Name: Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer array comparative genomic hybridisatie voor detectie van genomische kopijvarianten in patiëntenmonsters. Deze methode verbetert de diagnostische nauwkeurigheid voor erfelijke ziekten aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

1. Bij de etikettering Reactie <ol><li> Vóór, pre-aliquot cyanine 3 en 5 gelabeld dUTPs, ongelabelde nucleotiden en willekeurige primers gebruikt bij de concentraties producent aanbevolen in 96-well platen en bewaar bij -20 C gebruiksklaar. Voor de toepassing van dit protocol, portie 10,5 ul van de juiste gelabeld dUTP en 10,5 ul ongelabelde nucleotiden en random primers aan elk putje. </li><li> Ontdooi de kant-en-klare 96-well plaat nucleotiden en primers bij 4 ° C gedurende 1 uur, beschermd tegen licht. </li><li> Eenmaal ontdooid, evenwicht deze plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, beschermd tegen licht. </li><li> Equilibreer DNA monsters bij 60 ° C gedurende ten minste 15 min. </li><li> Met een vloeistof handlingrobot afzien nuclease-vrij water aan elk putje van een 96-wells plaat. OPMERKING: De hoeveelheid water is afhankelijk van de concentratie van elke ingang DNA monster en die volstaat om een ​​eindconcentratie van 50 ng / ul te zijn. </li><li> Met een vloeistof hanDLoad robot, pipet 1 ug DNA in een putje van de plaat met 96 putjes (zie 1.5) om het totale volume op 20 ui te brengen. OPMERKING: Kleinere hoeveelheden DNA kan worden gebruikt, hoewel de kwaliteit van de verkregen gegevens kunnen worden aangetast (edele monsters ingang DNA hoeveelheden tot 400 ng worden gebruikt). </li><li> Met een vloeistof handlingrobot, overdracht 20 ul van het evenwicht nucleotiden en primers in elk putje van de plaat verdunde DNA. </li><li> Verzegeling van de 96-well plaat met strip caps (een goede afdichting is van cruciaal belang). </li><li> Denatureren het DNA bij 99 ° C gedurende 10 min in een PCR-machine met een verwarmd deksel en koel vervolgens snel op ijs gedurende 5 minuten te hybridiseren primers. </li><li> Met behulp van een liquid handling robot, voeg 10 ul van Klenow- Exo DNA polymerase enzym om elke DNA&#39;s en pipet mix grondig. OPMERKING: Het totale volume moet 50 pi. </li><li> Sluit de plaat met 96 putjes en incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur. OPMERKING: Een kortere incubatie van 4 uur voldoende is echter een O / N incubation kan handiger. </li><li> Met een vloeistof handlingrobot, voeg 5 ul stopbuffer aan elk putje. OPMERKING: Een samenvatting van de reagentia voor etikettering reactie is weergegeven in tabel 1. </li></ol> 2. Verwijdering van opgenomen nucleotiden <ol><li> Verwijder ingebouwde nucleotiden met silicagel membraan spin kolommen en een goede spinkolom verwerking robot (de spinkolommen kan ook handmatig worden verwerkt). Volg de instructies van de fabrikant. <ol><li> De inhoud van elk putje naar een 2 ml buisje; pre-label deze met goed ID&#39;s. Opmerking: Deze stap kan handmatig of bij voorkeur uitgevoerd met een liquid handling robot. </li><li> Bij gebruik van een spin kolom verwerking robot, laad dan de robot met 2 ml buisjes, DNA-zuivering spinkolommen en bijbehorende buffers. </li><li> Voeg 250 ul hoog zoutgehalte, DNA bindende buffer (buffer PB) de etikettering reactie op het gemerkte DNA binden aan het siliciumdioxidemembraan. </li><li> Het verwijderen van verontreinigingen door het wassen van het membraan tweemaal met 500 ul wasbuffer (buffer PE). </li><li> Voeg 15 ul laag zout elutiebuffer (buffer EB) aan het membraan aan de gezuiverde, gelabelde DNA herstellen een volume van ~ 12 ul. </li></ol></li></ol> 3. Combineer Hyb Pairs <ol><li> Combineer de juiste paren van cyanine 3 en 5 gelabeld DNA, COT-1 DNA, een fabrikant geleverde blokkeren mix en een fabrikant hybridisatiebuffer met een vloeistof handlingrobot. LET OP: Deze hyb paren kunnen een monster en een referentie, of monster vs monster zijn als gedeeld CNV zijn geen probleem (bijvoorbeeld, we routinematig koppelen fenotype-mismatch monsters, zoals een renale dysplasie patiënt versus een craniosynostosis patiënt, want ze zijn erg waarschijnlijk hebben dezelfde klinisch significante CNV). Bij gebruik van een DNA, is een commerciële DNA aanvoer aanbevolen en dient naast het monster verwerkt. <ol><li> Met een vloeistofverwerking robot, voeg COT-1 DNA (3333 ng / gl), de fabrikant geleverde blokkerende mix en hybridisatie buffer aan elk putje van een plaat met 96 putjes zodat elk putje bevat 1,1 gl COT-1 DNA, 4,95 pl blokkerende mix en 24.75 gl hybridisatiebuffer. </li><li> Voeg 9.35 pl van de geschikte cyanine 3-gemerkte DNA in elk putje. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid. </li><li> Voeg 9.35 ul van de juiste cyanine 5-gemerkte DNA in elk putje. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid. </li><li> Sluit de plaat met 96 putjes en vortex gedurende 1 minuut. Spin 96-putjesplaat inhoud verzamelen op de bodem van elk putje. </li></ol></li></ol> 4. Hybridisatie <ol><li> Verwarm een ​​hybridisatie oven voor op 65oC en voorverwarmen één steun glijbaan en een hybridisatie kamer voor elke array dia. <ol><li> Denatureren het gemerkte DNA in een pre-hybridisatie incubatie alvorens aanbrengen van de arrays. Voer hybridisatie in een roterende oven gedurende 24 uur. </li><li> Incubeer de plaat met 96 putjes bij 70 ° C gedurende 30 minuten en laat bij 37 ° C gedurende ten minste 5 minuten. </li><li> Werken op een verwarmd platform bij 42 ° C, telkens wordt geladen tracks glijden in een hybridisatiekamer vóór gebruik. Zorg ervoor dat het transparante deel van de pakking dia lijn ligt met de &#39;windowed&#39; deel van de hybridisatie kamer. </li><li> Pipet 42 ul van de hybridisatiemengsel voorheen opgesteld (zie paragraaf 3) op de juiste positie op de array back-dia. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid. Pipet langzaam op het midden van elke positie, zorg ervoor dat de vloeistof niet de rubberen ring grens raken. </li><li> Zodra alle posities op de backing dia zijn gevuld, kantel de serie dia op en monteer de hybridisatie kamer. Zorg ervoor dat de zijde van de array met het schrijven op het wordt geconfronteerd met de backing glijbaan. Zorg ervoor dat u de hybridisatiekamer schroef helemaal vast. </li><li> Inspecteer de geassembleerde hybridisatie kamer. ENSure dat er geen lekkage van hybridisatie mix buiten de rubberen ring grenzen en elke luchtbel ~ 4 mm hoog bij de hybridisatie kamer wordt rustte op de verticaal. Draai de hybridisatie kamer en controleren of er geen luchtbellen die vast zitten in de positie en niet bewegen. Als er een van deze, geven de kamer een scherpe tik op de bank. Controleer of alle luchtbellen bewegen. </li><li> Plaats de hybridisatiekamer in de draaiende oven bij 65 ° C gedurende 24 uur. Zorg ervoor dat de oven rotor is evenwichtig; Gebruik andere lege kamers indien nodig. </li></ol></li></ol> 5. Wassen en scannen van dia&#39;s <ol><li> Was arrays om overtollig gelabelde DNA te verwijderen en vervolgens scannen naar fluorescentie van elke probe meten. <ol><li> Neem hybridisatie kamers uit de oven en uit elkaar te halen. De array en pakking slides zullen aan elkaar kleven; dompel deze in wasbuffer 1 en gebruik een paar plastic, platte randen tang om ze uit elkaar te wrikken. </li><li> Discard de pakking dia en plaats de reeks dia in een rek ondergedompeld in buffer 1. </li><li> Was de matrix dia ~ 700 ml verse wasbuffer 1 gedurende 5 minuten krachtig roeren (gebruik een vlo en een magnetische roerder). </li><li> Breng de reeks dia naar ~ 700 ml wasbuffer 2 en was voor 90 sec, krachtig roeren. Til de array schuift uit wasbuffer 2, moeten ze droog te voorschijn komen. </li><li> Laad de reeks dia in een dia houder van de scanner, met behulp van een dia beschermer. Laad de schuif in de array scanner en scan de instructies van de fabrikant array. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Array CGH zal niet evenwichtig herschikkingen of ploidie afwijkingen zoals triploïdie detecteren. Bovendien kunnen lage niveau mozaïek onevenwichtigheden niet worden gedetecteerd. Echter, array CGH heeft een hogere resolutie voor CNV detectie dan G-gestreepte chromosoom analyse die het heeft vervangen in veel cytogenetica laboratoria. Daarom is de huidige gouden standaard voor genoom-brede CNV detectie. Zij kan worden vervangen door next-generation sequencing technologie in de toekomst, maar op dit moment, de kosten en ...

Het is vele jaren bekend dat deleties of extra exemplaren van chromosomale segmenten veroorzaken verstandelijke beperking, dysmorfie en congentical misvormingen, en in sommige gevallen leiden tot genetische syndromen 1. Echter, de enige technologie beschikbaar tot het midden van de jaren 2000 voor het genoom-brede detectie van deze veranderingen was G-gestreepte chromosoom analyse, die een resolutie van rond 5-10Mb heeft, afhankelijk van de regio en de aard van de onbalans, en dat kan niet detecteren abnormale chromosomen waar materiaal is vervangen door een gebied van een ander chromosoom met hetzelfde bandenpatroon. Bijkomende cytogenetische technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie en multiplex ligatie-specifieke probe versterking zijn beschikbaar voor de ondervraging van specifieke loci geweest, in de gevallen van vermoedelijke specifieke syndromatische onbalans, maar het was niet tot de invoering van de array-comparatieve genomische hybridisatie (array CGH) in routine klinische diagnostische service 2-5 dat genoom-brede detectie van copy number varianten (CNV) en werd het mogelijk op een sterk verhoogde resolutie (meestal rond de 120kb). Klinische servicewerkzaamheden naast studies hebben aangetoond dat CNV sommige gebieden zijn wijdverspreid in de normale populatie 6-7, terwijl andere CNV eerder detecteerbaar zijn verbonden neurodisabilities zoals autisme en epilepsie 8-11. De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt in onze Britse National Health Service (NHS) klinisch diagnostisch laboratorium; we gebruiken roman hybridisatie strategieën, batch testen en robotica om de kosten in deze staat gefinancierde dienst te minimaliseren. Vóór het protocol hieronder dient hoogwaardige DNA worden geëxtraheerd uit het geschikte uitgangsmateriaal, gewoonlijk bloed, gekweekte cellen of weefselmonsters. Spectrofotometrie kan worden gebruikt om te worden gemeten (moet&gt; 50 ng / ul) en controleer 260: 280 absorptie verhoudingen (moeten be 1.8-2.0). Gel electroforese kan worden gebruikt om te controleren dat het DNA van hoog molecuulgewicht zonder significante afbraak. Dit protocol is ontworpen voor een hogere doorvoersnelheid laboratoria die zijn labelen 96 monsters per run met behulp van geautomatiseerde liquid handling robotica. Het kan echter worden aangepast voor lagere doorvoer labs zonder automatisering.

<table><tbody><tr><td>CGH microarray 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH wasbuffers</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH hybridisatiebuffer</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array CGH labelkit</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridisatie (array cgh) voor detectie van genomische kopij varianten

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array-CGH voor de detectie van genomische kopienummervarianten heeft de G-gebandde karyotypeanalyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een klinisch diagnostisch dienstlaboratorium. DNA geëxtraheerd uit een monster van een patiënt (bloed, speeksel of andere weefselsoorten) wordt gelabeld met een fluorochroom (ofwel cyanine 5 of cyanine 3). Een referentie-DNA-monster wordt gelabeld met het tegenovergestelde fluorochroom. Er volgt een opruimstap om niet-geïncorporeerde nucleotiden te verwijderen voordat de gelabelde DNA's worden gemengd en opnieuw gesuspendeerd in een hybridisatiebuffer en aangebracht op een array bestaande uit ongeveer 60.000 oligonucleotide-sondes van loci in het hele genoom, met een hoge sondendichtheid in klinisch belangrijke gebieden. Na hybridisatie worden de arrays gewassen, vervolgens gescand en worden de resulterende beelden geanalyseerd om de rode en groene fluorescentie voor elke sonde te meten. Software wordt gebruikt om de kwaliteit van elke sondemeting te beoordelen, de verhouding van rode tot groene fluorescentie te berekenen en potentiële kopienummervarianten te detecteren.

Elke probe op een matrix gehybridiseerd wordt gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen (zie figuur 1). De verhouding van rood naar groen fluorescent signaal voor elke probe wordt gekwantificeerd door de scanner en de bijbehorende software uitzet deze als log2 afstemmen op hun genomische positie en gebieden identificeert die buiten ingestelde grenzen. De resulterende array sporen laten interpretatie van de regio&#39;s geïdentificeerd als genomically onevenwichtig. Bijvoorbeeld, het...

Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Het algemene doel van deze procedure is om array-comparatieve genomische hybridisatie toe te passen om onevenwichtigheden in het genoom te identificeren die kunnen leiden tot een breed scala aan genetische aandoeningen. Dit wordt bereikt door eerst het DNA van de patiënt te labelen met een fluorescerende kleurstof. In de tweede stap worden het DNA van de patiënt en een anders gelabeld referentie-DNA gehybridiseerd op de array.Vervolgens wordt de array gescand om de hoeveelheid patiënt- en referentie-DNA te meten die aan elke probe is gebonden. In de laatste stap wordt het gescande beeld verwerkt om de regio's van het genoom te identificeren waar het DNA van de patiënt meer of minder materiaal bevat dan het referentie-DNA op de array. Comparatieve genomische hybridisatie wordt gebruikt om vast te stellen of de patiënt een kopienummervariant heeft die leidt tot een genetisch syndroom.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de assemblage van de array-slide moeilijk kan zijn en de hybridisatie gemakkelijk kan mislukken. Meng de vloeistof uit de kamer voordat de labelingsreactie wordt gestart. Laat de gebruiksklare 96-wellplaat met nucleotiden en primers ongeveer een uur ontdooien bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht.Zodra de plaat is ontdooid, laat u deze gedurende nog eens 30 minuten op kamertemperatuur equilibreren; laat op dit moment ook de DNA-monsters 15 minuten lang equilibreren bij 60 °C. Terwijl de monsters opwarmen, gebruikt u een vloeistofbehandelingsrobot om voldoende nucleasevrij water in elke put van een nieuwe 96-wells plaat te pipetteren. Wanneer het DNA gereed is, brengt u één µg monster per put over naar de 96-wells plaat met water.Breng nu 20 µL van de equilibrerende nucleotiden en primers over naar elk van de platen die de verdunde DNA-monsters bevatten en verzegel de plaat met stripdoppen, waarbij u erop let dat deze goed aansluiten. Denatureer vervolgens het DNA gedurende 10 minuten bij 99 °C in een PCR-apparaat met een verwarmd deksel en annealeer de primers door de plaat vijf minuten op ijs snel te koelen (snap cooling). Gebruik daarna de liquid handling robot om 10 µL clean out exo DNA-polymerase enzym aan elk monster toe te voegen.Meng de monsters met een pipet, verzegel vervolgens de plaat en incubeer deze 16 uur lang bij 37 °C. Beëindig de volgende dag de reactie met vijf µL stopbuffer per putje. Verwijder daarna de niet-ingebouwde nucleotiden. Draag de inhoud van elk putje over naar individuele, vooraf gelabelde buisjes van 2 mL.Plaats de monsters en de spinzuilen voor DNA-zuivering, evenals de bijbehorende buffers, in een robot voor de verwerking van spinzuilen. Volgens de instructies van de fabrikant zal de robot het gelabelde DNA binden aan het silicamebraan met 250 µL DNA-bindingsbuffer met hoge zoutconcentratie per buis, waarna onzuiverheden uit de membranen worden verwijderd met twee wasbeurten van telkens 500 µL wasbuffer. De robot voegt vervolgens 15 µL oplosbuffer met lage zoutconcentratie toe aan de membranen om de gezuiverde gelabelde DNA-monsters terug te winnen in volumes van ongeveer 12 µL voor hybridisatie van de monsters.Verwarm vervolgens een hybridisatieoven voor tot 65 °C en verwarm de steunplaatjes en hybridisatiekamers voor. Bereid het hybridisatiemengsel door 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL van het door de fabrikant geleverde blokkeringsmengsel en 24,75 µL hybridisatiebuffer te combineren. Gebruik de vloeistofverwerkingsrobot om dit mengsel in elke put van een nieuwe 96-wells plaat te verdelen, waarbij elke tip vooraf wordt bevochtigd om de overdrachtsnauwkeurigheid te verbeteren.Pipetteer vervolgens 9,35 µL van het passende, met drie gelabelde DNA, gevolgd door 9,35 µL van het passende, met vijf gelabelde DNA. Seal de plaat bij elke well, meng de monsters gedurende één minuut en centrifugeer de plaat kort om de inhoud onderin elke well te verzamelen. Denatureer het gelabelde DNA in een prehybridisatie-incubator.Eerst drie minuten bij 95 °C, gevolgd door 30 minuten bij 37 °C. Werk vervolgens op een verwarmd platform van 42 °C. Plaats het dekglas in de hybridisatiekamer, waarbij u erop let dat het transparante deel van de pakking is uitgelijnd met het venstergedeelte van de hybridisatiekamer. Gebruik hiervoor vooraf bevochtigde tips.Pipette nu langzaam 42 µL van het hybridisatiemengsel in het centrum van de juiste positie op het ondersteuningsglasplaatje van de array. Let er op dat de vloeistof de rand van de rubberen ring niet raakt. Zodra alle posities zijn gevuld, wordt het array-glasplaatje voorzichtig op het ondersteuningsglasplaatje geplaatst en wordt de hybridisatiekamer geassembleerd.Zorg dat de zijde van de array met het opschrift naar het dekglas is gericht, draai vervolgens de schroef van de hybridisatiekamer volledig vast en inspecteer de geassembleerde hybridisatiekamer om te bevestigen dat er geen lekkage van het hybridisatiemengsel is buiten de grenzen van de rubberen ring en dat elke luchtbel ongeveer vier millimeter hoog is. Zet de hybridisatiekamer verticaal op zijn uiteinde en roteer deze om dit te controleren.Alle luchtbellen in elke positie bewegen. Als er bellen vastzitten, tik dan stevig tegen de kamer aan op de werkbank. Plaats de hybridisatiekamers vervolgens in de roterende oven bij 65 °C gedurende 24 uur.Dompel de hybridisatiekamers de volgende dag onder in wasbuffer één en gebruik een plastic pincet met platte uiteinden om de objectglazen van elkaar te scheiden. Gooi vervolgens de pakkingglasplaatjes weg en plaats de array-glasplaatjes in een rek dat is ondergedompeld in verse buffer één. Was de array-glasplaatjes gedurende één tot vijf minuten in ongeveer 700 milliliter wasbuffer, terwijl er krachtig wordt geroerd met een vlooienblad en een magneetroerder.Breng de array-slides vervolgens over naar ongeveer 700 milliliter wasbuffer, twee keer gedurende 90 seconden, waarbij aan het einde van de tweede wasbeurt krachtiger wordt geroerd. Til de array-slides voorzichtig uit de buffer. Ze moeten droog uit de buffer komen.Plaats vervolgens de array-slides samen met de slidebeschermers in de slidehouders van de scanner en scan daarna de monsters. Volgens de instructies van de array-fabrikant wordt elke probe op een gehybridiseerde array gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen. De ratio's van het rode ten opzichte van het groene fluorescentiesignaal voor elke probe worden gekwantificeerd door de scanner, waarna de bijbehorende software deze plot als log2-ratio's op basis van hun genomische positie.De resulterende array-sporen maken interpretatie mogelijk van regio's die als genomisch ongebalanceerd zijn geïdentificeerd. Bijvoorbeeld, in dit spoor van een kind met het syndroom van Williams, een recidiverend microdeletiesyndroom veroorzaakt door low-copy repeats in de proximale regio van chromosoom zeven, werd de genomische onbalans door de software met een rode lijn geïdentificeerd. De fluorescentie-logratio moet dicht rond nul clusteren, wat duidt op een groen-roodverhouding van één op één voor normale regio's van het genoom.Verspreide array-sporen zoals waargenomen in deze scan, kunnen leiden tot onjuiste vaststelling van abnormale regio's, of tot het niet identificeren van de genomische onbalans en kunnen worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder een slechte DNA-kwaliteit, of de aanwezigheid van straling en ozongehaltes in de atmosfeer. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe patiëntenmonsters moeten worden verwerkt voor testen via aCGH en hoe er kwalitatief goede data kunnen worden gegenereerd voor downstream-analyse en detectie van kopie-aantalvariaties.

array-comparative-genomic-hybridization-array-cgh-for-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Dit manuscript beschrijft de kopie nummer variatie analyse uitgevoerd in serum of plasma DNA met behulp van real-time PCR-aanpak. Deze methode is geschikt voor de voorspelling van medicamenteuze resistentie bij castratie resistente prostaatkanker patiënten, maar het zou informatief ook voor andere ziekten.

Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Het manuscript beschrijft een chip gebaseerde digitale PCR assay om te ontdekken een zeldzame CDH1 transcript variant (CDH1a) in normale vers bevroren en tumor weefsels verkregen van patiënten met maagkanker.

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

Hierin beschrijven we een procedure voor genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag-darmkanker. De procedure is van belang voor studies die onderzoeken relaties tussen methylatiepatronen van genen en factoren die bijdragen aan carcinogenese bij maag-darmkanker.

Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, door de ISO15189 geaccrediteerde sequencing-workflow van de volgende generatie voor het detecteren van doelgerichte genomische veranderingen in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels.

Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie

Leer array comparative genomic hybridisatie voor detectie van genomische kopijvarianten in patiëntenmonsters. Deze methode verbetert de diagnostische nauwkeurigheid voor erfelijke ziekten aanzienlijk.

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Meer video's verkennen