Lopen lijnen 38-52 om de vector kaarten weer te geven. Om de snelheid magnitude histogram plot, lopen lijnen 53-72. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li>
<li>Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+interaction+between+T+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific interaction between T and B cells.</a> Nature. 314, 537-539 (1985).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+antigen+recognition+by+naive+CD4%2B+T+cells%3A+compulsory+cytoskeletal+alterations+for+the+triggering+of+an+intracellular+calcium+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response.</a> European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophysical Journal. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Flow+Quantified+beyond+the+Diffraction+Limit+by+Spatiotemporal+Image+Correlation+of+Structured+Illumination+Microscopy+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Flow Quantified beyond the Diffraction Limit by Spatiotemporal Image Correlation of Structured Illumination Microscopy Data.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 21-23 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+integrin-actin+linkage+using+high-resolution+protein+velocity+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping.</a> Journal of Cell Science. 19 (24), 5204-5214 (2006).</li>
<li>Yi, J., Xufeng, S. W., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li>
<li>Watanabe, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+speckle+analysis+of+actin+filament+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia.</a> Science. 8 (5557), 1083-1086 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Deze techniek zal de onderzoekers om de afbeelding toe te staan ​​en te kwantificeren eerder onoplosbare informatie in cellen die fluorescentie. In onze resultaten laten we zien dat F-actine stromen op symmetrische wijze uit de cel periferie naar het centrum van de cel T-cel IS. Deze bevindingen komen overeen met eerdere resultaten uit 1D lijnprofiel kymograaf data 13 en de capaciteit van de analyse uit te breiden naar 2D en super-resolutie data. De gepresenteerde techniek is een ...

Het doel van het experiment is het beeld en karakteriseren van de moleculaire stroom filamentous- (F-) actine in levende T-cellen, dan de diffractielimiet om stromingsrichting en de omvang vast tijdens immunologische synapsen (IS) formatie. Deze techniek wordt uitgevoerd met een gestructureerde belichting microscoop (SIM) in de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) modus beeldvorming Jurkat T-cellen die een kunstmatige synaps het activeren dekglaasjes bekleed met anti-CD3 en anti-CD28-antilichamen. De IS vormen tussen een T-cel en zijn doel; een antigeen presenterende cel (APC) van T-celreceptor (TCR) activatie 1,2. Aangezien dit de eerste stap bij het bepalen of het adaptieve immuunsysteem genereert een immuunreactie op een infectie, kunnen de gevolgen van onjuiste respons op stimuli een aantal ziekten. Het belang van de T-cel-APC interactie goed gedocumenteerd, maar de rol (len) van het rijpe IS na de eerste TCR signaal internalisatie zijn nog niet volledig begrepen. Aangezien het cytoskelet wordt gedacht dat twee processen verbonden TCR activering (beweging van de moleculen aan het plasmamembraan en de controle van signaalmoleculen afhankelijk van het actine cytoskelet 3,4), begrijpen hoe het cytoskelet herschikt ruimtelijk en temporeel steun de stappen verhelderen moleculaire reorganisatie gedurende synapsvorming. De retrograde stroom F-actine wordt gedacht dat TCR clusters kraal naar het midden van de immunologische synaps wordt deze translocatie verondersteld essentieel voor signaal beëindiging en recycling worden; helpen de fijne balans van T-celactivering 5. Terwijl de standaard fluorescentie microscopie is een flexibel instrument dat blijft inzicht over de vele evenementen, waaronder biologische cel-cel interacties, wordt beperkt door het vermogen van het systeem om nauwkeurig te lossen meerdere fluoroforen woonachtig dichterbij dan de diffractielimiet (≈200 nm) van elkaar. Zoveel moleculaire gebeurtenissen in cellen betrekken dichte populaties van moleculen en vertonen dynamische omlegging hetzij in rust of bij specifieke stimulatie, maakt conventionele lichtmicroscopie geen volledig beeld. Het gebruik van superresolutie beeldvorming heeft toegestaan ​​onderzoekers om de diffractielimiet behulp van een verscheidenheid aan technieken te omzeilen. Enkel molecuul lokalisatie microscopie (SMLM) zoals PALM en STORM 6,7 heeft de mogelijkheid om de locatie van moleculen opgelost tot een nauwkeurigheid van ongeveer 20 nm, maar deze technieken afhankelijk langere opnametijden, opbouw van een beeld op vele frames . In het algemeen vereist dit monsters vast te stellen of voor structuren om lage mobiliteit vertonen dus enkele fluoroforen worden niet geïnterpreteerd als meerdere punten. Terwijl de gestimuleerde emissie uitputting (STED) beeldvorming maakt super-resolutie door zeer selectieve confocale excitatie 8, de vereiste scannenbenadering kan langzaam over heel cel gezichtsvelden zijn. STED toont ook significant fototoxiciteit hogere resoluties vanwege de vermogenstoename van de uitputting bundel. Gestructureerde verlichting microscopie (SIM 9) biedt een alternatief voor deze methoden, die in staat van een verdubbeling van de resolutie van een standaard fluorescentie microscoop en is compatibel met live cell imaging dan de huidige SMLM technieken. Het maakt gebruik van lagere laser bevoegdheden, op een breed veld voor whole-cell gezichtsvelden; Sterkere overname snelheden, en is compatibel met standaard fluorofoor etikettering. De breedveldbeeld karakter van SIM maakt ook het gebruik van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) voor zeer selectieve excitatie met indringdiepten in de axiale afmeting van &lt;100 nm. Afbeelding correlatie spectroscopie (ICS) is een methode correleren fluctuaties in fluorescentie-intensiteit. Een evolutie van ICS; Tijdruimtelijke imleeftijd correlatie spectroscopie (Stokjes 10) correleert intracellulaire fluorescerende signalen in tijd en ruimte. Door het correleren pixelintensiteiten met de omliggende pixels in achterblijvende frames via een correlatie functie, wordt informatie verkregen over stroomsnelheden en richting. Om ervoor statische objecten niet interfereren met de Stokjes analyse wordt een onbeweeglijk object filter toegepast, die werkt door het aftrekken van een voortschrijdend gemiddelde van de pixelintensiteiten. De hier gepresenteerde techniek wordt als de eerste demonstratie van beeldcorrelatie spectroscopie toegepast op microscopie data superresolutie de moleculaire stroming in levende cellen 11 kwantificeren. Deze methode verbetert buigingsbegrensd beeldvorming van F-actine stroom via Stokjes analyse 12 en zou onderzoekers die willen bepalen tweedimensionale moleculaire stroming in levende cellen, uit gegevens verkregen bij ruimtelijke resoluties dan de diffractie limiet van het licht aan te passen.

<table><tbody><tr><td>Verbruiksartikelen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat E6.1 cellen</td><td>APCC</td><td>ATTC TIB-152</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 8-wells Labtek dekglasjes</td><td>NUNC, Labtek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>LifeAct GFP construct</td><td>Ibidi</td><td>60101</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Life Technologies</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD28</td><td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Lensolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Utrusting:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulsar Xcell System</td><td>BioRad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvet (0.4cm)</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5805 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (Heraeus)</td><td>Biofuge pico</td><td>75003235</td><td></td></tr><tr><td>6 wel plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top incubator</td><td>Tokai Hit</td><td>INUH-TIZSH</td><td></td></tr><tr><td>Nikon N-SIM microscoop</td><td>Nikon</td><td>Neem contact op met het bedrijf</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Analyse software</td><td>Nikon</td><td>Neem contact op met het bedrijf</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (190D)</td><td>LEEC</td><td>Neem contact op met het bedrijf</td><td></td></tr></tbody></table>

corticale actine flow in t-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd afbeelding correlatie spectroscopie van structured verlichting microscopie gegevens

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamenteus actine speelt een cruciale rol in de meeste celprocessen zoals motiliteit en in immuuncellen, de vorming van een belangrijke cel-cel interactie bekend als immunologische synaps. F-actine ook gespeculeerd een rol spelen bij het reguleren moleculaire verdelingen in de membraan van cellen inclusief sub-membraneuze blaasjes dynamiek en eiwit clustering. Terwijl de standaard lichtmicroscoop technieken maken algemene en buigingsbegrensd waarnemingen worden gedaan, vele cellulaire en moleculaire gebeurtenissen zoals clustering en moleculaire stroom optreden in populaties in lengte-schalen ver onder het oplossend vermogen van standaard lichtmicroscopie. Door het combineren van totale interne reflectie fluorescentie met superresolutie beeldvormingswerkwijze gestructureerde verlichting microscopie, de tweedimensionale moleculaire stroom F-actine bij de immune synaps van T-cellen opgenomen. Tijdruimtelijke afbeelding correlatie spectroscopie (Stokjes) werd vervolgens toegepast, waarbij meetbare resul genereertts in de vorm van snelheid histogrammen en vector kaarten die stroom richting en omvang. Dit protocol beschrijft de combinatie van super-resolutie beeldvorming en Stokjes technieken om stroom vectoren op sub-diffractie niveau van detail te genereren. Deze techniek werd gebruikt om een ​​actine stroom die symmetrisch retrograde en centripetale gehele omtrek van T-cellen na synapsvorming bevestigen.

Microscoop instellingen Na het succesvol realiseren van alle stappen van de onderzoeker zal hebben volbracht gestructureerd verlichting (SIM) beeldvorming van F-actine stroming in een T-cel synaps (Video 1), en gekwantificeerd deze moleculaire stroom van tijd-ruimtelijke afbeelding correlatie spectroscopie (figuur 4 11). Vóór het opnemen van beelden, zorgen voor de steekproef verlichting is uniform ...

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Het algemene doel van dit experiment is om de dynamiek van corticaal actine te kwantificeren middels beeldcorrelatiespectroscopie na acquisitie via totale interne reflectie, gestructureerde illuminatie-imaging of turf sim. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het biofysische veld, zoals welke rol de stroom van corticaal actine speelt bij het reguleren van interacties in de immunologische synaps. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het nanometerschaalresolutie combineert met compatibiliteit voor levende cellen, waardoor processen op een kleinere schaal kunnen worden waargenomen en geanalyseerd in vergelijking met conventionele microscopietechnieken.George Ashdown, een promovendus uit mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Voeg voor een testmonster vijf microliters van een voorraadoplossing van fluorescentie microsferen met een diameter van 100 nanometer toe aan het oppervlak van een nieuwe, ongecoate dekglasplaat. Verspreid vervolgens de microsfeeroplossing over de dekglasplaat met een pipetpunt en laat deze drogen.Voeg 200 microliters montagemedium toe aan het testdekglaasje ter voorbereiding op de beeldvorming. Zet de incubator voor de objecttafelverwarmer van het turf SIM-systeem aan en vul het reservoir met gedestilleerd water zodat de basis van het verwarmingselement volledig bedekt is. Laat het water equilibreren tot 37 graden Celsius. Sluit de verwarmingsring aan op de objectieflens en stel deze in op 37 graden Celsius.Bevestig vervolgens het turf 4 88-compatibele gradatieblok in de lichtweg van de microscoop om te garanderen dat het juiste optische pad is ingeschakeld. Zet de kanaalmodus op het laserbed in de enkelvoudige positie. Herhaal deze handeling voor de glasvezelkabel op de microscooptafel.Er zal een foutmelding in het softwarevenster verschijnen als deze stappen niet worden uitgevoerd. Nadat de modus is ingesteld, laat u het objectief zakken naar het laagste Z-vlak en brengt u een druppel olie aan. Plaats het dekglas van het testmonster met de fluorescerende microsferen op de microscooptafel.Select vervolgens het perfect focus system of de PFS-functie op de microscoopbehuizing. Beweeg het objectief geleidelijk omhoog door het Z-vlak en stop wanneer de PFS-knop stopt met knipperen, wat aangeeft dat het brandvlak in de aansturingssoftware is bereikt. Schakel over naar de live-weergave om de microsferen op het scherm in beeld te brengen.Maak fijne aanpassingen aan de focus door gebruik te maken van het wiel van de PFS-micromanipulator. Controleer op uniforme illuminatie zonder onscherpe fluorescentie-emissie boven de 75 nanometer golflengte. Bevestig tot slot dat gestructureerde illuminatie is bereikt door een fluctuerend illuminatiepatroon waar te nemen van de fluorescentie-microsfeer-sample voor T-celstimulatie in de kamers van een acht.Vul het dekglas met 200 µL van een mengsel van anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen en incubeer het dekglas gedurende twee uur bij 37 °C. Nadat het dekglas is gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het op de objecttafel van de microscoop geplaatst en vervolgens wordt het brandvlak van de turf gezocht. Pipetteer daarna voorzichtig 200 µL getransfecteerde T-cellen in een van de putjes op het dekglas.Gebruik epifluorescentie om de GFP-actine-getransfecteerde cellen te volgen terwijl ze op het dekglas landen. Zodra de cellen zijn neergezakt, schakelt u over naar de live-modus met de N SimPad en controleert u of de cellen op de monitor in focus zijn. Om een tijdreeks op te nemen, opent u het ND-acquisitievenster en selecteert u het tabblad 'time'.Klik vervolgens op add en stel het interval in op no delay. Stel de duur in op 10 minuten. Start ten slotte met het vastleggen van de gegevens door Run now te selecteren in het ND-acquisitievenster.Om de beelden te reconstrueren, opent u eerst de analysesoftware met de juiste analysmodule. Klik op applicaties en selecteer vervolgens het venster 'show end sim'. Stel het illuminatiemodulatiecontrast en de ruisonderdrukking voor hoge resolutie in op één en reconstrueer de turf SIM-dataset via de statusbalk voor beelden om een compleet SIM-beeld te produceren.Bevestig dat de pixelgrootte 30 nanometer is en exporteer vervolgens de gegevens als TIF-bestanden voor stick-analyse. Nadat het MATLAB-softwarepakket voor sticks is gedownload en geëxtraheerd, opent u het script. Definieer vervolgens de inputparameters zoals beschreven in het tekstprotocol voor het filter voor het verwijderen van immobiele objecten.Stel in regel 23 de filterparameter in op voortschrijdend gemiddelde en gebruik in regel 24 21 als parameter voor het voortschrijdend gemiddelde om één vectorkaart te genereren. Stel de temporele subregio in regel 31 in op het maximaal aantal frames, in dit geval 63. Stel vervolgens in regel 32 de temporele verschuiving in op één in de regels 33 tot en met 35.Voer de namen van de uitvoerbestanden, de titels van de uitvoer-vectorkaarten en het pad van de uitvoerdirectory in. Definieer vervolgens het formaat waarin de afbeeldingen van de vectorkaarten moeten worden opgeslagen. In dit geval png.Open het script in het MATLAB-editorvenster. Voer 'run one channel sticks' uit en laad de beeldserie door regels 1 tot en met 23 van het script uit te voeren. Voer vervolgens regels 29 tot en met 35 van 'run one channel sticks' uit.Om de stick-analyse te starten, volgt u de aanwijzing en selecteert u een polygoon om een interessegebied (region of interest) of ROI te definiëren indien gewenst. Voer regels 38 tot en met 52 uit om de vectorkaarten weer te geven. Voer vervolgens regels 53 tot en met 72 uit om het histogram van de snelheidsmagnitude te plotten; hier wordt een OT T-cel getoond die GFP-gelabeld F-actine tot expressie brengt, welke is afgebeeld met het turf sim-protocol.Besproken in de tekst vijf minuten nadat deze cel werd aangebracht op een dekglas gecoat met anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen, bedoeld om de vorming van immunologische synapsen te stimuleren. Er werd een tijdreeks vastgelegd zodat de moleculaire stroom van f-actine gevisualiseerd kon worden. De daaropvolgende analyse van deze gegevens met het programma This Sticks maakte kwantificering mogelijk van de moleculaire stroom van f-actine, zoals weergegeven door deze vectorkaart die correspondeert met het omkaderde gebied van de cel links, wat een deel van de synapsperiferie vertegenwoordigt. verdere vergroting van deze kaart en het T-cel subgebied verduidelijkt de richting en snelheid van de actinstroom, welke kan worden bepaald aan de hand van de vectorlengte en de kleurcode. Snelheidsgegevens kunnen ook in een histogram worden uitgezet, wat statistische analyse mogelijk maakt. Gezamenlijk laten deze resultaten zien dat F-actine in de immunologische synaps op symmetrische wijze van de periferie naar het centrum van de cel stroomt. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u ts-gegevens verkrijgt en corticale actinedynamiek analyseert met behulp van image correlation spectroscopy.Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de actinstroom tijdens T-celmigratie, kan deze ook worden toegepast in andere systemen waarbij moleculaire stroom als belangrijk wordt beschouwd, zoals bij celmigratie.

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

We beschrijven een live-cell imaging methode die inzicht geeft in eiwitdynamica tijdens de T-cel activatie proces. We tonen de totale gebruiksduur van de T-cel verspreiding assay, confocale microscopie en beeldanalyse te geven kwantitatieve resultaten volgen signalering complexvorming in T-cel activatie.

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.

Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Dit protocol is een gids voor het visualiseren van dynamische actine en microtubuli met behulp van een in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopie assay.

Visualisatie van actine en microtubulikoppelingsdynamiek in vitro door total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie

Leer corticale actine-dynamiek kwantificeren in T-cellen met ruimtelijke en temporele beeldcorrelatiespectroscopie. Deze methode combineert nanometerschaalresolutie met levende-celcompatibiliteit voor immunologisch onderzoek.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens (Video) | JoVE Journal

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Meer video's verkennen