Name: Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer botulinumneurotoxine isoleren en kwantificeren uit complexe matrices zoals voedsel en farmaceutische monsters met immunoprecipitatie en fluorescentiereporter. Deze methode biedt dierproefvrije detectie met hoge gevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag H. Olivares en D. Ruge bedanken voor waardevolle discussies en adviezen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door een NSF SBIR award (IIP-1127245 om BioSentinel Inc) en het Ministerie van Defensie contract (W81XWH-07-2-0045 te BioSentinel Inc).

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin, en WC Tucker zijn medewerkers of eigenaren van BioSentinel Inc BioSentinel momenteel produceert en commercialiseert een aantal van de reagentia die in dit rapport.

Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren BoNT / A-complex, holotoxine of Clostridium kweeksupernatant in complexe matrices. Het protocol is hetzelfde, echter, bij het ​​testen van andere BoNT serotypen (bijv. BoNT / B, E en F) met hun respectievelijke Matrix assays 56,60, hoewel assaygevoeligheid zullen verschillen en serotypes en assays. Dit protocol houdt geen rekening met elk type monster mogelijk enkele wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van de specifieke vloeistofmo...

Botulinum neurotoxinen (Bonts) zijn de dodelijkste bekende stoffen, met intraveneuze menselijke dodelijke doses geschat op 1-3 ng / kg 1,2. Zeven structureel vergelijkbare serotypen van BoNT, A tot en met G, bestaan ​​elk uit een zware keten domein verantwoordelijk voor celbinding, opname en translocatie naar het cytosol en een lichte keten die een zink-endopeptidase 3-5 codeert. De exquise toxiciteit van BoNT voortvloeit uit, voor een deel, de specifieke binding en inwerking motorische neuronen in de neuromusculaire verbinding 6. Eenmaal binnen het neuron, het lichte keten endopeptidase splitst specifiek een of meer van de oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment eiwitreceptor (SNARE) proteïnen vereist voor vesikel fusie, remmende neurotransmitter en leidt tot zwakke verlamming 7-14. Algemeen bekend als de ziekte &#39;botulisme, &quot;verlamming van het diafragma en tussenribspieren door BoNT uiteindelijk totrespiratoire insufficiëntie en de dood, tenzij een vroege diagnose en behandeling zijn ontvangen. Menselijke voedselbotulisme wordt meestal geassocieerd met BoNT serotypen A, B, E en F (BoNT / A, BoNT / B, enz.) en meestal het gevolg van de inname van besmet voedsel 15,16, hoewel verscheidene gevallen wondbotulisme werden gemeld bij intraveneuze druggebruikers 17,18. In de Verenigde Staten, infantiel botulisme als gevolg van de inname van Clostridium sporen door kinderen onder de leeftijd van een is de meest voorkomende vorm van botulisme 19-21. Echter, door voedsel overgedragen BoNT uitbraken als gevolg van onjuist thuis inblikken en verwerking van levensmiddelen werden gemeld in zowel de Verenigde Staten en in het buitenland. Tussen 2000-2009 werden ten minste 338 gevallen van voedselbotulisme wereldwijd gemeld waaronder zes dodelijke slachtoffers 22. De mogelijkheid om voedselbotulisme uitbraken snel en gevoelig op te sporen is een kritische indicatie dat een vroege diagnose zou kunnen helpen 23,24. Bovendien zal detectiemethoden die kosteneffectief en routinematig testen van voedsel laten leiden tot een betere voedselzekerheid. Neuronale specificiteit en lange biologische halfwaardetijd BoNT maakt het een krachtige therapeutische ook. In de Verenigde Staten, zijn BoNT-gebaseerde geneesmiddelen goedgekeurd door de Food and Drug Administration voor de behandeling van cosmetische voorwaarden en-neuromusculaire-gerelateerde aandoeningen, waaronder glabellalijnen, cervicale dystonie, migraine, overactieve blaas, en scheelzien. Tal van &quot;off-label&quot;-toepassingen zijn gedocumenteerd, met inbegrip van hoge-dosis behandelingen voor ernstige spier-disfunctie 25-28. Nauwkeurige kwantificering toxine is essentieel voor een juiste dosering, als onderdosering kan leiden tot ineffectieve behandeling, terwijl overdosering brengt patiënten met een risico van potentieel schadelijke bijwerkingen. Helaas is er geen gestandaardiseerde potentie assayprotocol gedeeld over fabrikanten, wat resulteert in eenheid definitie ongelijkheid tussen BoNT-based drug products 29-31. De standaard test voor BoNT de muizen bioassay waarin BoNT-houdende monsters intraperitoneaal worden geïnjecteerd in muizen en het aantal sterfgevallen geconstateerd gedurende 1-7 dagen 16,32,33. De muis bioassay is zeer gevoelig met detectielimiet (LOD) van 5-10 pg BoNT / A 34, maar de ethische bezorgdheid over het gebruik van dieren, de hoge kosten van de opleiding van personeel en het onderhoud dier faciliteiten, lange assay keer, en het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen geleid tot oproepen om gestandaardiseerde, diervrije BoNT testen en kwantificeringsmethoden 35-39 ontwikkelen. Onlangs werden een aantal alternatieve BoNT kwantificeringsmethoden ontwikkeld die muis of bijna-bioassay gevoeligheid 40-49 bieden. Deze methoden vaak gebruikt fluorescentie, massa-spectrometrie, of immunologische methoden en bieden testtijden aanzienlijk korter dan de bioassay in muizen zonder dierproeven. Massaspectrometrie benaderingen gecombineerd met immunologische techniqwaarden bleken te detecteren en kwantificeren BoNT in voedsel en andere complexe monsters, maar de opleiding van personeel eisen en gespecialiseerde apparatuur limiet deze assays 50-55. De meeste andere alternatieve tests zijn niet direct van toepassing op complexe steekproeven of missen de doorvoer nodig is voor routine BoNT testen. De sterk variabele aard van voedsel monster viscositeit, pH, zoutgehalte, en matrixbestanddelen presenteert een bijzonder moeilijke uitdaging wanneer het proberen om in vitro assay methodes met gevoeligheid voor de extreme kracht van BoNT overeen te ontwikkelen. Zelfs eenvoudige en relatief goedaardige buffersystemen, zoals die welke voortvloeien uit resuspensie van BoNT gebaseerde geneesmiddelen bevatten zout, albumine, suiker en stabilisatoren (bijvoorbeeld excipiënten) die grote invloed in vitro potentie BoNT 56. Toxine zuivering vereist voor nauwkeurige activiteit testen van alle maar de eenvoudigste monsters 56-59. DeBoTest Matrix testen werden ontworpen voor een snelle, high-throughput, en consistente kwantificering van BoNT van zeer complexe monsters met behulp van apparatuur vaak gevonden in onderzoekslaboratoria 56,60. Deze testen gebruiken paramagnetische kralen covalent gebonden aan serotype-specifieke anti-BoNT antilichamen te binden en afzonderen BoNT uit een steekproef en verwijder storende matrix verbindingen door wassen. Na het wassen wordt gebonden BoNT proteolytische activiteit dan gekwantificeerd in een geoptimaliseerde reactie buffer met behulp van een verslaggever compatibel met de BoNT serotype wordt getest. Deze reporters fluorogene eiwitten bestaande uit een N-terminale cyaan fluorescerend eiwit (CFP) deel en een C-eindstandige geel fluorescerend proteïne derivaat (Venus) groep verbonden door een BoNT substraat, SNAP25 residuen 141-206 of synaptobrevin residuen 33-94 die de BoTest A / E of B / D / F / G verslaggevers, respectievelijk 45. Reporter splitsing door BoNT wordt bewaakt door middel Förster resonance energie-overdracht (FRET). Als thij verslaggever is intact, excitatie van GVB resulteert in FRET naar Venus, afschrikken GVB emissie en spannende Venus emissie. Splitsing van de reporter door BoNT FRET voorkomt, wat leidt tot een toename GVB emissie en afname Venus emissie. BoNT activiteit kan dan kwantitatief worden gemeten met behulp van de verhouding van het GVB en Venus uitstoot. LOD onder 3 pg mogelijk uit een breed scala van voedingsmiddelen met behulp van een high-throughput 96-well plaat formaat 56. Verhoogde gevoeligheid kan worden verkregen met grotere monstervolumes aangezien de test maakt concentratie van het toxine op de korrel oppervlak. De BoTest Matrix assays voor Bonts A, B, E, en F werden ontwikkeld en getest met voedings-, farmaceutische, en milieu-monsters 56,60. Hier beschrijven we de procedures voor het uitvoeren van deze tests voor de detectie van BoNT lage complexiteit (bijv. farmaceutische, BoNT in buffer) en grote complexiteit (bijvoorbeeld voeding, milieu) monsters. Specifieke verwerkingsmethodenvoor verschillende soorten monsters worden in dit protocol en soorten monsters hier niet beschreven kan meestal worden aangepast met behulp van een combinatie van de gepresenteerde methoden. Het protocol is ontwikkeld en getest met BoNT / A, maar is aan te passen aan andere BoNT serotypen middel van hun respectieve testen zoals elders 56,60 aangetoond.

<table><tbody><tr><td>BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>Detectie kits voor BoNT/B en F zijn ook beschikbaar.</td></tr><tr><td>Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>Meeste monochromator- of filter-gebaseerde units met 434 nm excitatie en 470 nm en 526 nm emissie mogelijkheid kunnen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>96-well Magnetic Bead Separation Plate</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Andere magnetische platen kunnen worden gebruikt, maar de plaat moet worden ontworpen om de kralen naar de zijkant van de put te scheiden.</td></tr><tr><td>Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>Optioneel, alleen vereist voor geautomatiseerd plaat wassen.  Andere magnetische kralen-compatibele plaatwasmachines kunnen ook worden gebruikt, maar moeten worden getest voor gebruik.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>Optioneel, alleen vereist voor monsters die centrifugatie nodig hebben.</td></tr><tr><td>MixMate plate mixer</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>Gebruikt bij kamertemperatuur of bij 25 &deg;C Als temperatuurcontrole beschikbaar is</td></tr><tr><td>EDTA-vrije Protease Inhibitor Tablets</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Alleen vereist voor voedsel- of milieutests. Protease-remmers moeten EDTA-vrij zijn.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiologics</td><td></td><td>Optioneel, alleen vereist voor standaardisatie en kwantificeringsdoeleinden</td></tr><tr><td>Zwarte, Platte bodem 96-well Platen</td><td>NUNC</td><td>237105</td><td>Platen mogen niet worden behandeld</td></tr><tr><td>96-well Plate Sealing Tape</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken botest matrix testen

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Nauwkeurige detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) in complexe matrices is vereist voor de farmaceutische-, milieu-, en voedsel steekproeven. Rapid BoNT testen van levensmiddelen is nodig tijdens uitbraak forensisch onderzoek, patiënt de diagnose en voedselveiligheid testen is nauwkeurig de werkzaamheid is vereist voor BoNT-based drug fabricage van de producten en de veiligheid van de patiënt. Het op grote schaal gebruikt bioassay in muizen voor BoNT testen is zeer gevoelig, maar mist de precisie en doorvoer nodig is voor een snelle en routinematige BoNT testen. Bovendien is de bioassay&#39;s gebruik van dieren heeft geleid tot oproepen van geneesmiddel regelgevende instanties en voorstanders van dieren-rechten in de VS en het buitenland om de muis bioassay voor BoNT testen vervangen. Verschillende in vitro vervangende tests zijn ontwikkeld die goed werken met gezuiverd BoNT in eenvoudige buffers, maar de meeste niet aangetoond voor testen in zeer complexe matrices zijn. Hier, een protocol voor de detectie vanBoNT in complexe matrices met de BoTest Matrix assays gepresenteerd. De test bestaat uit drie delen: Het eerste deel omvat de voorbereiding van de monsters voor het testen, het tweede deel is een immunoprecipitatie stap met behulp van anti-BoNT-antilichaam beklede paramagnetische kralen te zuiveren BoNT uit de matrix, en het derde deel kwantificeert de geïsoleerde Bont proteolytische activiteit met behulp van een fluorogeen reporter. Het protocol is geschreven voor high throughput testen in 96-well platen met zowel vloeibare als vaste matrices en is ongeveer 2 uur handmatig preparaat met in totaal assay tijd van 4-26 uur, afhankelijk van het type monster toxine belasting en de gewenste gevoeligheid. Gegevens zijn weergegeven voor BoNT / A test met fosfaat gebufferde zoutoplossing, een geneesmiddel, kweeksupernatant, 2% melk en verse tomaten en omvat bespreking van kritische parameters voor de test succesvol.

Een diagram waarin de stappen beschreven protocol wordt getoond in figuur 2. De test vereist tussen 4-26 uur in beslag, afhankelijk van het type monster en de gewenste assaygevoeligheid, maar slechts ~ 2 uur van hands-on tijd. De test wordt uitgevoerd in 96-well platen en afhankelijk van het soort test wordt uitgevoerd, kan triplo getest tot 20 monsters waaronder normen per plaat. Figuur 3 toont representatieve analyseresultaten met BoNT / A holotoxine spike...

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de proteolytische activiteit van botulinum neurotoxine in complexe matrices, zoals farmaceutische, milieu- en voedselmonsters. Dit wordt bereikt door eerst, indien nodig, testmonsters en monsters voor de standaardcurve te verwerken om geschikte pH- en viscositeitsomstandigheden vast te stellen. Vervolgens wordt het botulinum neurotoxine uit de monsters geïmmunoprecipiteerd met behulp van met antilichamen gecoate magnetische beads.Vervolgens worden de magnetische kralen grondig gewassen om eventuele interfererende verbindingen te verwijderen en opnieuw gesuspendeerd in een geoptimaliseerde reactiebuffer. Tot slot worden de gewassen kralen geïncubeerd met een eiwitreporter en wordt de splitsing van de reporter in de loop van de tijd spectroscopisch gemeten. Uiteindelijk wordt de vergelijking van de reporter-splitsing in de testmonsters ten opzichte van de monsters van de standaardcurve gebruikt om de activiteit van het botulinetoxine in de testmonsters te kwantificeren, met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met die van een muizen-bioassay.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zo

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a multiplex bead-based immunoassay for quantifying multiple cytokine targets in a sample. A mixture of distinct microspheres conjugated to cytokine-specific antibodies is used to bind the cytokines present in the sample. Streptavidin-tagged reporters are immobilized on the bound-cytokines using biotinylated detection antibodies. Flow cytometry identifies the bound cytokines based on the unique sizes and internal fluorescence intensities of the microspheres, while the...

A Multiplex Bead-Based Immunoassay to Quantify Multiple Cytokine Targets

De lichte keten van het botulinum-neurotoxine type A (BoNT/A LC) is een metalloprotease die motorneuronen binnendringt, zijn substraat SNAP-25 splitst en de neurotransmissie verstoort, wat resulteert in slappe verlamming. Met behulp van een op hoog-doorvoer geschikte FRET-gebaseerde test, kunnen grote bibliotheken van kleine moleculen worden getest op hun impact op de enzymatische activiteit van BoNT/A LC.

Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

Botulinum neurotoxin is een van de krachtigste toxines onder categorie-A biobedreigingen, maar er is geen therapeutisch middel beschikbaar na blootstelling. De benadering van beeldvorming met hoge inhoud is een krachtige methodologie voor het identificeren van nieuwe remmers, omdat het multiparameter screening mogelijk maakt met behulp van biologisch relevante motorneuronen, het primaire doelwit van dit toxine.

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Een aangepast protocol wordt beschreven om muis ES-cellen te differentiëren in gedefinieerde populaties van zeer zuivere neuronen die functionerende synapsen en opkomend netwerkgedrag vertonen. Elektrofysiologische analyse toont het verlies van synaptische transmissie aan na blootstelling aan botulinum neurotoxine serotypen /A-/G en tetanus neurotoxine.

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Dit protocol presenteert een gevalideerde massaspectrometriemethode voor vloeistofchromatografie-ionenmobiliteit en hoge resolutie om de aanwezigheid van moederkorenalkaloïden in voedsel te bepalen in overeenstemming met de onlangs uitgebrachte Verordening (EU) 2023/915 van de Commissie.

Detectie van gereguleerde moederkorenalkaloïden in voedselmatrices door middel van vloeistofchromatografie-ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie-time-of-flight massaspectrometrie

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Neurale circuits topografisch georganiseerd in functionele compartimenten specifieke moleculaire profielen. Hier bieden wij de praktische en technische stappen voor het openbaren van globaal brein topografie met behulp van een veelzijdige wholemount immunohistochemische kleuring aanpak. We zien het nut van de methode met behulp van de goed begrepen morfologie en de circuits van cerebellum.

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

Dit artikel beschrijft een neuronaal kweeksysteem dat kan worden gebruikt om grote hoeveelheden zuivere axonale monsters te verkrijgen voor biochemische en immunocytochemische analyses. Deze techniek zal een beter begrip mogelijk maken van normale axonale fysiologie en signaaltransductieroutes die leiden tot neurodegeneratie.

Productie en isolatie van axonen van sensorische neuronen voor Biochemische analyse met behulp van poreuze filters

Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

Leer botulinumneurotoxine isoleren en kwantificeren uit complexe matrices zoals voedsel en farmaceutische monsters met immunoprecipitatie en fluorescentiereporter. Deze methode biedt dierproefvrije detectie met hoge gevoeligheid.

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Meer video's verkennen