Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Het algemene doel van het volgende experiment is om een multi-doelwit-benadering te gebruiken voor gestructureerde bepaling van een doelwiteiwit door middel van röntgenkristallografie, beginnend met slechts een enkel gen of genetische sequentie in het hier gepresenteerde geval. Het doelwiteiwit is de PB twee polymerase-subeenheid van influenza A, een sleutelcomponent van virale replicatie. De multi-doelwit-benadering wordt bereikt door eerst een reeks genetische constructies te ontwerpen en parallel te klonen op basis van de enkele doelwitsequentie en andere bekende informatie over het eiwit.

De tweede stap is het testen van expressieniveaus voor elke construct en het selecteren van de beste voor grootschalige eiwitexpressie in celcultuur. De volgende stap vereist het openbreken van cellen om de doelwiteiwitten uit het expressiemateriaal te verwijderen en elk van hen tot zeer hoge zuiverheid te verfijnen. Er worden vervolgens een reeks kristallisatieproeven ingesteld met elk eiwit om een kristalvorm te verkrijgen die geschikt is voor röntgenstudies.

Hoogwaardige röntgendiffractiegegevens worden vervolgens verzameld op een of meer kristallen en gebruikt om een elektronen-dichtheidskaart op te lossen en te verfijnen die de structuur van elk doelwiteiwit schetst. Deze resultaten maken de weergave van een driedimensionale structuur van het doelwiteiwit mogelijk op basis van de elektronen-dichtheidskaart. Multi-doelwitverwerking verhoogt de kans op succes bij gestructureerde bepaling aanzienlijk door haalbare alternatieven te bieden bij elke potentiële wegversperring in de route.

Het werken met meerdere doelwitten parallel is ook zeer efficiënt, waardoor de tijd en kosten per eiwit in elke stap worden verminderd. Het potentieel om de snelheid waarmee gestructureerde bepaling voor behandelbare doelwitten wordt voltooid, te verhogen, zal meer ontwikkelingskansen voor therapie per jaar mogelijk maken. Hoewel deze methode waardevolle inzichten in structurele biologie kan opleveren, kan het hoogwaardige eiwit dat door deze methoden wordt verkregen, elke eiwitgebaseerde onderzoek ondersteunen.

Elke fase van het proces heeft zijn eigen wetenschap en vereist zijn eigen expertise, maar de investering in mensen, instrumentatie en knowhow kan prachtig worden beloond zodra alle stukken zijn geassembleerd. Zodra een doelwitgen en genproduct voor onderzoek zijn geselecteerd, vereist de eerste stap het ontwerpen van meerdere genetische varianten of constructen. Gene Composer-software wordt gebruikt om deze constructen op eiwitniveau te ontwerpen, samen met de bijbehorende code op gesynthetiseerde gensequenties.

Gebruik de aligneringsviewer-module en de constructie-ontwerpmodule om eiwitsequentie-aligneringen te vergelijken en eiwitconstructie-ontwerpinsert-PCR en vector-PCR-terminale primers of ampers te definiëren. Gebruik vervolgens Gene Composer's eiwit-naar-DNA-algoritme om elke aminozuursequentie terug te vertalen in een code op een gesynthetiseerde nucleïnezuursequentie. Gebruik de juiste code op het gebruikstabel om de sequentie te optimaliseren voor expressie in een specifieke cellijn.

In dit geval, e coli-bacteriën. Zodra de doelwitgensequentie klaar is, klonen en voeg het gen virtueel in in een geschikte vectorplasmide voor bacteriële expressie. In dit geval een gemodificeerde PET 28-vector.

Deze vector bevat bepaalde componenten die nodig zijn voor expressie en eiwitzuivering. Het doelwitgen wordt gemodificeerd om een histamine-tag-sequentie op het N- of C-uiteinde van het eiwit te incorporeren en een splitsingssequentie om de tag tijdens de zuivering te verwijderen. De vector bezit ook een antibioticaresistentiegen voor expressietest en fermentatie.

Elke genetische sequentie van het doelwiteiwit wordt vervolgens gecreëerd door standaard gensynthesemethoden ter voorbereiding op pipe-klonen, polymerase onvolledige primaire extensie-klonen, of pipe-klonen is een PCR-gebaseerde kloneringsstrategie waarbij het doelwitgen wordt aangemaakt met primers die complementair zijn aan de beoogde vector. Deze methode maakt gebruik van de onvolledige aard van PCR in een laat stadium, waarbij de PCR-producten met variabele enkelstrengse einden worden achtergelaten. Ik bereid de insert-PCR of IPCR voor door vijf microliter van voorwaartse en omgekeerde primers toe te voegen aan elke reactie.

In een 96-wellsplaat volgens een plaatkaart, voeg twee microliter van elk volledige synthetische gen toe aan de juiste well volgens het plaatkaart. Voeg na het toevoegen van 25 microliter PFU-mastermix aan elk wel, de reacties 25 keer door cyclus met de volgende PCR-condities. Denatureer gedurende 30 seconden bij 95 graden Celsius.

Anil bij 50 graden Celsius gedurende 45 seconden en verleng bij 68 graden Celsius gedurende drie minuten. Fragmentamplificatie wordt bevestigd door AGROS-gelanalyse van IPCR-producten. Succesvolle IPCR-producten worden weergegeven door robuuste banden.

Minder wenselijke resultaten worden vaak gezien als zwakke of uitgesmeerde banden in een aparte reactie. Het expressieplasmide wordt aangemaakt door vector-PCR of VPCR-fragmentamplificatie wordt bevestigd door AROS-gelanalyse van VPCR-producten. Zodra de IPCR- en VPCR-producten zijn aangemaakt, worden ze toegevoegd aan een merge-plaat en in een thermocycler geplaatst voor de merge-reactie.

De succesvol gekloonde constructen worden vervolgens getransformeerd in chemisch competente e coli-cellen en opgeslagen in glycerolstokken om de expressietest-streak te beginnen. Een kleine hoeveelheid van elk monster van een glycerolvoorraad van gekloond construct op een aparte agarplaat. De plaat is gemaakt met bacteriële voedingsbouillon en de antibioticummarker Kanamycine gecodeerd in de vector. Incubeer een nacht bij 37 graden Celsius op de volgende dag.

Start een voorcultuur voor elk monster door een enkele kolonie te plukken van de vers geteelde agarplaat. Gebruik deze kolonie om 1,2 milliliter TB-bouillon te inoculeren, aangevuld met kanmycine en glucose voor parallelle verwerking. Elke voorcultuur wordt gekweekt in een 96-wells ronde bodemplaat.

Groei een nacht bij 37 graden Celsius met schudden bij 220 rotaties per minuut. Na de nachtelijke groei. Start kleine schaal inductieculturen voor elk monster door 40 microliter van de voorcultuur te gebruiken om te inoculeren.

1,2 milliliter TB-bouillon. Aangevuld met