Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen
3 maart 2014
De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.
Het algemene doel van deze procedure is om de proteolytische activiteit van botulinum neurotoxine te kwantificeren in complexe matrices zoals farmaceutische, omgevings- en voedselmonsters. Dit wordt bereikt door eerst monsters voor testen en standaardcurve te verwerken, indien nodig, om geschikte pH- en viscositeitsomstandigheden vast te stellen. Vervolgens wordt het botulinum neurotoxine uit de monsters geïmmunoprecipiteerd met behulp van antilichaamgecoate magnetische kralen.
Daarna worden de magnetische kralen grondig gewassen om interfererende verbindingen te verwijderen en opnieuw gesuspendeerd in een geoptimaliseerde reactiebuffer. Ten slotte worden de gewassen kralen gedurende een bepaalde tijd geïncubeerd met een eiwitreporter en de splitsing van de reporter spectroscopisch gemeten. Uiteindelijk wordt vergelijking van de reportersplitsing in de te testen monsters met de standaardcurvemonsters gebruikt om de activiteit van het botulinumtoxine in de testmonsters te kwantificeren met een gevoeligheid die dicht bij die van een muis-bioassay ligt.
De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden zoals de muis-, bioassay-, immunologische en andere fluorescentiemethoden zijn dat deze assay het gebruik van dieren niet vereist en dat is aangetoond dat deze kan worden gebruikt in zeer complexe matrices die worden aangetroffen in voedsel-, omgevings- en farmaceutische monsters. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat zorgvuldige monsterverwerking en -verdunning vereist is. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Mark Dunning, een wetenschapper bij Bio Sentinel.
Bereid buffers volgens het tekstprotocol om een standaardcurve te genereren voor het kwantificeren van testmonsters, weeg 10 plus of min 0,01 gram vast voedselmonster in een 50 milliliter conische buis en bewaar dit monster, deze zal worden gebruikt als verdunningsmiddel in een tweede buis weeg twee plus of min 0,01 gram vast voedselmonster. Voeg botulinum neurotoxine of gekocht toe aan het oppervlak van het twee gram voedselmonster tot een eindconcentratie van 30.000 MLD 50 per gram voedsel. Bewaar het verdunningsmiddel en de besmette monsters bij kamertemperatuur of vier graden Celsius gedurende twee uur om de bot de tijd te geven om te interageren met de voedselmatrix.
Nabootsing van een natuurlijke besmetting, verwijs voor aanvullende monstertypen naar het tekstprotocol. Voeg vervolgens een milliliter GPB per gram voedsel toe aan de besmette en onbesmette monsters en gebruik een stamper om te homogeniseren totdat ze grondig gemengd zijn. Extrapoleer het totale volume van het twee gram bota besmette monster vanuit het geschatte totale volume van het 10 gram verdunningsmonster.
Voeg vervolgens een tiende volume van 10 x neutralisatiebuffer toe aan het 10 gram verdunningsmonster en twee gram bota besmette monster op basis van hun totale volumes. Meng monsters goed door omkeren, verduidelijk beide monsters gedeeltelijk door 10 minuten te centrifugeren bij 6.000 maal zwaartekracht en vier graden Celsius. Verwijder vervolgens onmiddellijk de supernatanten en breng over naar nieuwe buizen met behulp van het bota besmette monster als D een en het onbesmette monster als verdunning genereer de resterende standaardcurvemonsters in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.
Om vaste voedselmonsters voor te bereiden, begin door twee plus of min 0,01 gram vast onbekend monster af te wegen in een 50 milliliter conische buis. Voeg twee milliliter GPB toe en gebruik een stamper om het monster te homogeniseren. Voeg vervolgens een tiende van het volume van 10 x neutralisatiebuffer toe aan het monster en meng goed door omkeren na gedeeltelijke verduidelijking van het monster door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 6.000 maal zwaartekracht en vier graden Celsius. Breng onmiddellijk ten minste 750 microliter supernatant over naar een microcentrifugebuisje.
Dit is onbekende verdunning een. Voeg 675 microliter van het verdunningsmiddel toe aan twee buizen gelabeld als onbekende verdunning twee en drie. Het verdunningsmiddel zal hetzelfde verwerkte materiaal zijn dat wordt gebruikt voor de generatie van de standaardcurve.
Gebruik verdunning een om een seriële verdunning te maken door 75 microliter van verdunning een over te brengen naar de verdunning twee buis en te mengen. Breng vervolgens 75 microliter van verdunning twee over naar de verdunning drie buis en meng. Om de monsters te verduidelijken, centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij ten minste 14.000 maal zwaartekracht.
Verwijder onmiddellijk de supernatanten en breng over naar nieuwe buizen om een plaat voor monsters op te zetten, voeg 20 microliter van 10 x bindingsbuffer toe aan elk putje elk onbekend monster en de standaardcurvemonsters D een tot en met D acht vereisen drie putjes en monster D negen vereist zes putjes. Voeg 200 microliter van elk monster toe aan de respectieve putjes en gebruik een microplaatmixer om de plaat gedurende 10 seconden te mengen. Vortex de IPA-kralen gedurende 10 seconden op de hoogste snelheid of totdat ze volledig zijn opgeschort.
Pipet vervolgens 20 microliter van de kralen in elk monsterputje en meng de plaat gedurende 30 seconden. Incubeer de plaat gedurende twee uur in een roterende plaatincubator bij 750 RPM en 25 graden Celsius of kamertemperatuur om de plaat te wassen met behulp van een geautomatiseerde plaatwasser. Nadat het prime-programma is uitgevoerd, plaats de plaat op de 96-wel magnetische kralenscheidingsplaat op de plaatwasser.
Voer vervolgens het masterwasprogramma uit. Wanneer het programma is voltooid, verwijder de plaat uit de wasser. Voeg 50 microliter van één x reactiebuffer toe aan elk monsterputje en meng gedurende 30 seconden.
Voeg om de bot-testmatrixassay te starten 50 microliter van 0,5 micromolair AE-reporter toe aan elk monsterputje om randeffecten te voorkomen, voeg 100 microliter water toe aan elk ongebruikt putje. Gebruik plafondtape om de plaat te verzegelen, bescherm deze tegen licht en incubeer deze bij 750 RPM en 25 graden Celsius of kamertemperatuur.
Bij elke leestijd verwijdert u de plaat uit de incubator. Verwijder de plafondtape en plaats de plaat onmiddellijk op de 96-wel magnetische kralenscheidingsplaat, laat de kralen gedurende
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de detectie en kwantificering van botulinum neurotoxine (BoNT) uit verschillende monstermatrices, inclusief vaste en vloeibare monsters. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van BOTOX, tomaten en melk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Toxicologie
- Analytische Chemie
Achtergrond
- Botulinum neurotoxine is een krachtig toxine met belangrijke implicaties voor voedselveiligheid en volksgezondheid.
- Accurate detectie en kwantificering van BoNT zijn cruciaal voor het beoordelen van de aanwezigheid ervan in verschillende matrices.
- Traditionele methoden zijn mogelijk niet geschikt voor complexe monsters.
- Deze studie heeft tot doel de detectiemethoden voor BoNT in diverse omgevingen te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om de proteolytische activiteit van BoNT in complexe matrices te kwantificeren.
- Om een betrouwbare test op te zetten voor BoNT-detectie in voedsel en milieumonsters.
- Om de gevoeligheid van detectiemethoden te verbeteren tot nagenoeg muis-bioassay niveaus.
Gebruikte methoden
- Verwerking van test- en standaardcurvemonsters om pH en viscositeit te optimaliseren.
- Immunoprecipitatie van BoNT met behulp van antilichaam-gecoate magnetische kralen.
- Wassen van magnetische kralen om interfererende verbindingen te elimineren.
- Incubatie met een eiwitreporter en spectroscopisch meten van splitsing in de loop van de tijd.
Belangrijkste resultaten
- De test slaagde erin om BoNT in verschillende matrices te kwantificeren.
- Resultaten toonden hoge gevoeligheid vergelijkbaar met muis-bioassays.
- De methode toonde effectiviteit met BOTOX, tomaten en melkmonsters.
- Mogelijke toepassingen in voedselveiligheid en milieubewaking werden benadrukt.
Conclusies
- De ontwikkelde test biedt een snelle en betrouwbare methode voor BoNT-detectie.
- Het kan worden toegepast op een breed scala aan monstertypen, waardoor voedselveiligheidsmaatregelen worden verbeterd.
- Toekomstige studies kunnen de toepasbaarheid van de methode uitbreiden naar andere complexe matrices.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of botulinum neurotoxin in complex matrices is essential for pharmaceutical quality control, food safety testing, and environmental monitoring. The BoTest Matrix assay provides a high-throughput, animal-free alternative to the mouse bioassay with sensitivity approaching that of the gold standard. This enables reliable potency assessment of BoNT-based therapeutics and rapid screening of contaminated samples across diverse sample types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of botulinum neurotoxin proteolytic activity in native matrices, supporting target confirmation and mechanism of action studies.
- Operational Value: Provides quantitative readouts for toxin activity, allowing precise comparison of wild-type and engineered toxin variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response curves from immunoprecipitated toxin, enabling IC50 or EC50 determination for inhibitor screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and automated washing, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Strategic Value: Reduces reliance on animal models, aligning with 3Rs principles and regulatory expectations for alternative testing methods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures toxin recovery from food, environmental, and pharmaceutical matrices, supporting translational risk assessment.
- Operational Value: Standardized sample preparation and neutralization buffer addition improve reproducibility across variable matrices.
- Portfolio Impact: Enables lot-to-lot consistency testing of BoNT drug products, informing release criteria and stability studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative toxin activity data after initial hit identification and before IND-enabling studies.
- Discovery Biology: Confirms biological activity of purified or complex-sample-derived botulinum neurotoxin through direct measurement of proteolytic function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts suitable for hit confirmation and structure-activity relationship modeling.
- Analytics: Generates emission ratio data over time, enabling kinetic analysis and comparison to reference standards.
- Translational Research: Supports extrapolation of toxin activity from complex matrices to predict biological relevance in vivo.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple sample types (e.g., drug product, food, environmental) using standardized reagents and equipment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanism-based quantification of toxin activity, reducing ambiguity in functional assays.
- Operational Value: Eliminates animal use, increases throughput, and standardizes workflow across laboratories.
- Strategic Value: Supports regulatory compliance by offering a validated alternative to the mouse bioassay for potency testing.
- Portfolio Impact: Accelerates go/no-go decisions by delivering reliable activity data early in development.
Implementation Considerations
- Expertise in immunoprecipitation, fluorescence spectroscopy, and sample matrix optimization is required.
- Access to magnetic bead separation equipment, plate readers with dual-emission detection, and temperature-controlled incubators is necessary.
- Standardization of sample dilution, pH adjustment, and neutralization buffer use is critical for consistent recovery across matrices.
- Assay sensitivity depends on toxin load and incubation time with the reporter, requiring optimization for each sample type.
- Potential interference from endogenous proteases in complex samples necessitates controls to distinguish specific from non-specific cleavage.
