Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de proteolytische activiteit van botulinum neurotoxine in complexe matrices, zoals farmaceutische, milieu- en voedselmonsters. Dit wordt bereikt door eerst, indien nodig, testmonsters en monsters voor de standaardcurve te verwerken om geschikte pH- en viscositeitsomstandigheden vast te stellen. Vervolgens wordt het botulinum neurotoxine uit de monsters geïmmunoprecipiteerd met behulp van met antilichamen gecoate magnetische beads.

Vervolgens worden de magnetische kralen grondig gewassen om eventuele interfererende verbindingen te verwijderen en opnieuw gesuspendeerd in een geoptimaliseerde reactiebuffer. Tot slot worden de gewassen kralen geïncubeerd met een eiwitreporter en wordt de splitsing van de reporter in de loop van de tijd spectroscopisch gemeten. Uiteindelijk wordt de vergelijking van de reporter-splitsing in de testmonsters ten opzichte van de monsters van de standaardcurve gebruikt om de activiteit van het botulinetoxine in de testmonsters te kwantificeren, met een gevoeligheid die vergelijkbaar is met die van een muizen-bioassay.

De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals de muisbioassay, immunologische en andere fluorescentiemethoden, zijn dat deze assay geen gebruik van dieren vereist en is aangetoond voor gebruik in zeer complexe matrices die voorkomen in voedingsmiddelen-, milieu- en farmaceutische monsters. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat zorgvuldige monsterverwerking en verdunning vereist zijn. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Mark Dunning, een wetenschapper bij Bio Sentinel.

Bereid de buffers voor volgens het tekstprotocol om een standaardcurve te genereren voor het kwantificeren van testmonsters, weeg 10 ± 0,01 gram van het vaste voedingsmonster af in een conische buis van 50 milliliter en zet dit monster apart; dit zal worden gebruikt als verdunner. Weeg in een tweede buis twee ± 0,01 gram van het vaste voedingsmonster af. Voeg botulinum neurotoxine of BoNT toe aan het oppervlak van het monster van twee gram tot een eindconcentratie van 30.000 MLD₅₀ per gram voedsel. Incubeer de verdunner en de gespikede monsters bij kamertemperatuur of 4 °C gedurende twee uur om het toxine de tijd te geven om te interageren met de voedselmatrix.

Om een natuurlijke contaminatie na te bootsen, dient u voor aanvullende monstertypes het tekstprotocol te raadplegen. Voeg vervolgens één milliliter GPB per gram voedsel toe aan de gespike en ongespike monsters, en gebruik een stamper om te homogeniseren tot het mengsel volledig is gemengd. Extrapoleer het totale volume van het gespike monster van twee gram op basis van het benaderde totale volume van het monster met 10 gram verdunner.

Voeg vervolgens een tiende volume 10 x neutralisatiebuffer toe aan het monster van 10 gram verdunningsmiddel en aan het monster van twee gram dat met de spike was verrijkt, gebaseerd op hun totale volumes. Meng de monsters goed door inversie en clarify beide monsters gedeeltelijk door te centrifugeren gedurende 10 minuten bij 6.000 ×g en 4 °C. Verwijder vervolgens onmiddellijk de supernatanten en breng deze over naar nieuwe buisjes, waarbij het monster dat met de spike was verrijkt als D1 wordt gebruikt en het niet-verrijkte monster als verdunningsmiddel; bereid de overige monsters voor de standaardcurve in 1,5 ml microcentrifugebuisjes.

Om vaste voedselmonsters voor te bereiden, begint u met het afwegen van 2 ± 0,01 gram van een onbekend vast monster in een conische buis van 50 milliliter. Voeg 2 milliliter GPB toe en gebruik een stamper om het monster te homogeniseren. Voeg vervolgens een volume 10 x neutralisatiebuffer toe dat gelijk is aan één tiende van het volume van het monster en meng dit goed door omkeeren. Nadat het monster gedeeltelijk is geklaard door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 6.000 ×g en 4 °C, draagt u onmiddellijk ten minste 750 µL van het supernatant over naar een microcentrifugebuis.

Dit is onbekende verdunning één. Voeg 675 µL van het verdunningsmiddel toe aan twee buisjes met de labels onbekende verdunning twee en drie. Het verdunningsmiddel is hetzelfde bewerkte materiaal dat wordt gebruikt voor het genereren van de standaardcurve.

Gebruik verdunning één om een seriële verdunning te maken door 75 µL van verdunning één over te brengen naar de buis van verdunning twee en te mengen. Breng vervolgens 75 µL van verdunning twee over naar de buis van verdunning drie en meng. Om de monsters te klaren, centrifugeert u deze vijf minuten bij ten minste 14,000 ×g.

Verwijder onmiddellijk de supernatanten en breng deze over naar nieuwe buisjes om een plaat voor de monsters voor te bereiden; voeg 20 µL 10 x bindbuffer toe aan elke put. Voor elk onbekend monster en de monsters van de standaardcurve D1 tot en met D8 zijn drie putten nodig, en voor monster D9 zijn zes putten vereist. Voeg 200 µL van elk monster toe aan de respectievelijke putten en gebruik een microplaatmixer om de plaat 10 seconden te mengen. Vortex de IPA-beads 10 seconden op de hoogste snelheid of tot ze volledig zijn geresuspendeerd.

Pipetteer vervolgens 20 µL van de beads in elke monsterput en meng de plaat gedurende 30 seconden. Incubeer de plaat in een roterende plaatincubator gedurende twee uur bij 750 RPM en 25 °C of kamertemperatuur om de plaat te wassen met een automatische plaatwasser. Plaats de plaat, na het uitvoeren van het prime-programma, op de 96-puts magnetische bead-scheidingsplaat van de plaatwasser.

Voer vervolgens het master-wasprogramma uit. Wanneer het programma is voltooid, haalt u de plaat uit de washer. Voeg 50 µL 1x reactiebuffer toe aan elke monsterput en meng gedurende 30 seconden.

Om de bot test matrix assay te starten, voegt u 50 µL 0,5 µM AE-reporter toe aan elke monsterput. Om randeffecten te voorkomen, voegt u 100 µL water toe aan elke ongebruikte put. Gebruik sealing tape om de plaat af te sluiten, bescherm deze tegen licht en incubeer de plaat bij 750 RPM en 25 °C of kamertemperatuur.

Verwijder bij elk meetpunt de plaat uit de incubator. Verwijder de plaktapes van de bovenkant en plaats de plaat onmiddellijk op de 96-wells magnetische bead-separatieplaat; laat de beads twee minuten lang scheiden. Plaats de plaat in de microplaatlezer en meet de emissies bij ongeveer 470 en ongeveer 526 nanometer bij excitatie van ongeveer 434 nanometer.

Indien aanvullende meettijden gewenst zijn, dient de plaat na het resuspenderen van de beads gedurende 30 seconden op de microplaatmixer opnieuw te worden afgesloten en teruggeplaatst in de incubator. Hier worden de assayresultaten getoond waarbij bot als holo-toxine in PBS is gespikeerd en is getest na incubaties van twee, vier en 24 uur met de AE-reporter. De splitsing van de reporter door bot wordt gemeten als een afname in de emissieratio, gemeten door onze plaatlezer, van ongeveer 2,7 voor de intacte reporter naar ongeveer 0,7 voor de volledig gesplitste reporter.

Specifieke waarden zullen verschillen tussen plaatlezers, zoals blijkt uit de verschuiving van de curve naar links; een verlengde incubatietijd met de reporter resulteert in een verhoogde splitsing van de reporter. De datapunten, die in triplo zijn getest, vertonen een lage standaarddeviatie van het gemiddelde en volgen de verwachte trend van een verhoogde emissieverhouding bij een lagere toxinebelasting. Wanneer de assay deze verwachte trend niet volgt, kan dit duiden op een fout tijdens het genereren van de verdunningen of het uitzetten van de gegevens; de emissieverhoudingen van de controles zonder bot A blijven gedurende de incubatie eveneens stabiel, wat duidt op de afwezigheid van aspecifieke proteaseactiviteit.

Deze figuur demonstreert de algemene methodologie die wordt gebruikt om elke onbekende monster te detecteren of te kwantificeren aan de hand van een standaardcurve en kwantificeert farmaceutische bot a-monsters. Een standaardcurve werd gegenereerd in PBS met gezuiverd bot, een holo toin, en parallel verwerkt met verdunningen van het geneesmiddelproduct dat is verkregen uit een enkel vriesdroogflesje van 100 units Botox, gerehydrateerd in 0,9% zoutoplossing. In deze assay valt het lineaire deel van de standaardcurve tussen een emissieverhouding van 2,11 en 1,05, en wordt dit in de figuur aangegeven door het gestreepte kader. De concentraties van de drie onbekende monsters die binnen dit lineaire bereik vallen, werden vervolgens geïnterpoleerd uit de standaardcurve.

In dit experiment werden verse tomaten en 2% melk gebruikt als vaste en vloeibare voedselmatrices, welke werden gespike met bot A, een complex bestaande uit de core hollo-, toin- en neurotoxine-geassocieerde eiwitten. Deze combinatie is gekozen omdat deze lijkt op de toxine die wordt geproduceerd tijdens een natuurlijke clostridium-contaminatie, zoals hier wordt getoond. Terugwinning van bot A wordt in beide matrices waargenomen.

Bovendien verhoogt een langere incubatietijd met de reporter de gevoeligheid van de assay, maar resulteert dit niet in lagere emissieverhoudingen voor de controles zonder toxine, wat aangeeft dat de waargenomen splitsing het gevolg is van bot A en niet van niet-specifieke protease-overdracht vanuit het voedingsmiddel in de assay. De bot A-L-O-D-L-OQ en EC 50 voor beide voedingsmiddelen op elk getoond tijdstip zijn in deze tabel samengevat. De LOD en LOQ zijn respectievelijk gedefinieerd als de monsterconcentratie met de laagste waarde waarbij de emissieverhouding lager is dan drie en 10 standaarddeviaties onder de achtergrondwaarde.

Er wordt enige variabiliteit in LOD en LOQ tussen verschillende matrices verwacht, aangezien matrixeffecten de binding van de toxine aan de beads en het herstel van de beads tijdens het wassen kunnen beïnvloeden. Hoewel de gegevens suggereren dat er meer toxine werd teruggewonnen uit 2% melk dan uit tomaten, is een groot deel van dit verschil te wijten aan de extra verdunning die nodig is om tomatenmonsters in GPB te homogeniseren. Naast het feit dat tomaten een vaste voedselmatrix zijn, vormen ze een opmerkelijk monstertype waarbij de aanpassing van de pH en de ionsterkte cruciaal is voor het succes van de assay.

Deze figuur illustreert de assay-responsen bij het testen van tomaten met of zonder toevoeging van de 10 x neutralisatiebuffer. Het weglaten van de buffer resulteert in een slechte terugwinning van bot A uit monsters, wat wordt aangetoond door een constante emissieverhouding over alle geteste bot A-concentraties; de toevoeging van de 10 x neutralisatiebuffer resulteert echter in een gevoelige toxinedetectie. Aspecifieke proteasen kunnen endogeen zijn aan het voedselmonster of worden geïntroduceerd bij het gebruik van niet-gezuiverde bot-preparaten, zoals Clostridium-culturen en supernatanten, en kunnen de AE-reporter splitsen, wat leidt tot fout-positieve resultaten. Dit voorbeeld demonstreert aspecifieke protease-activiteit in Clostridium bot a-cultuursupernatanten met behulp van een gemodificeerde reporter die niet langer wordt gesplitst door bot A. De hoge niveaus van reporter-splitsing duiden op de cultuur.

Het supernatant bevat aanzienlijke protease-activiteit, die effectief wordt geneutraliseerd door de toevoeging van protease-remmers. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd binnen een totale analysetijd van vier tot 26 uur, afhankelijk van het monstertype en de toxinebelasting. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe botulinumneurotoxine uit complexe monsters kan worden geïsoleerd en gekwantificeerd met behulp van immunoprecipitatie in een fluorescentie-gebaseerd proteïnereportersysteem.

Vergeet niet dat het werken met botulinumneurotoxinen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van handschoenen, laboratoriumkleding en chemische en biologische veiligheidskasten moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.