Visualisatie van subcellulaire lokalisatie van een eiwit in het hart met behulp van Quantum Dots-Gemedieerde immuno-labeling gevolgd door transmissie-elektronenmicroscopie

Het bepalen van de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is van cruciaal belang voor het afbakenen van de juiste functie en de mechanismen die daarbij betrokken zijn. Deze methode kan ons helpen de subcellulaire lokalisatie van een eiwit op ultrastructuurniveau te visualiseren. Quantum dots-gemedieerde immunolabeling is stabieler, bestand tegen fotobleaching, heeft zijn eigen emissiespectra, levert een hoge elektronendichtheid op en vertoont een hogere efficiëntie en retentie op weefsels met een betere penetratie in weefsels.

Meerdere stappen van het proces, dat wil zeggen fixatie, etsen, blokkeren en optimale quantum dots-concentratie, zijn uitdagende stappen om te optimaliseren. Het is raadzaam om meerdere tijdstippen en concentraties van de gebruikte reagentia te proberen. Een andere uitdaging is het hanteren van roosters waarvoor alleen geduld en natuurlijk oefenen werkt.

Chowdhury Abdullah, een postbode, Naznin Remex, een afgestudeerde student van mijn laboratorium, en Brandon Hartman, supervisor elektronenmicroscopie van onze elektronenmicroscopiediensten, demonstreren. Na het verdoven van de muizen en het openen van de borstholte, overvloedig het hart met behulp van ijskoude 3% glutaaraldehyde in 0,1 molaire natriumcacroodylaatbuffer gedurende twee minuten. Gebruik een naald van 25 gauge van vijf bij acht inch om de fixatiemiddelen in het hart te brengen met behulp van zwaartekrachtdruk.

Onmiddellijk nadat het hart zich begint te vullen met het fixatiemiddel, tilt u de top van het hart op om de druk te verlichten. Snijd de vaten eronder op één tot twee millimeter van het hart en laat de vloeistoffen weglopen. Ontleed het hart.

Verwijder de boezems en laat de ventrikels in een petrischaaltje met ijskoud 3% glutaaraldehyde en 0,1 molair natriumcacodylaat vallen. Maak een vlindersnede na 30 tot 60 minuten fixatie en plaats de ventrikel terug in de petrischaal. Hak het hart met behulp van een chirurgisch mes in kleine blokjes van één kubieke millimeter.

Fixeer en dompel het ontleede hartweefsel onder in glutaaraldehyde en cacodylaatoplossing gedurende 24 uur bij vier graden Celsius. Was na 24 uur fixatie het weefsel tweemaal gedurende 20 minuten in 0,1 molaire natriumcacrodaatbuffer. Verwijder het weefsel uit de natriumcacrodronaatbuffer en dompel het gedurende vier uur bij kamertemperatuur onder in 2% osmiumtetroxideoplossing.

Dompel na osmicatie het weefsel onder in 2% natriumacetaatoplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dompel vervolgens het weefsel onder in 2% uranylacetaatoplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na uranylacetaatkleuring, droog het weefsel achtereenvolgens uit door de gesorteerde alcoholen en aceton.

Integreer het gedehydrateerde weefsel in epoxyhars met lage viscositeit zoals beschreven in het manuscript. Doe het weefsel in verse hars in acht millimeter microvormen en hard het ingebedde weefsel 's nachts uit bij 70 graden Celsius. Na het vinden van het interessegebied, met behulp van een ultra 45 graden mes, produceren lichtgouden ultradunne secties.

Plaats deze ultradunne secties aan de doffe kant van een koperen rooster van 200 mazen. Begin de kleuring door het antigeen te ontmaskeren door 20 microliter etsoplossing metaperiodaat op een schone paraffinefilm te doen. Plaats het gedroogde rooster met weefselsecties op de druppel van de etsoplossing.

Laat het sectierooster gedurende 30 minuten op de oplossing op kamertemperatuur. Was de geëtste weefselsecties door ze gedurende 60 seconden op een druppel gedestilleerd water te plaatsen. Blokkeer de resterende aldehyden door het sectierooster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een druppel van 0,05 molaire glycineoplossing te plaatsen.

Dep de randen van het rooster op filterpapier om de resterende glycine-oplossing te verwijderen. Plaats het sectierooster in 10 tot 20 microliter blokoplossing gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur. Dep de rasterranden op filterpapier en plaats de rastersecties op antilichaamverdunningsmiddel voor conditionering bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Incubeer de roostersecties met primair antilichaam gedurende een uur en 30 minuten in een bevochtigde kamer. Dep het rooster droog en was de roostersecties twee keer gedurende vijf minuten met antilichaamverdunningsmiddel. Incubeer de roostersecties met gebiotinyleerd secundair antilichaam gedurende één uur in een bevochtigde kamer.

Zodra het rooster is uitgedroogd, wast u de roostersecties twee keer met antilichaamverdunningsmiddel gedurende elk vijf minuten. Incubeer de roostersecties in in de handel verkrijgbare streptavidin geconjugeerde QD gedurende één uur in een kamer bij kamertemperatuur. Voorkom blootstelling aan licht door de kamer te bedekken met aluminiumfolie.

Nadat u de rasterranden hebt gedept met filterpapier, wast u de rastersecties door ze twee minuten op waterdruppels te plaatsen en de netranden te drogen. Plaats de monsterhouder in de microscoopkolom en schakel de pompschakelaar in om de goniometer te evalueren, gevolgd door het volledig inbrengen van de monsterhouder in de microscoopkolom. Focus goed op het gewenste gebied.

Leg het beeld vast met een snelle digitale camera en sla het bestand op in tif-indeling. De mitochondriale membranen, lysosomen en het endoplasmatisch reticulum of sarcoplasmatisch reticulummembraan mitochondriale interface toonden de aanwezigheid van Sigmar1 gelabelde quantum dots. Hartsecties werden gevisualiseerd met behulp van konijnenimmunoglobuline G en quantum dots als een isotypecontrole voor anti-Sigmar1 konijn primair antilichaam.

Een belangrijk ding om te overwegen tijdens het werken aan dit protocol is het ontmaskeren van de tijd voor antigeen. Als de weefselsecties te lang worden geëtst, zal de metaperiodaetoplossing perforaties in dunne weefselsecties veroorzaken. Quantum dot-gemedieerde etikettering krijgt aandacht in tumordetectie, tumormoleculaire en immuunstatusprofilering en weefselbeeldvorming die een nieuwe weg vrijmaakt voor medische diagnostiek.

Quantum dots zijn ook nuttig bij de behandeling van tumoren via fotodynamische therapieën en oogheelkundige anomalieën door medicijnen aan de ogen toe te dienen.