Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire senescentie op een snelle en gevoelige manier te kwantificeren. Hier demonstreren we het nut van deze methode bij het screenen van potentiële chemotherapeutische geneesmiddelen. Eerst wordt cellulaire senescentie geïnduceerd.

Het chemotherapeutische geneesmiddel doxorubicine wordt toegevoegd aan kankercellen. Vervolgens wordt Bain A one toegepast om de zure pH van cellulaire lysosomen te neutraliseren. Daarna wordt het celpermeabele bèta-galactosesubstraat C 12 FDG toegevoegd voor cellulaire opname.

De C 12 FDG wordt gehydrolyseerd en fluoresceert. Omdat bèta-GCSE's verrijkt zijn in de lysosomen van senescente cellen, worden deze meer fluorescent dan niet-senescente cellen. Om het verschil in fluorescentie te kwantificeren, worden de cellen geanalyseerd met een flowcytometer; een analyse van de resulterende gegevens maakt kwantificering mogelijk van het percentage senescente kankercellen onder verschillende behandelingscondities.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de bèta-galactosidase-test, is dat het een snelle en gevoelige kwantificering van senescente cellen mogelijk maakt. In feite ontstond het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het kwantificeren van senescente cellen met behulp van de veelgebruikte bèta-galactosidase-assay. Hoewel we deze techniek gebruiken om senescentie in kankercellen te detecteren, kan deze ook worden toegepast op normale cellen.

Deze methode kan helpen bij het snel beantwoorden van vragen binnen het kankeronderzoek, zoals de vraag of een chemotherapeutisch middel kankercellen aanzet tot sse, wat de maligniteit kan bevorderen. Deze techniek zou uiteindelijk kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen voor kanker. Los het C 12 FDG-poeder op in DMSO tot een eindconcentratie van 20 millimolar in een chemische zuurkast, verdeel dit in aliquots van 0,5 milliliter in eppendorf-buisjes en bewaar deze bij minus 80 graden Celsius.

DMSO dient onder passende veiligheidsvoorwaarden te worden gebruikt. Los tevens CIN A 1-poeder op in DMSO tot een eindconcentratie van 0,1 mM. Verdeel de oplossing over 0,5 ml microcentrifugebuisjes en bewaar deze bij -20 °C.

Let op, de CIN moet worden gebruikt met de passende veiligheidsvoorzorgsmaatregelen. Deze procedure kan worden uitgevoerd met zowel adherente als niet-adherente cellen. Hier wordt de procedure gedemonstreerd met gebruik van de humane myeloomcellijn RPMI 8 2 2 6.

Deze cellen groeien in suspensie; kweek RPMI 8 2 2 6 cellen in medium met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 °C en 5% CO2. Zaai de cellen 24 uur vóór het uitvoeren van het experiment uit in platen met zes putjes, zodat ze zich in de logfase van de cellulaire proliferatiecurve bevinden. Om het percentage senescente cellen te bepalen, zijn ten tijde van het experiment drie celmonsters nodig: onbehandelde en niet-SA-β-gal-gekleurde cellen, onbehandelde cellen gekleurd met C 12 FDG en behandelde cellen gekleurd met C 12 FTG.

Voor elke conditie zijn minimaal vijf keer 10⁵ cellen vereist voor flowcytometrie van door kankercellen geïnduceerde senescentie. Bij toevoeging van het chemotherapeutische middel doxorubicine moeten de drugconcentratie en de duur van de behandeling worden aangepast aan het celtype. Getest voor rpmi 8 2 2 6 cellen.

Senescentie kan worden geïnduceerd door cellen met een dichtheid van 6 cellen per milliliter gedurende 48 uur te behandelen met 15 nanomolar doxorubicine. Vergeet niet een onbehandeld monster als negatieve controle op te nemen; incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Behandeling met chemotherapeutische middelen kan leiden tot celapoptose.

Controleer daarom na twee dagen de celviabiliteit via trypaanblauw-exclusie met behulp van een hemocytometer en een microscoop. Indien het viabiliteitspercentage lager is dan 70%, verwijder dan de dode cellen met een geschikte kit, zoals de dead cell removal kit van Miltenyi Biotec, om te voorkomen dat dode cellen de daaropvolgende analyse beïnvloeden. Verwijder anders het kweekmedium door de cellen vijf minuten lang te centrifugeren bij 300 ×g.

Verwijder vervolgens het supernatant en voeg voorverwarmd vers cultuurmedium toe dat 100 anom or cin, A een bevat om de zure pH van lysosomen te neutraliseren; incubeer gedurende één uur bij 37 °C en 5% CO2. Los het bèta-galactoside-substraat C 12 FDG op in voorverwarmd vers cultuurmedium tot een eindconcentratie van 2 mM. Dit volgt na de incubatie met beilmycine.

Voeg C 12 FDG direct toe aan de cellen en het medium tot een eindconcentratie van 33 µM. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2. Centrifugeer na de incubatie de cellen bij 300 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.

Was na het centrifugeren de cellen twee keer met PBS, waarbij u elke keer zoals voorheen centreert en na de tweede wasbeurt het supernatant verwijdert. Resuspendeer de celpellet in 500 µL koude PBS en voer vervolgens een co-immunolabeling uit om de populatie senescente cellen verder te karakteriseren. Indien u geen ervaring heeft met flowcytometrie, zal het uitvoeren van de flowcytometrie-analyse het meest uitdagende aspect van deze procedure zijn.

Om succes te garanderen, dient u ervoor te zorgen dat de juiste controles worden meegenomen en indien nodig hulp te vragen aan een ervaren persoon. Bereid vóór het analyseren van het eerste monster een tweedimensionale grafiek voor waarin het forward scatter-kanaal (FSC) wordt uitgezet tegen het side scatter-kanaal (SSC). Analyseer vervolgens het eerste monster dat niet-gelabelde cellen bevat.

Stel de fotomultiplicatierbuizen of PMT's in en definieer een region of interest, waarbij dode cellen en cellulair debris die tijdens de monsterbereiding zijn ontstaan, worden uitgesloten via de gate. Deze region of interest bevindt zich in een histogram met één parameter waarin de fluorescentie van C 12 FDG als FL 1 op de logaritmische schaal van de x-as wordt weergegeven en het aantal events op de y-as. Het totale aantal events representeert het aantal geanalyseerde cellen.

Stel de PMT zo in dat ongelabelde cellen in het eerste decennium op de logaritmische schaal van de x-as verschijnen. Bepaal indien nodig de autofluorescentie van de cellen door de ongelabelde cellen door de flowcytometer te laten lopen. Analyseer het tweede monster met onbehandelde cellen in het histogram met één parameter dat FL1 weergeeft; plaats de cursor na de zwak gelabelde populatie.

Deze drempelwaarde maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen niet-senescente cellen, die zwak gelabeld zijn, en senescente cellen, die sterk gelabeld zijn. Analyseer het derde monster met de behandelde cellen. Sterk gelabelde senescente cellen verschijnen boven de drempelwaarde die in de vorige stap is vastgesteld.

Bereken indien nodig het percentage senescente cellen door het aantal heldere gebeurtenissen te delen door het totale aantal gebeurtenissen. De activiteit van beta-galactosidase kan ook worden geschat aan de hand van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit om de senescence te evalueren die is geïnduceerd door een chemotherapeutische procedure. De commercieel verkrijgbare multipel myeloom cellijn R RRP I 8 2 2 6 werd gedurende twee dagen behandeld met doxorubicine, een chemotherapeutisch middel, en getest op senescence zoals beschreven in deze video; deze histogrammen tonen de fluorescentie van onbehandelde cellen links en behandelde cellen rechts.

Een populatie helder gelabelde cellen die senescente cellen vertegenwoordigen, verschijnt in regio V. Parallel daaraan werd hetzelfde cellmonster gekleurd met behulp van de bèta-galactosidase-assay. In deze representatieve afbeelding worden volledig blauwe cellen en gedeeltelijk blauwe cellen getoond om de moeilijkheid te illustreren bij het onderscheiden van echt blauwe senescente cellen. Om de specificiteit van C 12 FDG bij de bepaling van het percentage senescente cellen aan te tonen, werden de cellen ook behandeld met verschillende concentraties doxorubicine.

Het percentage senescente cellen werd bepaald door het aantal heldere events te delen door het totale aantal events. De percentages senescente cellen waren 0,8%, 15,78% en 26,31% voor doses van respectievelijk 5, 25 en 50 nanomolar doxorubicine. Dit demonstreert dat C 12 FTG-labeling specifiek is voor senescente cellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe senescente cellen gekwantificeerd kunnen worden via doorstroomcytometrie, en hoe methoden zoals immunolabeling kunnen worden uitgevoerd om senescente cellen te karakteriseren. Vergeet niet dat het werken met DMSO of kankercellen extreem gevaarlijk kan zijn. Er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.