Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten
February 21st, 2015
Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.
Het algemene doel van deze procedure is om array-vergelijkende genomische hybridisatie te gebruiken om onevenwichtigheden in het genoom te identificeren die kunnen leiden tot een breed scala aan genetische ziekten. Dit wordt bereikt door eerst het DNA van de patiënt te labelen met een fluorescerende kleurstof. In de tweede stap worden het DNA van de patiënt en een anders gelabelde referentie-DNA gehybridiseerd naar de array.
Vervolgens wordt de array gescand om de hoeveelheid patiënt- en referentie-DNA te meten die aan elke probe vastzit. In de laatste stap wordt het gescande beeld verwerkt om de delen van het genoom te identificeren waar het DNA van de patiënt meer of minder materiaal heeft dan het referentie-DNA uiteindelijk array. Vergelijkende genomische hybridisatie wordt gebruikt om te bepalen of de patiënt een kopienummervariant heeft die resulteert in een genetisch syndroom.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het samenstellen van de array-slide moeilijk kan zijn en het is eenvoudig voor de hybridisatie. Meng het uitgespuwde materiaal uit de kamer voordat u begint met de labelreactie. Ontdooi de kant-en-klare 96-well plaat met nucleotiden en primers bij vier graden Celsius en beschermd tegen licht gedurende ongeveer een uur.
Nadat het is ontdooid, brengt u de afgedekte plaat nog 30 minuten in evenwicht bij kamertemperatuur, brengt u de DNA-monsters ook gedurende 15 minuten in evenwicht bij 60 graden Celsius. Terwijl de monsters opwarmen, gebruikt u een robot voor vloeistofverrering om voldoende nuclease-vrij water in elk putje van een nieuwe 96-well plaat te doseren. Breng vervolgens, wanneer het DNA klaar is, één microgram van elk monster over naar het 96-well plaat met water.
Breng nu 20 microliters van de equilibrerende nucleotiden en primers over naar elk van de platen met de verdunde DNA-monsters en sluit de plaat af met stripdoppen en zorg ervoor dat u een goede afdichting maakt. Denatureer vervolgens het DNA bij 99 graden Celsius in een PCR-machine met een verwarmd deksel gedurende 10 minuten en kneed de primers door de plaat gedurende vijf minuten snel af te koelen op ijs. Gebruik vervolgens de robot voor vloeistofverrering om 10 microliters van een schoonmaak-exo DNA polymerase enzym aan elk monster toe te voegen.
Meng de monsters door pipettering en sluit en incubeer de plaat vervolgens 16 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag beëindigt u de reactie met vijf microliters stopbuffer per putje. Verwijder vervolgens de niet-incorporeerden nucleotiden. Breng de inhoud van elk putje over naar individuele vooraf gelabelde twee milliliter buisjes.
Laad de monsters en DNA-zuiveringsspinkolommen in een spinkolomverwerkingsrobot, evenals de bijbehorende buffer. Volgens de instructies van de fabrikant zal de spinkolomverwerkingsrobot het gelabelde DNA binden aan de silicamembraan met 250 microliters DNA-bindingsbuffer met hoge zoutconcentratie per buisje, waarna de onzuiverheden uit de membranen worden verwijderd met twee wasbeurten van 500 microliters wasbuffer per keer. De robot zal vervolgens 15 microliters laag zout oplossingsbuffer toevoegen aan de membranen om de gezuiverde gelabelde DNA-monsters in een geschatte hoeveelheid van 12 microliters te herstellen om de monsters te hybridiseren.
Verwarm vervolgens een hybridisatieoven voor op 65 graden Celsius en verwarm de ondersteuningsslides en hybridisatiekamers voor. Om het hybridisatiemengsel voor te bereiden, combineer 1,1 microliters van cot 1D NA 4,95 microliters van de door de fabrikant geleverde blokkeermix en 24,75 microliters van hybridisatiebuffer. Gebruik de robot voor vloeistofverrering om dit mengsel in elk putje van een nieuwe 96-well plaat toe te voegen en zorg ervoor dat elke tip vooraf is bevochtigd om de overdrachtsnauwkeurigheid te verbeteren.
Pipetteer vervolgens 9,35 microliters van het juiste signaal, drie gelabelde DNA, gevolgd door 9,35 microliters van het juiste signaal, vijf gelabelde DNA. Sluit elke putje af, draai de monsters gedurende één minuut en draai de plaat snel om de inhoud aan de onderkant van elke putje te verzamelen. Denatureer het gelabelde DNA in een pre-hybridisatie-incubator.
Eerst drie minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door 30 minuten bij 37 graden Celsius. Werk vervolgens op een verwarmd platform van 42 graden Celsius. Plaats de ondersteuningsslide in de hybridisatiekamer en zorg ervoor dat het transparante deel van de afdichting overeenkomt met het venstergedeelte van de hybridisatiekamer Gebruik vooraf bevochtigde tips.
Pipetteer nu langzaam 42 microliters van het hybridisatiemengsel in het midden van de juiste positie van de array-ondersteuningsslide. Zorg ervoor dat de vloeistof de rubberen ringgrens niet raakt. Zodra alle posities zijn gevuld, laat u de array-slide voorzichtig op de ondersteuningsslide zakken en monteert u de hybridisatiekamer.
Zorg ervoor dat de kant van de array met schrift op de ondersteuningsslide is gericht en draai vervolgens de schroef van de hybridisatiekamer volledig vast en inspecteer de gemonteerde hybridisatiekamer om te controleren of er geen lekkage van hybridisatie is buiten de rubberen ringgrenzen en dat elke luchtbel ongeveer vier millimeter hoog is. Wanneer de hybridisatiekamer verticaal op zijn zijkant staat, draait u de hybridisatiekamer om dit te controleren.
Alle luchtbellen in elke positie bewegen. Als een van de belletjes vastzit, geeft u de kamer een stevige klap op de werktafel. Plaats vervolgens de hybridisatiekamers in de roterende oven bij 65 graden Celsius gedurende 24 uur.
De volgende dag dompelt u de hybridisatiekamers onder in wasbuffer één en gebruikt u een paar plastic vlakrandige pincetten om de slides uit elkaar te prikken. Gooi vervolgens de afdichtingslides weg en plaats de array-slides in een rek gedompeld in verse buffer één. Was de array-slides in ongeveer 700 milliliter wasbuffer gedurende één tot vijf minuten, krachtig roerend met een vlooien en een magnetische staaf.
Breng vervolgens de array-slides over naar ongeveer 700 milliliter wasbuffer
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt array-comparative genomische hybridisatie (aCGH) als een methode voor het detecteren van genomische kopienummervarianten, die de traditionele G-gebande karyotype-analyse grotendeels heeft vervangen. De procedure heeft tot doel genomische onevenwichtigheden te identificeren die kunnen leiden tot verschillende genetische ziekten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomiek
- Genetische diagnostiek
- Comparative genomische hybridisatie
Achtergrond
- Array CGH is een moderne techniek voor het analyseren van genomische variaties.
- Het biedt een gedetailleerdere weergave van genomische onevenwichtigheden in vergelijking met traditionele methoden.
- De technologie is cruciaal voor het diagnosticeren van genetische syndromen.
- Fluorescente labeling van DNA is een sleutelstap in het proces.
Doel van het onderzoek
- Om kopienummervarianten in de genomen van patiënten te identificeren.
- Om de diagnostische nauwkeurigheid voor genetische ziekten te verbeteren.
- Om de toepassing van aCGH in een klinisch laboratorium te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Labeling van patiënt-DNA met fluorescente kleurstoffen.
- Hybridisatie van patiënt- en referentie-DNA naar een array.
- Scannen van de array om DNA-binding aan probes te meten.
- Verwerken van gescande beelden om genomische regio's met onevenwichtigheden te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van genomische regio's met kopienummervariaties.
- Demonstratie van de effectiviteit van aCGH bij het diagnosticeren van genetische syndromen.
- Vergelijking van patiënt-DNA met een referentie om onevenwichtigheden te detecteren.
- Validatie van de betrouwbaarheid van de methode in een diagnostisch context.
Conclusies
- Array CGH is een krachtig hulpmiddel voor genetische diagnostiek.
- De techniek verbetert het begrip van genetische ziekten.
- Het vertegenwoordigt een significante vooruitgang ten opzichte van traditionele karyotyperingmethoden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Array CGH enables high-resolution detection of genomic copy number variants, supporting target validation in genetic disease research by providing quantitative, genome-wide imbalance data. This method enhances predictive confidence in preclinical models by identifying pathogenic variants linked to syndromes, informing mechanistic de-risking and portfolio prioritization in early discovery. Its clinical diagnostic utility translates to biomarker-aligned assay development for rare disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting pathogenic copy number variants across the genome.
- Operational Value: Provides quantitative red-to-green fluorescence ratios for precise imbalance measurement per probe.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through high-density oligonucleotide arrays targeting clinically relevant loci.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via purified, labeled DNA hybridization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled washing, scanning, and log-two ratio analysis.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by detecting genomic imbalances that may confound phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying syndromes like Williams syndrome through recurrent microdeletion detection.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent reference DNA comparison.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating genomic stability in model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, where genomic integrity assessment informs lead identification and disease model suitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying copy number alterations in disease-associated genes.
- Screening: Describes assay readiness through hybridization buffer preparation and probe-level signal quantification.
- Analytics: Highlights log-two ratio outputs that enable comparison of patient versus reference DNA across genomic positions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating genomic backgrounds in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability for batch processing of patient or model system samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence imaging.
- Needs microarray scanner, liquid handling robot, and hybridization oven infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe selection, washing protocols, and ratio threshold setting.
- Requires adaptation considerations for varying DNA input quality and sample types (blood, saliva, tissue).
- Practical limitations include sensitivity to DNA purity, ozone levels, and bubble formation during hybridization.
