Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Hallo. In deze video presenteren we een volledig experiment voor het volgen van enkele kwantumdeeltjes. Een specifiek algoritme is volledig ontwikkeld in samenwerking met experts van image ISIS. Tijdens deze video gebruiken we de epidermale groeifactorreceptor als model om de methode van deze techniek toe te lichten.

De epidermale groeifactorreceptor is een transmembraaneiwit. Deze receptor wordt gelabeld met een monoklonaal antilichaam, dat wordt gereduceerd om enkel het Fab-fragment te behouden. Het Fab-fragment wordt gebiotinyleerd en vervolgens gekoppeld aan het streptavidine van de quantum dot, waardoor het hele systeem de EGF-receptor nauwkeurig zal herkennen.

Ons doel is om een uitgebreid beeld te geven van de dynamiek van receptoren op het celoppervlak. Moleculaire trajecten kunnen namelijk afwijken van brownse diffusie door opgesloten te raken binnen nanodomeinen. Dit kan bijvoorbeeld de signatuur zijn van een onderliggende interactie met, bijvoorbeeld, signaleringspartners of moleculaire scaffolds.

Wij streven ernaar om dergelijke gebeurtenissen uitputtend te beschrijven door ze over de cel in kaart te brengen, wat vereist dat er gewerkt wordt met een hoge temporele SPECT-resolutie in combinatie met een hoge labelingsdichtheid. We noemen deze benadering daarom multi target tracing. De eerste stap van het experiment is de preparatie van het monster.

We werken met levende cellen zonder antibiotica. Hier gebruiken we Cos-7-cellen, die endogeen EGF-receptoren tot expressie brengen. Na het losmaken van de cellen moeten we deze nauwkeurig tellen om in elke put van de plaat hetzelfde aantal cellen te hebben.

Een nauwkeurig aantal cellen is zeer belangrijk om de voorspelbaarheid van het aantal quantum dots per cel te vergroten. Na het uitplaten van de cellen in de H-well, moeten de cellen gedurende 24 uur worden geïncubeerd bij 37 °C met 7% CO2. De volgende stap is de preparatie van quantum dots gekoppeld aan antilichamen. Quantum dots zijn kleine fluorescente nanodeeltjes.

Deze partikels zijn hier zeer interessant omdat ze zeer helder en stabiel zijn in vergelijking met klassieke fluorescente probes en signalen. De signaal-ruisverhouding is zeer belangrijk voor dit type experiment. In dit geval gebruiken we volledig medium om de strips rond de quantum dots te verzadigen en aggregatie te voorkomen.

Daarna hebben we de quantum dots gemengd met het biotinylated eiwit of de antilichamen van interesse in een one-op-one ratio, om statistisch gezien meer monovalente quantum dots te verkrijgen. In dit experiment gebruiken we een Fab-fragment tegen de EGF-receptor, geproduceerd in het lab vanuit monoclonale antilichamen en gelabeld met biotine. Tijdens de incubatie van ongeveer 15 minuten kunt u aggregatie en homogeniteit beheersen door gebruik te maken van een shaker op 1.200 omwentelingen per minuut bij 25 °C.

Wanneer het mengsel gereed is, kunt u het aan uw cellen toevoegen. Verwijder het medium zeer voorzichtig uit het well om te voorkomen dat cellen loslaten door de techniek en voeg de benodigde hoeveelheid mengsel voor uw experiment toe. In dit geval voegen we 100 µL mengsel per well toe.

Na toevoeging van het mengsel kunt u de cel 15 minuten incuberen. In dit geval bij 37 °C met 7% CO2. Na deze incubatie kunt u een groot aantal frequente tweelingstippen in suspensie in het medium waarnemen.

Deze quantum dots moeten voor het beeldvormen worden verwijderd vanwege de ruis die ze veroorzaken. Daarom moeten we elke put meerdere keren wassen, in dit geval vijf keer, om ze volledig te reinigen.

Gebruik een imagingmedium zonder autofluorescentie. Hier gebruiken we HBSS-buffer met aps. Nu zijn uw cellen klaar.

Het is tijd om naar de opstelling voor acquisitie te gaan. De opstelling bestaat uit vier hoofdonderdelen: een omgekeerde microscoop, een camera met hoge gevoeligheid, een krachtige kwiklamp en een incubator om de cellen op 37 °C te houden. Het licht van de kwiklamp gaat via een vezel en een filterwiel voordat het het monster belicht.

De fluorescentie van het monster wordt gefilterd en opgevangen door een E-M-C-C-D-camera aan de linkerzijde. We maken momenteel gebruik van objectieven met een numerieke apertuur van 1,3 en 1,49 met olie-immersie. De centrale stap van dit experiment is de acquisitie zelf.

Zodra de cellen in focus zijn, bekijken we een representatieve cel met een sterke markering. Bij quantum dots maken we eerst een enkele afbeelding in doorgelaten wit licht, die vervolgens kan worden gebruikt om het aspect van de cel en de ruimtelijke begrenzing van de LA-podia te controleren. Vervolgens maken we video-opnamen, doorgaans met een snelheid van 36 milliseconden, de hoogste snelheid die mogelijk is bij volledige beeldomvang.

We gebruiken een electron multiplying CCD om een gevoeligheid voor enkelvoudige moleculen te bereiken met een voldoende signaal-ruisverhouding van ten minste boven de 20 decibel. Doorgaans rond de 25 decibel, waarbij we gewoonlijk 300 frames vastleggen. Om een gegeven dataset te evalueren, hoeft u alleen het pad naar de directory met de videobestanden op te geven.

Na het typen van het commando, wordt de tekst opnieuw verbonden in MetLab of het commando MTT 23 I, dat eerst een grafische interface weergeeft. Alle gebruikte parameters zullen de volledig geautomatiseerde analyse starten. De kernanalyse van MTT wordt voor elk frame uitgevoerd, waarbij drie hoofdtaken worden aangeroepen, allereerst detectie voor elke pixel voor de aanwezigheid of afwezigheid van een target quantum debt.

Vervolgens wordt voor elke detectie een schatting gemaakt van de relevante parameters van het doelwit, zoals de pixelpositie, signaalintensiteit, enzovoort. Tot slot volgt de reconnectie van de nieuwe doelwitten, met de sporen die reeds over de voorgaande frames voor elke pixel zijn opgebouwd.

Bij het beschouwen van een lokale subregio vergelijken we twee hypothesen over de aanwezigheid: ofwel enkel ruis, ofwel een signaal. Met de point spread function heeft ModuLite een dunne piek. We gebruiken een drempelwaarde die een voldoende laag aantal valse alarmen garandeert, met minder dan één foutieve detectie per frame voor elk gedetecteerd doelwit.

Vervolgens voeren we een kleinste-kwadraten-fit van een Gaussische functie uit om de positie, breedte en hoogte van de gedetecteerde Gaussianen te schatten. Dit levert met name de specifieke positie van de kleurstof op, doorgaans met een nauwkeurigheid van ongeveer 10 tot 20 nanometer voor typische signaal-ruisverhoudingen. Bij pieken met een hoge dichtheid kunnen pieken vaak te dicht bij elkaar liggen en kunnen sterke pieken de zwakste hinderen; om dit aan te pakken, defleren we de gedetecteerde pieken uit het oorspronkelijke beeld.

Bovendien kan detectie op het residu doorgaans ongeveer 10% van de pieken opnieuw scheef trekken. Het bereiken van een bijna volledige detectie is zeer vruchtbaar voor een nauwkeurige reconnectie. Vervolgens wordt de set nieuwe targets gekoppeld aan de set vorige sporen voor deze pupil.

Om elk spoor indien mogelijk aan een target toe te wijzen en mogelijk knipperen (blinking) op te vangen, gebruiken we alle beschikbare statistische informatie die uit de detectiestap is verkregen. Targets worden daarom niet simpelweg toegewezen aan het dichtstbijzijnde spoor. In geval van conflicten, wanneer sporen elkaar kunnen kruisen — wat betekent dat de respectievelijke relevante onderzoeksgebieden overlappen — houden we rekening met de statistische waarde van intensiteit, snelheid, breedte en knipperen, zowel voor de sporen als voor de targets.

Dit levert de statistisch optimale reconnectiescore op. De strategie maakt het mogelijk om, waar mogelijk, een bias van de reconnectie naar de dichtstbijzijnde buren te vermijden, wat zou neerkomen op de traagste beweging. Vervolgens gebruiken we een functie om mogelijke tijdelijke beperking (transient confinement) binnen de trajecten te evalueren.

Deze functie is omgekeerd proportioneel aan de lokale diffusie, zoals vastgesteld door Sexton Simpson en collaborateurs. Door een drempelwaarde toe te passen, kunnen perioden van opsluiting (confinement) of het ontbreken daarvan worden gedefinieerd. Door dit over alle sporen te itereren, kunnen we uiteindelijk de membraandynamiek in kaart brengen in termen van transiënte opsluiting en bewijzen van vertraging, en kan dit worden weergegeven.

Als alternatief, door gebruik te maken van de binaire of discrete waarden van deze opsluitingsindex, zal MTT standaard deze taken automatisch uitvoeren en voor elke video de rijparameters voor elke piek opslaan in een eski-bestand, ten behoeve van verdere geavanceerde onderzoeken. Typische resultaten, zoals de kaart van sporen over elke cel en histogramplots voor parameters van belang, piekintensiteiten, signaal-ruisverhouding en lokale deficiëntiewaarden, kunnen op deze manier eenvoudig worden aangepast aan elk specifiek onderzoek. Deze video zal nu de typische resultaten samenvatten die met MTT zijn behaald.

Een aanzienlijk deel van het werk bestaat uit het uitwerken van het algoritme, dat mogelijk moet worden aangepast voor specifieke onderzoeken, zoals de verschillende bewegingsmodi of interacties. Het uitvoeren van MTT is echter zeer eenvoudig. Gebruikers hoeven slechts enkele parameters te optimaliseren, zoals de ruimte- en tijdslimieten.

Bij de uitwerking van MTT streefden we ernaar om de analytische opties voor elke taak volledig te heroverwegen. We optimaliseren het proces langs twee uitdagende assen. Ten eerste het omgaan met hoge dichtheden om de beste ruimtelijke informatie over het oppervlak te verkrijgen, en ten tweede het hanteren van een zwakke SNR, wat doorgaans werken bij een lage eliminatie en hoge snelheid mogelijk maakt; opsluiting kan worden geïnterpreteerd als de signatuur van een onderliggende interactie.

Membraanreceptoren kunnen bijvoorbeeld interageren met het submembraan cytoskelet of pro-lipidedomeinen. Dergelijke gebeurtenissen kunnen worden onderzocht via variaties in confinement in ruimte en tijd. Dynamische metingen kunnen worden vergeleken met complementaire benaderingen zoals FRAP, FCS of FRET.

De opensourcecode is beschikbaar voor academisch onderzoek. Deze kan worden gedownload via onze webpagina op CML dot univ onder S fr op onze teampagina, waar een downloadlink wordt aangeboden. Geïnteresseerde industriële partijen zijn eveneens welkom om contact met ons op te nemen.

Wij willen graag speciaal onze teamleden en de medewerkers van de gemeenschappelijke faciliteiten bedanken voor de ondersteuning en de vruchtbare discussies. Dit project wordt ondersteund door financiering van het CNRS in c MAA University Pac Region National de La, en de Foundation Medical wordt ondersteund door de league controller. Bedankt voor het kijken.