Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Het algemene doel van deze procedure is om celsenescentie op een snelle en gevoelige manier te kwantificeren. Hier laten we de bruikbaarheid van deze methode zien bij het screenen van potentiële chemotherapeutische geneesmiddelen. Eerst om cellulaire senescentie te induceren.

Het chemotherapeutische geneesmiddel doxorubicine wordt toegevoegd aan kankercellen. Vervolgens wordt Bain A one toegepast om de zure pH van cellulaire lysosomen te neutraliseren. Daarna wordt cellenpermeabel bèta-galacto substraat C 12 FDG toegevoegd na cellulaire opname.

De C 12 FDG wordt gehydrolyseerd en fluoresceert. Omdat bèta GCSEs verrijkt is in lysosomen van senescente cellen, worden ze fluorescenter dan niet-senescente cellen. Om het verschil in fluorescentie te kwantificeren, worden de cellen onderworpen aan een flow cytometer-analyse van de resulterende gegevens, waardoor de hoeveelheid senescente kankercellen onder verschillende behandelingsvoorwaarden kan worden gekwantificeerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals de bèta-galactose-assay, is dat het een snelle en gevoelige kwantificering van senescente cellen mogelijk maakt. In feite hebben we het idee voor deze methoden voor het eerst toegevoegd toen we moeilijkheden ondervonden met het kwantificeren van senescente cellen met behulp van de veelgebruikte bèta-galactose-assay. Hoewel we deze techniek gebruiken om senescentie op kankercellen te detecteren, kan deze ook op normale cellen worden toegepast.

Deze methode kan helpen om snelle vragen in het kankerveld te beantwoorden, zoals of een chemotherapeutisch geneesmiddel kankercellen induceerde om senescent te worden, wat mogelijk maligniteit bevordert. Dus deze techniek zou uiteindelijk kunnen helpen bij het aankondigen van nieuwe therapeutische behandelingen voor kanker. Werkend in een chemische afzuigkap loste het C 12 FDG-poeder op in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 20 millimolair in 0,5 milliliter einor-buisjes en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.

DMSO moet worden gebruikt met passende veiligheidsvoorwaarden, ook oplossen. Los CIN A one-poeder op in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 millimolair Eloqua de oplossing in 0,5 milliliter microcentrifugebuisjes en bewaar ze bij min 20 graden Celsius.

Opmerking, de CIN moet worden gebruikt met passende veiligheidsmaatregelen. Deze procedure kan worden uitgevoerd met behulp van zowel adherente als niet-aderente cellen. Hier wordt de procedure gedemonstreerd met behulp van de menselijke myeloomcellijn RPMI 8 2 2 6.

Deze cellen groeien in suspensie, cultiveer RPMI 8 2 2 6 cellen in medium met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide 24 uur voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Zaai de cellen in zes welborden zodat ze in de log-fase van de cellulaire proliferatiecurve zullen zijn. Op het moment van het experiment om het percentage senescente cellen te bepalen, zijn drie cellenmonsters vereist. Onbehandelde en niet-ST-gekleurde cellen, onbehandelde cellen gekleurd met C 12 FDG en behandelde cellen gekleurd met C 12 FTG.

Voor elke conditie is een minimum van vijf keer 10 tot de vijfde cellen vereist voor flowcytometrie geïnduceerde senescentie van kankercellen. Door het chemotherapeutische geneesmiddel doxorubicine toe te voegen, moeten de concentratie van het geneesmiddel en de duur van de behandeling worden aangepast aan het celtype. Getest voor rpmi 8 2 2 6 cellen.

Senescentie kan worden geïnduceerd door 10 van de zes cellen per milliliter te behandelen met 15 nanomolair doxorubicine gedurende 48 uur. Vergeet niet om een onbehandeld monster op te nemen als negatieve controle, incubeer bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Behandeling met chemotherapeutische geneesmiddelen kan leiden tot celapoptose.

Daarom, controleer na twee dagen de celviabiliteit door trian blauwe exclusie met behulp van een hemo, cytometer en een microscoop. Als het percentage levensvatbaarheid minder dan 70% is, verwijder de dode cellen met behulp van een geschikt kit, zoals de dode celverwijderingskit van Milton E om ervoor te zorgen dat dode cellen de daaropvolgende analyse niet zullen beïnvloeden. Verwijder anders het kweekmedium door de cellen 300 GS gedurende vijf minuten te laten draaien.

Vervolgens verwijdert u de supernatant bij Prewarm vers kweekmedium dat 100 anom of cin, A one bevat om de zure pH van lysosomen te neutraliseren. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Los het bèta-galacto substraat C 12 FDG op in vers kweekmedium voor de incubatie met beil mycine.

Voeg C 12 FDG direct toe aan de cellen en medium tot een uiteindelijke concentratie van 33 micromolair. Incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Na de incubatie centrifugeer de cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na de centrifugatie, was de cellen twee keer met PBS, elke keer weer naar beneden spinnen zoals eerder en verwijder het supernatant na de tweede wasbeurt. Resuspendeer het cellenpellet in 500 microliter koude PBS en voer vervolgens een co-immunolabeling uit om de populatie senescente cellen verder te karakteriseren. Als u geen ervaring heeft met flowcytometrie, zal het moeilijkste aspect van deze procedure het uitvoeren van de flowcytometrie-analyse zijn.

Om succes te garanderen, zorg ervoor dat u de juiste controles opneemt en zoek assistentie van onervaren personen indien nodig. Voordat u de eerste monster laat lopen, bereidt u een twee-parametergrafiek voor met de voorwaartse verstrooiingskanaal of FSC versus zijwaartse verstrooiingskanaal SSC. Voer vervolgens het eerste monster met ongelabelde cellen uit.

Stel de fotomultiplier buizen of PMT's in en definieer een gebied van belang, met uitzondering van dode cellen en cellulaire deeltjes die tijdens de monstervoorbereidingspoort kunnen zijn verschenen. Deze regio van interesse in een eenparameterhistogram dat de fluorescentie van C 12 FDG weergeeft als FL een op de logaritmische scha