Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

Het algemene doel van het volgende experiment is om een multi-target benadering te gebruiken voor de gestructureerde bepaling van een doeleiwit via röntgendiffractie, uitgaande van slechts één enkel gen of genetische sequentie in de hier gepresenteerde casus. Het doeleiwit is de PB2-polymerasesubunit van influenza A, een sleutelcomponent van virale replicatie. De multi-target benadering wordt gerealiseerd door eerst in parallel een reeks genetische constructen te ontwerpen en te kloneren op basis van de enkele doelsequentie en andere bekende informatie over het eiwit.

De tweede stap is het testen van de expressieniveaus voor elk construct en het selecteren van de beste constructen voor grootschalige eiwitexpressie in celcultuur. De volgende stap vereist het openbreken van cellen om de doeleiwitten uit het expressiemateriaal te verwijderen en elk hiervan te zuiveren tot een zeer hoge zuiverheid. Vervolgens wordt voor elk eiwit een reeks crystallisatieproeven opgezet om een kristalvorm te verkrijgen die geschikt is voor röntgenonderzoek.

Vervolgens worden röntgendiffractiegegevens met een hoge resolutie verzameld van één of meer kristallen en gebruikt om een elektronendichtheidskaart op te lossen en te verfijnen, die de structuur van elk doeleiwit schetst. Deze resultaten maken het mogelijk om een driedimensionale structuur van het doeleiwit weer te geven op basis van de elektronendichtheidskaart. Het verwerken van meerdere doelen verhoogt de kans op succes bij de structurele bepaling aanzienlijk door levensvatbare alternatieven te bieden bij elke mogelijke hindernis in het proces.

Het parallel behandelen van meerdere targets is bovendien zeer efficiënt, waardoor de tijd en de kosten per eiwit in elke stap worden verminderd. Het potentieel om de snelheid waarmee de structurele bepaling voor druggable targets wordt voltooid te verhogen, zal leiden tot meer mogelijkheden voor therapieontwikkeling per jaar. Hoewel deze methode waardevolle inzichten in de structurele biologie kan bieden, kunnen de hoogwaardige eiwitten die via deze methoden worden verkregen, elke eiwitgebaseerde onderzoeksactiviteit ondersteunen.

Elke fase van het proces heeft zijn eigen wetenschappelijke basis en vereist specifieke expertise, maar de investering in personeel, instrumentatie en knowhow kan zich uitstekend bewijzen zodra alle onderdelen zijn samengevoegd. Zodra een doelgen en een genproduct zijn geselecteerd voor onderzoek, is de eerste stap het ontwerpen van meerdere genetische varianten of constructen. Gene composer-software wordt gebruikt om deze constructen op eiwitniveau te ontwerpen, samen met de bijbehorende code voor technisch gemodificeerde synthetische gensequenties.

Vergelijk eiwitsequentie-alignments en definieer het ontwerp van eiwitconstructen, inclusief de terminale primers of adapters voor de insert-PCR en vector-PCR, met behulp van de alignment viewer-module en de construct design-module. Gebruik vervolgens het protein-to-DNA-algoritme van de gene composer om elke aminozuursequentie terug te vertalen naar een gecodeerde, gemanipuleerde nucleïnezuursequentie. Gebruik de juiste codon-gebruikstabel om de sequentie te optimaliseren voor expressie in een specifieke cellijn.

In dit geval, E. coli-bacteriën. Zodra de doelwitgensequentie klaar is, wordt het gen virtueel gekloneerd en ingevoegd in een geschikt vectorplasmide voor bacteriële expressie. In dit geval een gemodificeerde PET 28-vector.

Deze vector bevat bepaalde componenten die noodzakelijk zijn voor expressie en eiwitzuivering. Het doelgen is gemodificeerd om een histidine-tag-sequentie in te voegen aan ofwel de N- of C-terminus van het eiwit, evenals een splitsingssequentie om verwijdering van de tag tijdens de zuivering mogelijk te maken. De vector beschikt daarnaast over een antibioticumresistentiegen voor expressietests en fermentatie.

Elke genetische sequentie van het doeleitwit wordt vervolgens gemaakt via standaard gen-synthesemethoden ter voorbereiding op polymerase incomplete primary extension cloning, of pipe-cloning; pipe-cloning is een PCR-gebaseerde kloneringsstrategie waarbij het doelgen wordt geamplificeerd met primers die complementair zijn aan de beoogde vector. Deze methode maakt gebruik van het onvolledige karakter van de late fase van de PCR, waardoor de PCR-producten variabele enkelstrengse uiteinden behouden. Ik bereid de insert-PCR of IPCR voor door vijf µL van zowel de forward- als de reverse-primer aan elke reactie toe te voegen.

Voeg in een 96-wells plaat, conform een plaatmap, twee microliters van elk synthetisch gen van volledige lengte toe aan de overeenkomstige well volgens de plaatmap. Voeg vervolgens 25 microliters PFU mastermix toe aan elke well en voer de reacties 25 keer cyclisch uit volgens de volgende PCR-condities. Denatureer bij 95 °C gedurende 30 seconden.

Denatureer bij 50 °C gedurende 45 seconden en verleng bij 68 °C gedurende drie minuten. Fragmentamplificatie wordt bevestigd door AGROS-gelanalyse van de IPCR-producten. Succesvolle IPCR-producten worden weergegeven door robuuste banden.

Minder wenselijke resultaten zijn vaak zichtbaar als zwakke banden of vegen in een afzonderlijke reactie. Het expressieplasmide wordt geamplificeerd via vector-PCR, of de amplificatie van VPCR-fragmenten wordt bevestigd door AROS-gelanalyse van de VPCR-producten. Zodra de IPCR- en VPCR-producten zijn geamplificeerd, worden ze toegevoegd aan een merge-plaat en in een thermocycler geplaatst voor de merge-reactie.

De succesvol gekloonde constructen worden vervolgens getransformeerd in chemisch competente E. coli-cellen en bewaard in glycerolstocks om te beginnen aan de expressietesten via uitstrijkjes. Een kleine hoeveelheid van elk monster uit een glycerolstock van het gekloonde construct wordt op een aparte agarplaat uitgestreken. De plaat is gemaakt met bacterieel nutriëntenbouillon en de antibiotica-marker Kanamycine die in de vector is gecodeerd, en wordt de volgende dag gedurende de nacht geïncubeerd bij 37 °C.

Start een pre-cultuur voor elk monster door een enkele kolonie van de vers gekweekte agarplaat te plukken. Gebruik deze kolonie om 1,2 milliliters TB-bouillon, aangevuld met kanamycin en glucose, te inoculeren voor parallelle verwerking. Elke pre-cultuur wordt gekweekt in een 96-wells blok met ronde bodem.

Kweek gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 220 rotaties per minuut. Na de nachtelijke groei worden voor elk monster kleine inductieculturen gestart door in te enten met 40 µL van de precultuur.

1,2 milliliter TB-bouillon. Aanvullend met 50 milligram per milliliter kanamycine en het Novagen overnight express system. 1. Laat de inductieculturen groeien bij 20 °C gedurende 48 uur, schudden bij 220 RPM; oogst de cellen door centrifugatie bij 4.000 ×g gedurende 15 minuten.

Giet het supernatant af en bewaar de pellets bij -20 °C gedurende ten minste één uur voorafgaande aan verdere verwerking na zuivering. Analyseer het eiwit met en zonder splitsingsreactie via capillaire elektroforese met behulp van een Caliper Lab CHIP 90-systeem volgens het protocol van de fabrikant. In het geval van het influenz A PB2-eiwit leidden 14 van de 34 constructen tot een oplosbaar doeleiwit, welke werden meegenomen naar de volgende stap: fermentatie op grote schaal.

Om een fermentatie op grote schaal te starten, ent u 100 milliliter bacteriële celcultuurbouillon die 50 milligram per milliliter kanmycine bevat vanuit een glycerolstock en laat u dit gedurende de nacht groeien bij 37 °C, met schudden op 220 RPM. Breid de volgende dag de precultuur uit door 10 milliliter te gebruiken voor inoculatie.

Eén liter bouillon die auto-inductiemedium en 50 mg/mL kanamycine bevat, in een baffled kolf van twee liter. Schud de uitgebreide culturen bij 37 °C ongeveer elke 30 minuten. Controleer de optische dichtheid van de cultuur door de UV-absorbentie te meten bij een golflengte van 600 nm.

Wanneer een optische dichtheid van 0,6 is bereikt, wordt de temperatuur van de schudincubator na de gewenste groeitijd gewijzigd naar 20 °C. Neem van elk construct een representatief aliquoot van 10 mL af voor expressietests. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende 15 minuten.

Giet het supernatant af en vries de celpellet in bij -80 °C. Om met deze procedure te beginnen, ontdooi en resuspendeer de celpasta in lysisbuffer in een mastervolume-verhouding van 1:5. Roer 30 minuten krachtig bij 4 °C.

Gebruik een schone spatel om klonten los te maken van de wand van het bekerglas. Lyseer de cellen mechanisch op ijs met een ultrasoonbad. Clarificeer het ruwe lysaat door centrifugatie bij 18, 000 GForce units gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Verzamel het supernatant en bewaar een kleine aliquot voor analyse voordat u overgaat tot grootschalige zuivering. Bevestig de grootschalige eiwitexpressie van elke cultuur via SDS-PAGE-gelanalyse. Dit representatieve SDS-PAGE-resultaat toont een robuuste eiwitexpressie, met een oplosbaarheid van ongeveer 50% en een splitsing van ongeveer 50%.

In dit geval werd de histidinetag verwijderd samen met een toegevoegde tag voor eiwitoplosbaarheid, die in het oorspronkelijke construct was ingebouwd. Nikkelhars wordt gebruikt om het doeleiwit met de unieke histidinetag te scheiden van al het andere cellulaire materiaal, inclusief endogene bacteriële eiwitten. Een nikkelkolom wordt geprepareerd door deze te wassen met vier kolomvolumes gedestilleerd water om de bewaarbuffer te verwijderen, gevolgd door één kolomvolume buffer B en vijf kolomvolumes buffer.

Parallelisatie van de A-naar-E-equilibratie wordt uitgevoerd met de proteïnemaker, die in staat is om meerdere kolommen tegelijkertijd te verwerken. Laad elk geklaard lysaat met gesolubiliseerd eiwit met een histidinetag in een aparte kolom met een snelheid van twee milliliters per minuut, gevolgd door meerdere kolomvolumewassingen met buffer A; verzamel de doorloopbuffer en bewaar deze voor analyse. Elueer het gebonden eiwit in een reeks stapsgewijze gradiënten met buffers A en B bij 95:5, 60:40 en uiteindelijk 100% buffer B. De componenten in buffer B concurreren met histidine voor de nikkelhars en verwijderen zo het eiwit uit de kolom bij een gegeven ratio.

Verzamel elke elutiefractie afzonderlijk. Een representatief chromatogramresultaat van een run op een nikkelkolom wordt hier getoond. Analyseer de geëlueerde nikkelkolomfracties, het ruwe lysaat, het geklaarde lysaat en de flow-through van de nikkelkolom via SDS-PAGE en vergelijk deze met de UV-absorptie bij 280 nanometer die tijdens de kolomzuivering is gemeten.

Deze stap bepaalt of de zuivering succesvol was. Selecteer en combineer de fracties die het doeleiwit bevatten voor verdere verwerking. Bereken de totale hoeveelheid eiwit in deze fase aan de hand van de theoretische extinctiecoëfficiënt van het eiwit, door de UV-absorbentie bij 280 nanometer te meten en het totale volume van de gecombineerde fracties mee te wegen.

Bewaar een kleine hoeveelheid monster voor analyse. Het gen voor het doeleiwit werd gecodeerd met een specifieke sequentie die door ULP1 wordt herkend als een splitsingsplaats; de toevoeging van ULP1 resulteert daarom in splitsing tussen de histidinetag en het eiwit van belang. Om deze procedure te starten, voegt u één microliter ubiquitine-achtig protease 1 toe voor elke vijf milligram eiwit in de samengevoegde fracties.

Op dit punt wordt het gesplitste eiwit met behulp van dialysebuisjes overgebracht van buffer B naar buffer A voor verdere verwerking; dialyseer het eiwit gedurende vier uur tegen twee liter buffer A bij vier graden Celsius onder stirring. Gebruik een molecular weight cutoff van 10 kilodalton voor PB twee na de dialyse. Voer een weitere SDS-PAGE gel uit van het doeleiwit met en zonder aanwezigheid van ULP een.

Dit zal bepalen of de ULP1-splitsing succesvol was en maakt het mogelijk om de beste fracties te selecteren voor verdere verwerking. Hier worden onze representatieve SDS-PAGE-resultaten getoond voor drie constructen van de polymerase pb. Twee moleculaire gewichtsmarkers voor subeenheden bevinden zich in baan één.

Baan twee, zes en 10 bevatten samengevoegde eiwitten uit nikkelkolommen één. Baan drie, zeven en 11 bevatten de flow-through van gesplitst eiwit in buffer A uit nikkelkolom twee, en baan vier, acht en 12 tonen de verwijdering van de histidinetag in buffer B uit nikkelkolom twee.

Na verwijdering van het histamine worden de samengevoegde fracties van nikkel twee geconcentreerd. Om met SEC te beginnen, moet opnieuw de juiste hars worden gekozen op basis van het molecuulgewicht van het doelwit. In dit geval wordt een acere S 110 over 30 GL kolom gebruikt en geëquilibreerd met 200 milliliters SEC-buffer bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut. Gebruik een spuit van vijf milliliter om het monster in een monsterlus van 10 milliliters te laden en start de SEC-kolomrun. Monitor het UV-absorptiechromatogram bij 280 nanometers terwijl er fracties van klein volume worden verzameld.

Analyseer alle relevante SEC-fracties via SDS-PAGE. De standaardaanpak voor eiwitkristallisatie-experimenten wordt uitgevoerd via de sitting drop-methode met dampdiffusie. Het is gebruikelijk om aan het begin voor elk doeleiwit twee of meer sparse matrix-screens op te zetten.

Om dit proces te starten, vult u elk reservoir van een compacte junior crystallisatieplaat met 96 wells voor met 80 µL van elke conditie in de geselecteerde crystallisatiescreening; doseer vervolgens 0,4 µL proteïne in SEC-buffer in elke van de 96 wells. Voeg daarna 0,4 µL van de crystallisatiescreening toe, waarbij u zorgt voor een volledige menging van de druppel in elke well. Dek de gehele plaat af met kristalheldere sealingtape, waarbij u een volledige afdichting van elke well waarborgt; bewaar de plaat bij 16 °C op een ongestoorde locatie, vrij van omgevingsvibraties.

Controleer gedurende de komende weken periodiek op proteïnekristallisatie onder een dissectiemicroscoop. Indien er geen proteïnekristallen verschijnen, stel dan nieuwe platen op met verschillende condities en varieer de proteïneconcentratie in de uiteindelijke druppel om de kans op succes voor het oogsten te vergroten. Koel een puck in ALS-stijl af in een houder gevuld met vloeibare stikstof en sluit deze af met een deksel om te beginnen met het oogsten.

Snijd de transparante tape die het well met het doelproteïnekristal bedekt naar een nabijgelegen leeg well. Voeg 1,6 µL van de overeenkomstige crystallisatieconditie toe en combineer dit met 0,4 µL ethyleenglycol. Een oplossing van 20% ethyleenglycol in de crystallisatieconditie beschermt het proteïnekristal.

Analyseer tijdens het cryovriezen het kristal onder de microscoop en selecteer een geschikte cryoloop voor het oogsten, waarbij de binnendiameter van de loop moet overeenkomen met de maximale breedte van het kristal. Bevestig de cryoloop aan een magnetische kristalstaf en schep het kristal direct uit de putoplossing. Dompel de cryoloop met het geoogste kristal onmiddellijk in een cryoprotectant en dompel deze vervolgens onder in een puck van het LS-type.

Om snel te bevriezen, bevries je de kristalrepetitie voor het gewenste aantal kristallen. Zodra de oogst voltooid is, gebruik je een puck-stok om een magnetisch deksel op de puck te plaatsen die de snel bevroren kristallen met gebogen tongen bevat. Keer de puck om voor de volgende stap.

Schroef een puck-pusher op de puck, breng de puck vervolgens over naar de KU actor doer en gebruik deze om het deksel eraf te slaan. De kristallen in de puck blijven bevroren in een bad van vloeibare stikstof tot ze klaar zijn voor röntgendiffractiestudies met de J Director image acquisition-software. Stel de volgende parameters in voor kristalscreening: een beam slit van 0,5 graden, een detectoraafstand van 50 millimeters, een image step van 70 graden en een belichtingstijd van 30 seconden.

Hier is een voorbeeld van een screenshot uit de software voor beeldacquisitie tijdens het screenen van een kristal; het middenpaneel toont de waargenomen röntgendiffractie van een representatief kristal waarbij voldoende beelden met een hoge resolutie zijn verzameld voor een volledige dataset die nodig is voor driedimensionale structuurbepaling. De in deze video gedemonstreerde strategieën voor klonering en eiwitzuivering resulteerden in 14 gezuiverde PB two-monsters, waarvan negen kristallen opleverden die geschikt waren voor diffractiestudies. De in-house röntgendiffractiedataset werd verzameld voor vijf van de negen constructen met QK alpha-straling met behulp van een Rigaku SuperBright FRE Plus roterende anode röntgengenerator, uitgerust met Ossec Variax HF-optiek en een Saturn 944 Plus CCD-detector.

Hier wordt een röntgendiffractiebeeld van de polymerase PB2-subeenheid getoond. Elke dataset werd verwerkt en in totaal werden vier structuren van de PB2-subeenheid bepaald. Elke structuur is door vakgenoten beoordeeld en geüpload naar de protein data bank voor openbare toegang.

Deze figuur toont lintdiagrammen van de moleculen in de kristallografische asymmetrische eenheid. Van de vier PB2-structuren zijn de secundaire structuren gekleurd in een regenboogpatroon met de bijbehorende PDB-codes. In deze tabel wordt de resultaatanalyse getoond voor de influenza PB2-doelwitten via de methoden die worden beschreven in dit videoartikel.

De multi-target parallelle verwerkingspijplijn voor determinatie van gen tot structuur wordt geïllustreerd in vijf stappen: klonering, oplosbaarheid, zuivering, kristallisatie en structuurbepaling. De output van onze structurele biologiepijplijn vormt niet alleen de basis voor structuurgebaseerd onderzoek, maar voedt ook aanvullende studies, zoals functionele assays om de eiwitfunctie te bevestigen of biofysische screening van nieuwe verbindingen via een MAR of SPR om nieuwe startpunten voor geneesmiddelenontwikkeling te identificeren. Deze techniek en de instrumenten die ermee zijn ontwikkeld, hebben de weg vrijgemaakt voor structurele biologen om vele soorten ontdekkingsgerichte onderzoeken uit te voeren, waaronder structuurgebaseerd geneesmiddelendesign, wat een enorme impact heeft gehad op de menselijke gezondheid en ziektebeelden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe parallelle verwerking met meerdere doelwitten het succes van structurele bepaling aanzienlijk kan verhogen. Vergeet niet dat werken in een laboratorium voor structurele biologie uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd de juiste voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van PBM, tijdens laboratoriumactiviteiten.