Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging
October 9th, 2012
We beschrijven de bereiding van colloïdale quantum dots met minimale hydrodynamische grootte voor single-molecule fluorescentie beeldvorming. Vergeleken met conventionele quantum dots, deze nanodeeltjes zijn vergelijkbaar in grootte met globulaire eiwitten en zijn geoptimaliseerd voor single-molecule helderheid, stabiliteit tegen afbraak en resistentie tegen specifieke binding aan eiwitten en cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om fluorescerende quantum dots te bereiden met geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit, evenals geminimaliseerde grootte en niet-specifieke binding voor gebruik in beeldvorming van enkele moleculen. Dit wordt bereikt door eerst kleine cadmiumselenide quantum dot-kernen te bereiden. De tweede stap is om deze kernen te legeren met kwik om hun fluorescentie naar het rode spectrum te verplaatsen en hun helderheid te verhogen.
Vervolgens wordt er een dunne legeringslaag op de nanokristallen gegroeid om hun fluorescentie-emissie te stabiliseren. De laatste stap is om deze deeltjes over te brengen van organische oplosmiddelen naar waterige buffers met behulp van een multi-dentate polymeer, dat kan worden gemodificeerd met biologisch inert polyethyleenglycol. Uiteindelijk worden fluorescentiespectrometrie, gelchromatografie en gelelektroforese gebruikt om aan te tonen dat deze deeltjes heldere fluorescentie hebben, een compacte hydrodynamische grootte en een neutrale elektrostatische lading, kenmerken die goed geschikt zijn voor enkele molecuul fluorescentie beeldvorming in de biologie.
Het belangrijkste voordeel van deze quantum dots ten opzichte van bestaande commerciële materialen is dat deze nanodeeltjes een aanzienlijk verminderde hydrodynamische grootte hebben. Hoewel kleinere quantum dots negatief worden beïnvloed door verminderde fluorescentie-intensiteit, verminderde fluorescentiestabiliteit en alleen fluorescentie in het blauwe spectrum, hebben we deze effecten gecompenseerd met behulp van een kwikkationenuitwisselingsproces. Deze nanokristallen kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biofysica en cellulaire signalering door dynamische beeldvorming van enkele biomoleculen in drukke biologische omgevingen mogelijk te maken.
Om te beginnen, bereid een 0,4 molaire oplossing van selenium in tolueen door selenium toe te voegen aan een 50 milliliter driehalsfles, de fles onder hoog vacuüm te evacueren en te vullen met argon met behulp van een sch shank lijn onder luchtloze omstandigheden. Voeg 10 milliliter tolueen toe en verwarm gedurende een uur onder roeren tot 100 graden Celsius om een heldere, kleurloze oplossing te verkrijgen.
Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en zet de fles opzij. Bereid ook een oplossing van cadmiumoxide TDPA en ODE in een driehalsfles van 250 milliliter met behulp van de hoeveelheden die in het geschreven protocol staan vermeld. Gelijktijdig met deze video, evacueer de oplossing met behulp van een shank lijn terwijl geroerd wordt.
Verhoog de temperatuur tot 100 graden Celsius en evacueer gedurende nog eens 15 minuten. Om verontreinigingen met laag kookpunt onder argongas te verwijderen, verwarm het mengsel gedurende een uur tot 300 graden Celsius om het cadmiumoxide volledig op te lossen. De oplossing zal van een roodachtige kleur veranderen naar helder en kleurloos, koel de oplossing af tot kamertemperatuur.
Voeg vervolgens HDA toe aan de cadmiumoplossing, verwarm tot 70 graden Celsius en evacueer. Zodra een constante druk is bereikt, verhoog de temperatuur en reflux de oplossing gedurende 30 minuten. Schakel de schlink lijn klep naar inert gas en steek de thermokoppel direct in de oplossing.
Onder luchtloze omstandigheden, voeg DPP toe aan de cadmiumoplossing en verhoog de temperatuur tot 310 graden Celsius. Gebruik nu een wegwerpspuit van plastic met een naald van 16 gauge om 7,5 milliliter van de 0,4 molaire tolueenoplossing van selenium te verwijderen. Zodra de temperatuur is geëgaliseerd tot 310 graden Celsius, stel de temperatuurregelaar op nul graden Celsius en injecteer snel de tolueenoplossing van selenium rechtstreeks in de cadmiumoplossing.
De oplossing zal van kleurloos veranderen in geel, oranje en de temperatuur zal snel dalen en weer stijgen tot ongeveer 280 graden Celsius. De moeilijkste stap in deze procedure is om het hele volume van de spuit zo snel mogelijk in de cadmiumoplossing te injecteren. Dit zorgt ervoor dat de deeltjes homogeen nucleëren.
Na een minuut reactie, verwijder de fles van de verwarmingsmantel en koel snel af met een stroom lucht tot de temperatuur minder dan 200 graden Celsius is. Wanneer de temperatuur ongeveer 40 graden Celsius bereikt, verdun met 30 milliliter hexaan, de meeste resterende cadmiumprecursor zal uit de oplossing bezinken. Verwijder dit bezinksel door centrifugatie.
Verdun in elke van de zes 50 milliliter polypropyleen kegelvormige centrifugeerbuizen 12 milliliter van de resulterende ruwe nanokristalsooplossing. Met 40 milliliter aceton, volg gecentrifugeerd met dezelfde parameters, giet voorzichtig af en gooi het supernatant weg. Los vervolgens de nanokristappels op in hexaan.
Trek de oplossing uit met een gelijk volume methanol, waarbij de bovenste fase behouden blijft. Herhaal deze extractie nog twee keer voor de derde extractie. Het volume methanol kan worden aangepast tot ongeveer 15 milliliter om een geconcentreerde hexaanoplossing van pure cadmiumselenide quantum dots te verkrijgen met ongeveer 200 micromolar.
De typische opbrengst van deze reactie is drie micromolar cadmiumselenidekristallen met een diameter van twee tot drie nanometer. Bepaal de diameter en concentratie van de nanokristappels door het ultraviolet zichtbare absorptiespectrum te meten zoals beschreven in de geschreven procedure. De nanokristallen kunnen gedeeltelijk worden uitgewisseld met kwik om het absorptie- en fluorescentie-emissieroodverschuiving te verkrijgen. Om dit te doen, meng in een glazen schaal van 20 milliliter met roerbare staaf hexaan en chloroform, voeg dan de cadmiumselenide quantum dot-oplossing OLA en kwikoctaannoplossing toe. Na het zuiveren van de nanokristallen en het bepalen van hun concentratie zoals beschreven in de geschreven procedure, laat de nanokristallen minimaal 24 uur op kamertemperatuur verouderen voor schillengroei.
Bereid 0,1 molaire schillenvoorlopers in 50 milliliter driehalsflessen onder vacuüm. Verhit oplossingen van cadmiumprecursor, zinkprecursor en zwavelprecursor tot reflux gedurende een uur om heldere oplossingen te verkrijgen, laad vervolgens met argon in een driehalsfles. Voeg topo ODE en bereide kwikcadmiumselenide quantum dots toe. Evacueer het hexine bij kamertemperatuur met
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de voorbereiding van colloïdale kwantumdots geoptimaliseerd voor fluorescentiebeeldvorming op enkele moleculen. Deze nanodeeltjes zijn ontworpen met minimale hydrodynamische grootte, verbeterde helderheid en stabiliteit tegen fotodegradatie.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nanotechnologie
- Fluorescentiebeeldvorming
- Biofysica
Achtergrond
- Kwantumdots zijn halfgeleider-nanodeeltjes die unieke optische eigenschappen vertonen.
- Ze worden gebruikt in verschillende biologische beeldvormingstoepassingen vanwege hun helderheid en stabiliteit.
- Het minimaliseren van de grootte en niet-specifieke binding verbetert hun bruikbaarheid in studies op enkele moleculen.
- Cadmiumselenide is een veelgebruikt materiaal voor kwantumdotkernen.
Doel van Studie
- Het bereiden van fluorescente kwantumdots met geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit.
- Het verkleinen van de grootte van kwantumdots voor betere compatibiliteit met biologische systemen.
- Het verminderen van niet-specifieke binding aan eiwitten en cellen.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van kleine cadmiumselenide kwantumdotkernen.
- Legering van kernen met kwik om fluorescentie naar het rode spectrum te verplaatsen.
- Groei van een dunne legeringsschil op de nanodeeltjes om fluorescentie-emissie te stabiliseren.
- Overbrengen van deeltjes van organische oplosmiddelen naar waterige buffers met behulp van een multi-dentate polymeer.
Belangrijkste Resultaten
- Deeltjes vertonen heldere fluorescentie geschikt voor beeldvorming.
- De hydrodynamische grootte is compact, vergelijkbaar met globulaire eiwitten.
- Neutrale elektrostatische lading minimaliseert niet-specifieke interacties.
- Karakteriseringstechnieken bevestigen de effectiviteit van de bereidingsmethode.
Conclusies
- Geoptimaliseerde kwantumdots zijn effectief voor fluorescentiebeeldvorming op enkele moleculen.
- De bereidingsmethode verbetert de helderheid en stabiliteit terwijl de grootte wordt geminimaliseerd.
- Deze nanodeeltjes kunnen waardevolle hulpmiddelen zijn in biologische onderzoek.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Compact quantum dots enable prolonged single-molecule imaging in crowded biological environments by combining high photostability with minimized hydrodynamic size. This addresses a key limitation in biophysics and cellular signaling studies where conventional labels either photobleach rapidly or perturb native molecular behavior due to size. The technology supports target validation and mechanistic de-risking by allowing direct observation of biomolecular dynamics under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of single biomolecule interactions in complex milieus.
- Operational Value: Provides stable, long-duration signal for tracking transient binding events and conformational changes.
- Predictive Value: Reduces false negatives in target engagement assays by minimizing label-induced artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-molecule resolution data on binding kinetics and heterogeneity.
- Operational Value: Compatible with TIRF and epifluorescence microscopy, requiring no specialized imaging infrastructure beyond standard fluorescence setups.
- Assay Readiness: Hydrodynamic size near 12 nm allows use in physiological buffers without significant diffusion hindrance.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Emission tunable to red/NIR wavelengths (550-800 nm) supports deep-tissue imaging and reduces autofluorescence in vivo.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of single-molecule behavior with cellular phenotypes in disease-relevant models.
- Scalability: Surface PEGylation ensures batch-to-batch consistency in colloidal stability and low nonspecific binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to mechanistic follow-up, particularly for validating targets in complex cellular contexts where size and photostability are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of single-molecule interactions in live-cell environments.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence intensity and blinking statistics as reliable readouts for compound effect assessment.
- Analytics: Outputs include hydrodynamic size (via gel chromatography), surface charge (via gel electrophoresis), and emission spectra (via fluorescence spectrometry) for multiparametric validation.
- Translational Research: Red/NIR emission facilitates transition to preclinical imaging studies without label redesign.
- Enterprise Reuse: Core synthesis and surface modification steps are modular, allowing adaptation across different biomolecular targets and assay formats.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from label artifacts.
- Operational Value: Standardized synthesis and aqueous transfer protocol ensure reproducibility across laboratories and projects.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on direct, single-molecule evidence of target engagement rather than population averages.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing early, high-resolution mechanistic data on lead candidates.
Implementation Considerations
- Expertise in nanomaterial synthesis and air-free Schlenk techniques required for core alloying and shell growth.
- Need for UV-Vis fluorescence spectrometry, gel chromatography, and gel electrophoresis for quality control.
- Standardization of PEGylation conditions critical for maintaining neutral surface charge and hydrodynamic size.
- Adaptation to different biomolecules requires optimization of conjugation chemistry while preserving compact size.
- Limited by the need for rigorous oxygen and moisture control during synthesis to prevent oxidation.
