Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)
27 mei 2012
Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.
Hallo.In deze video presenteren we een volledige enkele kwantumtrackingexperiment. Een speciaal algoritme is volledig ontworpen in samenwerking met ISIS-experts op het gebied van beeldvorming. Gedurende deze video zullen we het epidermale groeifactorreceptor gebruiken als een model om de methode van deze techniek te beschrijven.
De epidermale groeifactorreceptor is een transmembraaneiwit. Deze receptor zal worden getagd met behulp van een monoklonaal antilichaam, dat is teruggebracht om alleen het A en B fragment te behouden. Het A en B fragment is gebiotinyleerd en vervolgens gekoppeld aan de streptavidin van de kwantumstip, waardoor het wandsysteem de EGF-receptor precies herkent.
Ons doel is om een uitgebreid overzicht te bieden van de dynamica van celoppervlaktereceptoren. Inderdaad, moleculaire trajecten kunnen afwijken van brotdiffusie doordat ze beperkt worden binnen nanodomeinen. Dit kan bijvoorbeeld de signatuur zijn van een onderliggende interactie met, bijvoorbeeld, signaalpartners of moleculaire skeletten.
We streven ernaar dergelijke gebeurtenissen volledig te beschrijven door ze op de cel in kaart te brengen, wat vereist dat we met een hoge SPECT-temporesolutie werken, samen met een hoge labeldichtheid. We noemen deze aanpak daarom multi-target tracing. De eerste stap van het experiment is de voorbereiding van het monster.
We werken op levende cellen zonder antibiotica. Hier gebruiken we kosten zeven cellen, die endogeen EGF-receptoren tot expressie brengen. Nadat de cel is losgemaakt, moeten we precies bevestigen om dezelfde aantallen cellen in elk lab-wel te hebben.
Een precies aantal cellen is erg belangrijk om de voorspelbaarheid voor het aantal kwantumstippen per cel te verhogen. Na het verdelen van de cel in H-wel, moet u de labate gedurende 24 uur incuberen bij 37 graden met 7% CO2. De volgende stap is de voorbereiding van kwantumstippen gekoppeld aan antilichamen. Kwantumstippen zijn kleine fluorescente nanodeeltjes.
Deze deeltjes zijn hier erg interessant omdat ze erg helder en stabiel zijn in vergelijking met klassieke fluorescente sondes en signalen. De signaal-ruisverhouding is erg belangrijk voor dit soort experimenten. In dit geval gebruiken we compleet medium om de strip ides rond de kwantumstippen te verzadigen en om aggregatie te voorkomen.
Daarna hadden we de kwantumstippen in het bioTE-gerelateerde eiwit of antilichamen van belang met een een-op-een-verhouding om statistisch meer monovalente kwantumstippen te hebben. In dit experiment gebruiken we een a b-fragment tegen EGF-receptor geproduceerd in het lab uit monoklonale antilichamen en die zijn getarget met biotine. Tijdens de incubatie van ongeveer 15 minuten kunt u het controle onder aggregatie en homogeniteit houden met behulp van een shaker bij 1.200 rotaties per minuut en twee vijf graden.
Wanneer de mix klaar is, kunt u deze op uw cellen toevoegen. Verwijder voorzichtig het medium uit de put om celdetachment op de lab-techniek te voorkomen en voeg de benodigde hoeveelheid mix toe voor uw experiment. In dit geval zullen we 100 microliter mix per put toevoegen.
Na toevoeging van de mix kunt u uw cel gedurende 15 minuten incuberen. In dit geval bij 37 graden met 7% CO2. Na deze incubatie kunt u mogelijk een hoog aantal frequente tweelingtippen in suspensie in het medium vinden.
Deze kwantumstippen moeten worden verwijderd vóór beeldvorming. Vanwege de ruis die we brengen. Dat is waarom we elk, in dit geval vijf keer, moeten wassen om uzelf te wassen.
Gebruik beeldvormingsmedium met niet-autofluorescentie. Hier gebruiken we HBSS-buffer met aps. Nu zijn uw cellen klaar.
Het is tijd om naar de opstelling voor acquisitie te gaan. De opstelling bestaat uit vier belangrijke onderdelen, een omgekeerde microscoop, een camera met ooggevoeligheid, een krachtige kwiklamp en een incubator om cellen op 37 graden te houden. Het licht van de kwiklamp gaat door een vezel en door een filterwiel voordat het de steekproef belicht.
De fluoreSense van de steekproef wordt gefilterd en verzameld door een E-M-C-C-D-camera aan de linkerkant. We gebruiken momenteel 1.3 en 1.49 numerieke apertuuroliedoelen. De centrale stap van dit experiment is de acquisitie op zichzelf.
Zodra de cellen scherp staan, kijken we naar een representatief exemplaar met een sterke label. In kwantumstippen verkrijgen we eerst een enkele afbeelding in doorgelaten wit licht, die verder kan worden gebruikt om de celaspect en speciale limiet van de LA-podia te controleren. We verwerven vervolgens video's, meestal met een snelheid van 36 milliseconden, de snelste snelheid die is toegestaan in de volledige frame.
We gebruiken een elektronenvermenigvuldigende CCD om gevoeligheid voor enkele moleculen te bereiken met een voldoende signaal-ruisverhouding van minimaal boven 20 decibel. Meestal rond de 25 decibel verwerven we meestal 300 frames. Om een bepaalde dataset te evalueren, hoeft u alleen de pas naar de directory met de videobestanden te bieden.
Vervolgens typt u de opdracht, de tekst herstelt de verbinding in MetLab of de opdracht MTT 23 I, die eerst een grafische interface weergeeft. Alle gebruikte parameters starten de volledig geautomatiseerde analyse. De kern-MTT-analyse wordt over elke frame uitgevoerd, waarbij drie hoofdtaken worden uitgevoerd, eerst detectie voor elke pixel voor de aanwezigheid of afwezigheid van een doelkwantumstip.
Vervolgens voor elke detectie schatting van de relevante parameters van het doel, zoals de pixelpositie, signaalintensiteit, enzovoort. Laatste herstel van de nieuwe doelen. Met de sporen die al zijn gebouwd over de vorige frames voor elke pixel.
Als we een lokale subregio beschouwen, vergelijken we twee hypothesen van aanwezigheid, ofwel van alleen ruis of van een signaal. Met de puntverspreidingsfunctie heeft ModuLite een hin-piek. We gebruiken een drempel die lage valse alarmen verzekert met minder dan één detectie per frame voor elke gedetecteerde doel.
Vervolgens voeren we een minstkwadraten-ghost-voedingsvoeten uit om de positiebreed
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuw algoritme voor het volgen van individueel gelabelde moleculen binnen het plasmamembraan van levende cellen. De methode richt zich op de epidermale groeifactorreceptor als model en biedt een uitgebreid hulpmiddel voor het onderzoeken van nanoschalige membraandynamiek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- De epidermale groeifactorreceptor is een transmembraaneiwit.
- Het volgen van moleculaire dynamica is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Hogedichtheidsdetectie en tracering van moleculen verbeteren de experimentele nauwkeurigheid.
- Samenwerking met experts in beeldanalyse verbetert de ontwikkeling van het algoritme.
Doel van het onderzoek
- Om een gebruiksvriendelijk algoritme te ontwikkelen voor het volgen van moleculen.
- Om de nanoschalige dynamica van membraaneiwitten te onderzoeken.
- Om de epidermale groeifactorreceptor als model voor de techniek te gebruiken.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een specifiek volgalgoritme.
- Tagging van de epidermale groeifactorreceptor met een monoklonaal antilichaam.
- Biotinylering van het antilichaamfragment voor quantum dot-koppeling.
- Gebruik van geavanceerde beeldvormingstechnieken voor gegevensverzameling.
Belangrijkste resultaten
- Het algoritme volgt met succes gelabelde moleculen in real-time.
- Hogedichtheidsdetectie maakt een gedetailleerde analyse van membraandynamiek mogelijk.
- De methode biedt inzicht in het gedrag van transmembraaneiwitten.
- Samenwerking met experts verhoogt de robuustheid van de bevindingen.
Conclusies
- Het ontwikkelde algoritme is effectief voor het volgen van membraaneiwitten.
- Deze techniek kan de begrip van cellulaire dynamica bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen verschillende transmembraaneiwitten omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mapping molecular diffusion in the plasma membrane enables precise characterization of receptor dynamics, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. By providing high-density, single-molecule tracking data, Multiple-Target Tracing (MTT) enhances predictive confidence in understanding protein interactions and confinement events critical for signaling pathway analysis. This approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining quantitative, spatially resolved insights into membrane organization that inform lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping receptor localization, mobility, and confinement patterns at nanometer scale.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of receptor interactions with signaling partners or scaffolds.
- Predictive Value: Generates quantitative descriptors such as diffusion coefficients and confinement indices to assess target behavior under physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline receptor dynamics in live cells.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through high-density detection and algorithmic trace reconnection.
- Scalability: Facilitates platform reuse across membrane protein targets due to MTT’s applicability at any scale, from molecules to cells.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase membrane dynamics to preclinical validation by enabling comparison of receptor behavior across model systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies confinement variations that may reflect underlying interactions with cytoskeleton or lipid domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides dynamic measures that complement complementary approaches like FRAP or FCS for informed go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
MTT fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, offering a reusable capability for studying membrane protein dynamics across multiple projects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying receptor confinement, slowdown, and interaction signatures in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through high spatiotemporal resolution and quantitative outputs like peak intensity and signal-to-noise ratio.
- Analytics: Provides statistical outputs including local diffusion values and confinement indices that enable cross-condition comparison and trajectory classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing dynamic measures to be compared with orthogonal techniques for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a standardized tracking algorithm applicable to diverse transmembrane proteins, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct nanoscale observation of receptor dynamics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated peak detection, estimation, and reconnection with deflation to handle high-density labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying quantitative, replication-ready data that reduce late-stage biological risk in target advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by delivering dynamic membrane phenotype data that inform target selection and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule videomicroscopy and image analysis for optimal setup and parameter tuning.
- Depends on instrumentation capable of high-speed, low-noise acquisition, including EM-CCD cameras and mercury lamp illumination.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quantum dot conjugation, and imaging conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying MTT to different model systems or membrane protein targets beyond EGFR.
- Includes practical limitations such as the need for high labeling density and manageable signal-to-noise ratios to ensure accurate peak detection and trace reconnection.
