Name: Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Leer de bereiding van compacte quantum dots voor single-molecule imaging met geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit. Deze methode minimaliseert de hydrodynamische grootte en niet-specifieke binding voor biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Hong Yi danken aan de Emory University Geïntegreerde Microscopy Core voor elektronenmicroscopie beeldvorming. Dit werk werd gesponsord door NIH subsidie ​​(PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338, en 1K99CA154006-01).

De volgende synthese procedures omvatten standaard luchtvrije technieken en het gebruik van een vacuüm / inert gas spruitstuk gedetailleerde methodologie kan worden gevonden in referenties 10 en 11. MSDS voor alle potentieel toxische en ontvlambare stoffen moet worden geraadpleegd voor gebruik en alle brandbare en / of lucht-labiele verbindingen dienen te worden in hoeveelheden verdeeld in septum afgesloten flacons in een zuurkast of een handschoen zak. 1. Synthese van Mercurius cadmiumselenide (Hg x Cd 1-x Se) Quantum Dot Cores <ol><li> Bereid een 0,4 M oplossing van selenium in trioctylphosphine (TOP). Voeg selenium (0,316 g, 4 mmol) in een 50 ml 3-halskolf, dan evacueren en vullen met argon via een Schlenk-lijn. Onder lucht-vrije omstandigheden (droge stikstof of argon atmosfeer), 10 ml TOP en verhit tot 100 ° C onder roeren gedurende 1 uur tot een heldere, kleurloze oplossing opleveren. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en zet het flesje. </li><li> Aan een 250 ml 3-hals kolf, voeg cadmiumoxide (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), tetradecylphosphonic acid (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) en octadeceen (ODE, 27,6 ml) en de oplossing evacueren met een Schlenk-lijn onder roeren. Verhoog de temperatuur tot 100 ° C en evacueren nog 15 min met een laag kookpunt onzuiverheden te verwijderen. </li><li> Onder argon of stikstofgas, verwarm het mengsel tot 300 ° C gedurende 1 uur volledig oplossen van de CdO. De oplossing verandert van een roodachtige kleur helder en kleurloos. Koel de oplossing tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg hexadecylamine (HDA, 7,0 g) aan de oplossing cadmium, warmte tot 70 ° C en evacueren. Zodra een constante druk is bereikt, de temperatuur stijgen tot 100-110 ° C en reflux de oplossing gedurende 30 minuten. Schakel de Schlenk-lijn klep inert gas en direct plaats de thermokoppel in de oplossing. </li><li> Onder lucht-vrije omstandigheden, voeg difenylfosfine (DPP, 100 pl) aan de oplossing en verhogen de temperatuur tot 310 ° C. Verwijder 7,5 ml van de 0,4 M TOP-Se-oplossing(3 mmol selenium) in een wegwerpbare plastic spuit bevestigd aan een 16 gauge naald. </li><li> Zodra de temperatuur evenwicht bereikt bij 310 ° C, zet de temperatuurregelaar op 0 ° C en snel direct te injecteren de TOP-Se oplossing in het cadmium oplossing. De oplossing zal veranderen van kleurloos tot geel-oranje en de temperatuur zal snel dalen en nemen weer toe tot ~ 280 ° C. Na 1 min reactie Verwijder de kolf uit de verwarmingsmantel en snel koelen met een luchtstroom totdat de temperatuur minder dan 200 ° C. </li><li> Wanneer de temperatuur ~ 40 ° C bereikt, verdunnen met 30 ml hexaan, de meeste van de resterende cadmium voorloper zal vestigen van de oplossing. Verwijder het precipitaat door centrifugeren (5.000 xg, 10 min). </li><li> In zes 50 ml polypropyleen conische centrifugebuis Verdun 12 ml van het ruwe nanokristallen oplossing met 40 ml aceton, centrifuge (5.000 g gedurende 10 min) en decanteer zorgvuldig en verwijder het supernatant. </li><li> Los het nanocrystal pellets in hexaan (25 ml totaal volume). Extract deze oplossing 3 keer met een gelijk volume methanol, behouden de bovenste fase. Voor de derde extractie, kan de hoeveelheid methanol worden aangepast aan ~ 15 ml van een geconcentreerde oplossing van hexaan pure CdSe QDs verkrijgen op ongeveer 200 uM. De typische opbrengst van deze reactie is 3 pmol CdSe nanokristallen met een diameter van 2,3 nm (50-60% reactieopbrengst). </li><li> Bepaal de nanokristallen diameter en concentratie door het meten van de UV-Vis-absorptiespectrum en de raadpleging van de grootte-fitting grafiek van Mulvaney en collega&#39;s 12 en het uitsterven correlaties van Bawendi en collega&#39;s 13. Zie bijlage voor meer informatie. </li><li> Mercury kationenuitwisseling: de nanokristallen kunnen gedeeltelijk worden uitgewisseld met kwik tot rood-verschuiving van de absorptie en fluorescentie-emissie. Meng de volgende om in een 20 ml glazen flesje met roerstaaf (deze reactie kan worden geschaald naar keuze): 3 ml hexaan, 2 ml chloroform, 1 ml 200 pM CdSe QD oplossing (200 nmol), 15 pl oleylamine (OLA) en 500 ul van een 0,1 M oplossing van Hg (OT) 2 in chloroform. Kwik octanethioate (HgOT 2) kunnen worden bereid door kwik acetaat en octanethiol in methanol (zie appendix). De kationenuitwisselingsreactie verloopt, kan de mate van roodverschuiving worden bewaakt met UV-Vis absorptiespectrofotometrie. Nadat de gewenste absorptieband is bereikt, meet de absorptie van de nanokristallen oplossing bij 350 nm en het nieuwe extinctiecoëfficiënt, aannemende dat de concentratie nanokristallen niet veranderd (30,7 uM in dit voorbeeld). Quench de reactie door het verwijderen van de niet-gereageerde kwik: voeg 5 ml decaan, 10 ml hexaan en 7 ml methanol en pak de oplossing, het bijhouden van de bovenste fase die de nanokristallen. Extraheer tweemaal met hexaan en methanol, en het volume van methanol zodat de bovenste fase ~ 7 ml. Als de fasen te scheiden traag, kan de oplossing gecentrifugeerd (5000 xg,10 min). Voeg 100 ul TOP, 100 pl OLA, en 100 pl oliezuur de nanokristallen gevolgd door 40 ml aceton precipitatie te induceren. Verzamel de nanokristallen via centrifugeren en verspreiden in 3 ml hexaan. Centrifugeer opnieuw om onoplosbare componenten te verwijderen en opnieuw bepalen nanokristallen concentratie met de nieuwe extinctiecoëfficiënt bij 350 nm. Laat de oplossing nanokristallen leeftijd ten minste 24 uur bij kamertemperatuur alvorens de volgende stap. </li></ol> 2. De groei van Cadmium Zink Sulfide (Cd y Zn 1-y S) Shell <ol><li> Bereid 0,1 M shell voorloper oplossingen in 50 ml 3-hals kolven. Cadmium precursor: cadmiumacetaat hydraat (230,5 mg, 1 mmol) en 10 ml oleylamine (OLA). Zinc precursor: zinkacetaat (183,5 mg, 1 mmol) en 10 ml OLA. Zwavel precursor: zwavel (32,1 mg, 1 mmol) en 10 ml ODE. Onder vacuüm, verwarmen elke oplossing tot reflux gedurende 1 uur tot heldere oplossingen opleveren, en dan opladen met argon. De oplossing van zwavel kanworden afgekoeld tot kamertemperatuur, maar de cadmium en zink precursors worden gehandhaafd op ongeveer 50 ° C. Berekeningen van shell voorloper hoeveelheden zijn te vinden in referentie 14. </li><li> In een 3-halskolf: Hg x Cd 1-x Se QDs (120 nmol, 2,3 nm diameter), ODE (2 ml) en trioctylphosphine oxide (TOPO, 250 mg). Evacueer uit het hexaan bij kamertemperatuur met behulp van de Schlenk-lijn. Verhoog de temperatuur tot 100 ° C en reflux gedurende 15 minuten. Verander de Schlenk lijn klep argon of stikstofgas en plaats het thermokoppel in de nanokristallen oplossing. </li><li> Verhoog de temperatuur tot 120 ° C, voeg 0,5 monolagen van zwavel precursor oplossing (140 ul) en laat de reactie doorgaan gedurende 15 minuten. Kleine porties (&lt;50 ul) kunnen worden verwijderd met een glazen spuit om de voortgang van de reactie via fluorescentie en / of UV-Vis spectrofotometrie controleren. Verhoog de temperatuur tot 140 ° C, voeg 0,5 monolagen van cadmium voorloperoplossing (140 pl) en laat de reactie doorgaan gedurende 15 minuten. Voeg 500 pl watervrije OLA aan de reactieoplossing. </li><li> Bij 160 ° C voeg 0,5 monolagen zwavel precursor oplossing (220 pl) gevolgd door een gelijke hoeveelheid zink precursor oplossing bij 170 ° C met 15 min tussen elke toevoeging. Vervolgens bij 180 ° C voeg 0,25 monolagen zwavel precursor oplossing (150 pl) en zink precursor oplossing 15 min intervallen. </li><li> Koel de oplossing tot kamertemperatuur en opnieuw berekent een nieuwe extinctiecoëfficiënt voor deze deeltjes met een UV-Vis spectrum, ervan uitgaande dat het aantal nanokristallen niet veranderd (120 nmol in 3,8 ml reactieoplossing). Bewaar de reactieoplossing als een ruw mengsel in een vriezer, de nanokristallen worden ontdooid en gezuiverd als nodig met dezelfde methode beschreven in paragraaf 1.8 en 1.9. </li><li> De nanokristallen kan worden gekarakteriseerd met behulp van elektronenmicroscopie, UV-Vis absorptie spectroscopie en fluorescentiespectroscopie. Kwantumopbrengst kangeheel berekend met een integrerende bol of relatief ten opzichte van een bekende standaard met de referentiemethoden 15. </li></ol> 3. Phase Transfer <ol><li> Voeg gezuiverd kern / schil Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y S QDs (5 ml, 20 uM) in een 50 ml 3-halskolf en verwijderen hexaan onder hoog vacuüm om een droge film werd verkregen. De kolf met argon, voeg watervrije pyridine (3 ml) aan de nanodeeltjes film en verhit slurry tot 80 ° C. In de loop van 1-2 uur de nanodeeltjes zal volledig oplossen. </li><li> Voeg 1-thioglycerol (1 ml) aan de oplossing en geroerd bij 80 ° C gedurende 2 uur. Afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur en voeg triethylamine (0,5 ml) aan thioglycerol deprotoneren. Roer gedurende 30 minuten. De oplossing kan troebel worden na toevoeging van triethylamine vanwege de slechte oplosbaarheid van polaire nanokristallen in dit oplosmiddelmengsel. </li><li> Breng de QD oplossing in een 50 ml conische centrifugebuis containing een mengsel van 20 ml hexaan en 20 ml aceton en meng goed. Isoleer het neergeslagen nanokristallen via centrifugatie (5.000 xg, 10 min), en was het pellet met aceton. </li><li> Los het pellet QD in DMSO (5 ml) met bad sonicatie en centrifuge (7000 xg, 10 min) om mogelijke aggregaten te verwijderen. Bepaal de nanodeeltjes concentratie van een UV-Vis-absorptiespectrum. Deze oplossing zuivere QDs moet binnen 3 uur, het oppervlak thiolen langzaam kan oxideren onder omgevingsomstandigheden in lucht. </li><li> Verdun de QD die 10 micrometer of minder met DMSO en overbrengen naar een 50 ml kolf. Bereid een 5 mg / ml oplossing van gethioleerd polyacrylzuur (synthese beschreven in Appendix) in DMSO. Voeg de polymeeroplossing (0,15 mg polymeer per nmol QDs) druppelsgewijs aan de oplossing onder roeren QD en ontgas de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Spoel de QD / polymeeroplossing met argon en verhit tot 80 ° C gedurende 90 minuten. Afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur eend druppelsgewijs een gelijk volume van 50 mM natriumboraat, pH 8. Roer gedurende 10 minuten. </li><li> Zuiver het QDs via dialyse (20 kDa cutoff) in 50 mM natriumboraat, pH 8, en dan concentreren de deeltjes met een centrifugaal filter (10 kDa cutoff). Het gehalte van een UV-Vis-absorptiespectrum. </li></ol> 4. PEG Coating <ol><li> In een 4 ml glazen flesje met roerstaaf, 1 nmol QDs in boraatbuffer mengen met een 40.000 x molaire overmaat van 750 Da monoamino-polyethyleenglycol (30 mg, 40 umol). Indien een specifieke chemische functionaliteit wordt toegevoegd aan de nanokristallen (bijvoorbeeld hydrazide of maleïmide) kan worden geïntroduceerd door vervanging van een deel van de amino-PEG met een heterobifunctionele amino-PEG (30% molfractie werkt meestal goed). Verdun de nanokristallen oplossing 1 uM met boraatbuffer. Deze reactie kan worden geschaald naar wens. </li><li> Bereid een verse oplossing van DMTMM (20 mg, 72 umol) in DMSO (144 ul). Deze oplossing kan in het kort worden verwarmd under een stroom van warm tapwater of ondergedompeld in een badsonicator volledig oplossen van de DMTMM. Voeg snel een 25.000 x molaire overmaat van deze 0,5 M DMTMM oplossing (50 pl) van de QD oplossing en geroerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Herhaal stap 4.2 vier keer aan de nanokristallen oppervlak verzadigen met PEG. Voeg tenslotte 200 pi 1 M Tris buffer om de reactie te blussen en zuiveren nanokristallen met dialyse, centrifugale filters of ultracentrifugatie. </li><li> De nanokristallen worden geanalyseerd monodispersiteit, hydrodynamische grootte, oppervlaktelading en met vloeistofchromatografie, agarose gel elektroforese en fluorescentie microscopie. Hydrodynamische grootte en grootteverdeling gebruik van een geautomatiseerd systeem vloeistofchromatografie (GE AKTAprime Plus) bepalen met een Superose 6 kolom, een stroomsnelheid van 0,5 ml / min met PBS buffer eluens en absorptie detectie bij 260 of 280 nm. Vergelijk nanodeeltjes elutietijden met die van molecuulgewichtstandaarden. Voor agarose gel electrophoweerstand Bereid een 0,5% agarosegel in 50 mM natriumboraatbuffer (pH 8,5) of 50 mM natriumfosfaat buffer (pH 7,4), 1 uM monsters te mengen met 10% glycerol en belasting in putten, en lopen bij 100 V gedurende 30 min . Afbeelding van de nanokristallen in de gel met behulp van een UV-hand-wand of UV-transilluminator en voor fluorescentie excitatie. Het afbeelden van de nanokristallen op single molecule niveau met fluorescentiemicroscopie de deeltjes tot 0,2 nM verdund in 10 mM fosfaatbuffer, 2,5 ul druppel van de oplossing op een dekglaasje bedekt en voorzichtig een tweede dekglaasje bovenop de vloeistof te verspreiden kraal een film tussen de dekglaasjes. Beeld aan het oppervlak gebonden deeltjes met een hoge numerieke apertuur doel (bij voorkeur ten minste 1,40) hetzij in epifluorescentie of TIRF mode met excitatie golflengte van 400-580 nm en een elektronen vermenigvuldigende CCD camera. Exacte imaging parameters zullen variëren tussen microscopie setup. </li></ol>

<ol><li>Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+tools+for+watching+nanometer-scale+conformational+changes+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+single+molecule+fluorescence+methods+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nat. Method. 7, 275-285 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+cellular+events+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemist%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic cellular events with quantum dots.</a> Biochemist. 32, 12-17 (2010).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugated+quantum+dots+for+in+vivo+molecular+and+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Next-generation quantum dots.</a> Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).</li>
<li>Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+trafficking+of+neurotransmitter+receptor%3A+comparison+between+single-molecule%2Fquantum+dot+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+hydrodynamic+size+of+quantum+dots+with+multifunctional+multidentate+polymer+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+compact+alloyed+quantum+dots+with+broadly+tunable+near-infrared+absorption+and+fluorescence+spectra+through+mercury+cation+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).</li>
<li>Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShriver%2C+DF+%22The+Manipulation+of+Air-Sensitive+Compounds%22">The Manipulation of Air-Sensitive Compounds</a>. , 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).</li>
<li>Errington, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErrington%2C+RJ+%22Advanced+Practical+Inorganic+and+Metalorganic+Chemistry%22">Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry</a>. , Blackie. (1997).</li>
<li>Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+of+the+size-dependent+absorption+properties+of+CdSe+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots.</a> J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).</li>
<li>Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+absorption+cross+section+of+CdSe+nanocrystal+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots.</a> J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).</li>
<li>Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+optical+and+electronic+properties+of+colloidal+nanocrystals+by+lattice+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain.</a> Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).</li>
<li>Demas, J. N., Crosby, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+photoluminescence+quantum+yields.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The measurement of photoluminescence quantum yields. A review.</a> J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).</li>
<li>Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+optical+properties+of+CdSe%2FCdS+heterostructure+nanocrystals%3A+the+effects+of+core+size+and+shell+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).</li>
<li>Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+examination+of+surface+coatings+on+the+optical+and+chemical+properties+of+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).</li>
<li>Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+functionalization+of+aqueous+CdSe%2FZnS+nanocrystals+using+small-molecule+chemical+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators.</a> Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).</li>
<li>Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+and+mercury+toxicity+in+a+human+fetal+hepatic+cell+line+%28WRL-68+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells).</a> Toxicol. 102, 285-299 (1995).</li>
<li>Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+cytotoxicity+of+cadmium+and+mercury+in+a+human+bronchial+epithelial+cell+line+%28BEAS-2B%29+and+its+role+in+oxidative+stress+and+induction+of+heat+shock+protein+70%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).</li>
<li>Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+the+toxicity+of+mercury%2C+cadmium%2C+and+copper+toward+the+isolated+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver.</a> J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Vergeleken met conventionele CdSe quantum dots, kan ternaire legering Hg x Cd 1-x Se nanokristallen worden afgestemd in grootte en fluorescentie golflengte onafhankelijk van elkaar. De grootte wordt eerst geselecteerd tijdens de synthese van CdSe nanokristallen kernen en de fluorescentie golflengte wordt gekozen in een secundaire kwik kationuitwisselingsstap, die niet wezenlijk veranderen de nanokristallen maat 9. Het is belangrijk om de gezuiverde Hg x Cd 1-x Se na...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Selenium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229865 </td><td></td></tr><tr><td> Tri-n-octylphosphine </td><td> Strem </td><td> 15-6655 </td><td> 97% zuiver, stabiel in lucht </td></tr><tr><td> Cadmiumoxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 202894 </td><td> Zeer giftig: Wees voorzichtig </td></tr><tr><td> Tetradecylphosphonic zuur </td><td> PCI Synthese </td><td> 4671-75-4 </td><td></td></tr><tr><td> Octadeceen </td><td> Alfa Aesar </td><td> L11004 </td><td> Technische kwaliteit </td></tr><tr><td> Hexadecylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H7408 </td><td></td></tr><tr><td> Difenylfosfine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252964 </td&gt; <td> Pyrofore </td></tr><tr><td> Mercury acetaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 456012 </td><td> Zeer giftig: Wees voorzichtig </td></tr><tr><td> 1-Octanethiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471836 </td><td> Sterke geur </td></tr><tr><td> Oliezuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W281506 </td><td></td></tr><tr><td> Zinkacetaat </td><td> Alfa Aesar </td><td> 35792 </td><td></td></tr><tr><td> Cadmiumacetaat hydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 229490 </td><td> Zeer giftig: Wees voorzichtig </td></tr><tr><td> Oleylamine </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12954 </td><td> Instabiel lucht </td></tr><tr><td> Zwavel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 344621 </td><td></td></tr><tr><td> Trioctylphosphine oxide </td><td> Strem </td><td> 15-6.661 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Pyridine </td><td> VWR </td><td> EM-PX2,012-6 </td><td> Watervrij </td></tr><tr><td> Thioglycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1753 </td><td> Sterke geur </td></tr><tr><td> Triethylamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 471283 </td><td> Watervrij </td></tr><tr><td> Dialysebuis </td><td> Spectrum Labs </td><td> 131342 </td><td> 20 kDa cutoff </td></tr><tr><td> Centrifugaalfilter </td><td> Millipore </td><td> UFC801024 </td><td> 10 kDa cutoff </td></tr><tr><td> Monoamino-PEG </td><td> Rapp Polymere </td><td> 12 750-2 </td><td> 750 Da </td></tr><tr><td> DMTMM, 4 - (4,6-Dimethoxy-1 ,3,5-triazine-2-yl)-4-methylmorpholinium hydraat </td><td> Alfa Aesar </td><td> H26333 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAprime Plus Chromatografie System </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL chromatografiekolom </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, OmniPur </td><td> VWR </td><td> EM-2120 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Bijlage Synthese van kwik octanethiolate: langzaam een methanoloplossing van kwik acetaat (. 1 eq) toe aan een geroerde oplossing van 1-octanethiol (3 eq.) En kaliumhydroxide (3 eq.) In methanol bij kamertemperatuur. Isoleer het kwik (II) octanethiolate precipitaat door filtratie, wassen tweemaal met methanol en eenmaal met ether en droog onder vacuüm. Synthese van multidentate polymeer: ​​Los polyacrylzuur (1 g, 1.773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in een 150 ml driehalskolf en bel met argon gedurende 30 minuten. Toevoegen watervrije oplossing van cysteamine (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml DMF. Bij kamertemperatuur onder krachtig roeren, langzaam watervrije diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) over 30 minuten, gevolgd door triethylamine (170 pl, 1,22 mmol) en laat de reactie gedurende 72 uur doorgaan bij 60 ° C. Voeg mercaptoethanol (501 mg, 6,41 mmol) om de reactie te blussen en gedurende 2 uur geroerd bij kamertemperatuur. Verwijder DMF via rotatieverdamping en isoleren het polymeer met de toevoeging van een 2:1 mengsel van ijskoude aceton: chloroform, gevolgd door centrifugatie. Los het polymeer in ~ 5 ml watervrij DMF, filter, opnieuw neerslaan met diethylether en herhaal. Droog het product onder vacuüm en bewaar onder argon. Bepaling van CdSe kerndiameter: Uit de UV-Vis-absorptiespectrum bepalen de golflengte van de eerste piek exciton (λ in nm), de langste golflengte piek (bijvoorbeeld ongeveer 498 nm voor CdSe in figuur 2a), en gebruik de dimensionering curve van Mulvaney en medewerkers 12: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq1.jpg" alt= &quot;Vergelijking 1&quot; /&gt; Bepaling van CdSe nanokristallen concentratie: Van een achtergrond-gecorrigeerde, UV-Vis spectrum van een optisch heldere oplossing van CdSe nanokristallen, de absorptie te bepalen bij 350 nm golflengte. Seriële verdunningen worden gebruikt om te bepalen of de optische absorptie in het lineaire bereik van de wet van Beer. De nanokristallen concentratie (QD, in M) kan worden bepaald door de stekker in de nanokristallen diameter (D, in nm), de optische absorptiewaarde (A 3SA) en de cuvette padlengte (l, in cm) in de volgende vergelijking van de empirische correlatie van Bawendi en medewerkers 13: <img src="/files/ftp_upload/4236/4236eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" /></td></tr></tbody></table>

compact quantum dots voor single-molecule imaging

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule beeldvorming is een belangrijk instrument voor het begrijpen van de mechanismen van biomoleculaire functie en voor het visualiseren van de ruimtelijke en temporele heterogeniteit van moleculaire gedrag dat cellulaire biologie 1 tot 4 ten grondslag liggen. Om een ​​afzonderlijk beeld molecuul van belang, is het meestal geconjugeerd aan een fluorescerend label (kleurstof, eiwit, kraal, of quantum dot) en waargenomen met epifluorescentie of totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie. Terwijl kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zijn de steunpilaar van de fluorescentie beeldvorming voor tientallen jaren, hun fluorescentie is niet stabiel onder hoge foton flux die nodig zijn om individuele moleculen te observeren, waardoor slechts een paar seconden van observatie voordat volledig verlies van signaal. Latex kralen en kleurstof gemerkte korrels een verbeterde signaal stabiliteit, maar ten koste van grotere hydrodynamische grootte drastisch, wat nadelig kan veranderen de verspreiding en het gedrag van de moleculen onder studie. ntent &quot;&gt; Quantum dots (QD&#39;s) bieden een evenwicht tussen deze twee problematische regimes. Deze nanodeeltjes zijn samengesteld uit halfgeleidende materialen en kunnen worden gemanipuleerd met een hydrodynamisch compacte afmetingen met een uitzonderlijke weerstand tegen fotodegradatie 5. Aldus in de afgelopen jaren QDs zijn geweest bij zodat op lange termijn observatie van complexe macromoleculaire gedrag op de single molecule-niveau. Maar deze deeltjes hebben nog steeds is gebleken dat een verminderde diffusie vertonen in drukke moleculaire omgevingen, zoals de mobiele cytoplasma en de neuronale synaptische spleet, waar hun maten zijn nog steeds te groot 4,6 , 7. Onlangs hebben wij de engineering van de kernen en oppervlaktecoatings van QDs voor minimale hydrodynamische grootte, terwijl de afweging van offsets aan colloïdale stabiliteit, fotostabiliteit, helderheid en niet-specifieke binding dat het nut van compacte QDs hebben gehinderd in het verleden 8,9. Het doel van dit artikel is aan te tonende synthese, modificatie en karakterisering van deze geoptimaliseerde nanokristallen, bestaande uit een gelegeerd Hg x Cd 1-x Se kern bekleed met een isolerende Cd y Zn 1-y S shell, verder bekleed met een multidentaat ligand polymeer gemodificeerd met korte polyethyleenglycol ( PEG) ketens (figuur 1). Vergeleken met conventionele CdSe nanokristallen, Hg x Cd 1-x Se legeringen bieden meer kwantumopbrengsten van fluorescentie, fluorescentie bij rode en nabij-infrarode golflengten verbeterde signaal-ruisverhouding in cellen en excitatie bij niet-cytotoxische zichtbare golflengten. Multidentaat polymeer coatings binden aan het oppervlak nanokristallen in een gesloten vlakke conformatie om hydrodynamische grootte minimaliseren en PEG neutraliseert de oppervlaktelading om niet-specifieke binding minimaliseren cellen en biomoleculen. Het eindresultaat is een helder fluorescerende nanokristallen met emissie tussen 550 tot 800 nm en een totale hydrodynamische afmeting in de buurt 12 nm. Dit is in de same groottebereik zoveel oplosbare globulaire eiwitten in cellen en aanzienlijk kleiner dan conventionele PEGylated QDs (25-35 nm).

Figuur 2 geeft representatieve absorptie en fluorescentie spectra voor CdSe nanokristallen, Hg x Cd 1-x Se nanokristallen na kationuitwisseling, en Hg x Cd 1-x Se / Cd y Zn 1-y S nanokristallen na shell groei. De kern CdSe nanokristallen hebben een quantum opbrengst van fluorescentie bij 15% (inclusief lange-golflengte diep-trap emissie), maar dit rendement daalt tot minder dan 1% na kwik uitwisseling, waarschijnlijk te wijten aan de drag...

We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.

Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is een belangrijk instrument voor het begrijpen van de mechanismen van biomoleculaire functies en voor het visualiseren van de ruimtelijke en temporele...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van fluorescerende quantum dots met een geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit, evenals een minimale grootte en minimale aspecifieke binding voor gebruik in single molecule imaging. Dit wordt bereikt door eerst kleine cadmiumselenide quantum dot-kernen te prepareren. De tweede stap is om deze kernen te legeren met kwik om hun fluorescentie te verschuiven naar het rode spectrum en hun helderheid te verhogen.Vervolgens wordt een dunne legeringsschil op de nanokristallen gegroeid om hun fluorescentie-emissie te stabiliseren. De laatste stap is het overbrengen van deze deeltjes van organische oplosmiddelen naar waterige buffers met behulp van een multidentaat polymeer, dat kan worden gemodificeerd met biologisch inerte polyethyleenglycol. Ten slotte worden fluorescentiespectrometrie, gelchromatografie en gelelektroforese gebruikt om aan te tonen dat deze deeltjes een heldere fluorescentie, een compacte hydrodynamische grootte en een neutrale elektrostatische lading hebben, eigenschappen die zeer geschikt zijn voor single-molecule fluorescentie-imaging in de biologie.Het belangrijkste voordeel van deze quantum dots ten opzichte

compact-quantum-dots-for-single-molecule-imaging

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

We bieden gedetailleerde instructies voor de bereiding van monovalente gerichte quantum dots (mQD's) van fosforothioaat-DNA van gedefinieerde lengte. DNA-wikkeling vindt plaats met een hoge opbrengst en daarom hoeven de producten niet gezuiverd te worden. We demonstreren het gebruik van de SNAP-tag om mQD's te richten op celoppervlaktereceptoren voor live-celbeeldvormingstoepassingen.

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

Het fabricageproces en experimentele karakteriseringstechnieken die relevant zijn voor enkele-elektronpompen op basis van silicium metaal-oxide-halfgeleider kwantumdots worden besproken.

Silicon metaal-oxide-halfgeleider Quantum Dots voor Single-electron Pumping

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

Resonant excitatie van een enkele zelf geassembleerde quantum dot kan worden bereikt met behulp van een orthogonale naar de fluorescentie collectie modus excitatie-modus. We tonen een methode met behulp van de waveguide en de Fabry-Pérot takken van een vlakke microcavity die rondom de quantumdots. De methode kunt volledige vrijheid in de detectie-polarisatie.

Resonantie fluorescentie van een InGaAs Quantum Dot in een vlakke ruimte met behulp van orthogonale excitatie en detectie

Met behulp van kwantum-dot-gelabeld DNA en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kunnen we het reactiemechanisme van restrictie-endonucleasen onderzoeken met behulp van niet-gelabeld eiwit. Deze techniek met één molecuul maakt massaal gemultiplexte observatie van individuele eiwit-DNA-interacties mogelijk, en gegevens kunnen worden samengevoegd om goed bevolkte verblijftijdverdelingen te genereren.

Single-molecule dwell-time analyse van restrictie endonuclease-gemedieerde DNA-splitsing

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het immuno-labelen van een eiwit in de hartweefselsecties met behulp van quantum dots. Deze techniek biedt een handig hulpmiddel om de subcellulaire lokalisatie en expressie van elk eiwit op ultrastructureel niveau te visualiseren.

Visualisatie van subcellulaire lokalisatie van een eiwit in het hart met behulp van Quantum Dots-Gemedieerde immuno-labeling gevolgd door transmissie-elektronenmicroscopie

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van quantum dot nanobeads (QDNB) en de detectie van ziektebiomarkers met behulp van QDNB-gebaseerde lateral flow immunoassay strips. De testresultaten kunnen binnen 15 minuten kwalitatief worden beoordeeld onder UV-lichtverlichting en kwantitatief worden gemeten met behulp van een fluorescerende striplezer.

Fluorescerende laterale flow-immunoassay op basis van Quantum Dots nanobeads

Leer de bereiding van compacte quantum dots voor single-molecule imaging met geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit. Deze methode minimaliseert de hydrodynamische grootte en niet-specifieke binding voor biologisch onderzoek.

Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

Meer video's verkennen