Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Het algemene doel van deze procedure is om array-comparatieve genomische hybridisatie toe te passen om onevenwichtigheden in het genoom te identificeren die kunnen leiden tot een breed scala aan genetische aandoeningen. Dit wordt bereikt door eerst het DNA van de patiënt te labelen met een fluorescerende kleurstof. In de tweede stap worden het DNA van de patiënt en een anders gelabeld referentie-DNA gehybridiseerd op de array.

Vervolgens wordt de array gescand om de hoeveelheid patiënt- en referentie-DNA te meten die aan elke probe is gebonden. In de laatste stap wordt het gescande beeld verwerkt om de regio's van het genoom te identificeren waar het DNA van de patiënt meer of minder materiaal bevat dan het referentie-DNA op de array. Comparatieve genomische hybridisatie wordt gebruikt om vast te stellen of de patiënt een kopienummervariant heeft die leidt tot een genetisch syndroom.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de assemblage van de array-slide moeilijk kan zijn en de hybridisatie gemakkelijk kan mislukken. Meng de vloeistof uit de kamer voordat de labelingsreactie wordt gestart. Laat de gebruiksklare 96-wellplaat met nucleotiden en primers ongeveer een uur ontdooien bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht.

Zodra de plaat is ontdooid, laat u deze gedurende nog eens 30 minuten op kamertemperatuur equilibreren; laat op dit moment ook de DNA-monsters 15 minuten lang equilibreren bij 60 °C. Terwijl de monsters opwarmen, gebruikt u een vloeistofbehandelingsrobot om voldoende nucleasevrij water in elke put van een nieuwe 96-wells plaat te pipetteren. Wanneer het DNA gereed is, brengt u één µg monster per put over naar de 96-wells plaat met water.

Breng nu 20 µL van de equilibrerende nucleotiden en primers over naar elk van de platen die de verdunde DNA-monsters bevatten en verzegel de plaat met stripdoppen, waarbij u erop let dat deze goed aansluiten. Denatureer vervolgens het DNA gedurende 10 minuten bij 99 °C in een PCR-apparaat met een verwarmd deksel en annealeer de primers door de plaat vijf minuten op ijs snel te koelen (snap cooling). Gebruik daarna de liquid handling robot om 10 µL clean out exo DNA-polymerase enzym aan elk monster toe te voegen.

Meng de monsters met een pipet, verzegel vervolgens de plaat en incubeer deze 16 uur lang bij 37 °C. Beëindig de volgende dag de reactie met vijf µL stopbuffer per putje. Verwijder daarna de niet-ingebouwde nucleotiden. Draag de inhoud van elk putje over naar individuele, vooraf gelabelde buisjes van 2 mL.

Plaats de monsters en de spinzuilen voor DNA-zuivering, evenals de bijbehorende buffers, in een robot voor de verwerking van spinzuilen. Volgens de instructies van de fabrikant zal de robot het gelabelde DNA binden aan het silicamebraan met 250 µL DNA-bindingsbuffer met hoge zoutconcentratie per buis, waarna onzuiverheden uit de membranen worden verwijderd met twee wasbeurten van telkens 500 µL wasbuffer. De robot voegt vervolgens 15 µL oplosbuffer met lage zoutconcentratie toe aan de membranen om de gezuiverde gelabelde DNA-monsters terug te winnen in volumes van ongeveer 12 µL voor hybridisatie van de monsters.

Verwarm vervolgens een hybridisatieoven voor tot 65 °C en verwarm de steunplaatjes en hybridisatiekamers voor. Bereid het hybridisatiemengsel door 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL van het door de fabrikant geleverde blokkeringsmengsel en 24,75 µL hybridisatiebuffer te combineren. Gebruik de vloeistofverwerkingsrobot om dit mengsel in elke put van een nieuwe 96-wells plaat te verdelen, waarbij elke tip vooraf wordt bevochtigd om de overdrachtsnauwkeurigheid te verbeteren.

Pipetteer vervolgens 9,35 µL van het passende, met drie gelabelde DNA, gevolgd door 9,35 µL van het passende, met vijf gelabelde DNA. Seal de plaat bij elke well, meng de monsters gedurende één minuut en centrifugeer de plaat kort om de inhoud onderin elke well te verzamelen. Denatureer het gelabelde DNA in een prehybridisatie-incubator.

Eerst drie minuten bij 95 °C, gevolgd door 30 minuten bij 37 °C. Werk vervolgens op een verwarmd platform van 42 °C. Plaats het dekglas in de hybridisatiekamer, waarbij u erop let dat het transparante deel van de pakking is uitgelijnd met het venstergedeelte van de hybridisatiekamer. Gebruik hiervoor vooraf bevochtigde tips.

Pipette nu langzaam 42 µL van het hybridisatiemengsel in het centrum van de juiste positie op het ondersteuningsglasplaatje van de array. Let er op dat de vloeistof de rand van de rubberen ring niet raakt. Zodra alle posities zijn gevuld, wordt het array-glasplaatje voorzichtig op het ondersteuningsglasplaatje geplaatst en wordt de hybridisatiekamer geassembleerd.

Zorg dat de zijde van de array met het opschrift naar het dekglas is gericht, draai vervolgens de schroef van de hybridisatiekamer volledig vast en inspecteer de geassembleerde hybridisatiekamer om te bevestigen dat er geen lekkage van het hybridisatiemengsel is buiten de grenzen van de rubberen ring en dat elke luchtbel ongeveer vier millimeter hoog is. Zet de hybridisatiekamer verticaal op zijn uiteinde en roteer deze om dit te controleren.

Alle luchtbellen in elke positie bewegen. Als er bellen vastzitten, tik dan stevig tegen de kamer aan op de werkbank. Plaats de hybridisatiekamers vervolgens in de roterende oven bij 65 °C gedurende 24 uur.

Dompel de hybridisatiekamers de volgende dag onder in wasbuffer één en gebruik een plastic pincet met platte uiteinden om de objectglazen van elkaar te scheiden. Gooi vervolgens de pakkingglasplaatjes weg en plaats de array-glasplaatjes in een rek dat is ondergedompeld in verse buffer één. Was de array-glasplaatjes gedurende één tot vijf minuten in ongeveer 700 milliliter wasbuffer, terwijl er krachtig wordt geroerd met een vlooienblad en een magneetroerder.

Breng de array-slides vervolgens over naar ongeveer 700 milliliter wasbuffer, twee keer gedurende 90 seconden, waarbij aan het einde van de tweede wasbeurt krachtiger wordt geroerd. Til de array-slides voorzichtig uit de buffer. Ze moeten droog uit de buffer komen.

Plaats vervolgens de array-slides samen met de slidebeschermers in de slidehouders van de scanner en scan daarna de monsters. Volgens de instructies van de array-fabrikant wordt elke probe op een gehybridiseerde array gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen. De ratio's van het rode ten opzichte van het groene fluorescentiesignaal voor elke probe worden gekwantificeerd door de scanner, waarna de bijbehorende software deze plot als log2-ratio's op basis van hun genomische positie.

De resulterende array-sporen maken interpretatie mogelijk van regio's die als genomisch ongebalanceerd zijn geïdentificeerd. Bijvoorbeeld, in dit spoor van een kind met het syndroom van Williams, een recidiverend microdeletiesyndroom veroorzaakt door low-copy repeats in de proximale regio van chromosoom zeven, werd de genomische onbalans door de software met een rode lijn geïdentificeerd. De fluorescentie-logratio moet dicht rond nul clusteren, wat duidt op een groen-roodverhouding van één op één voor normale regio's van het genoom.

Verspreide array-sporen zoals waargenomen in deze scan, kunnen leiden tot onjuiste vaststelling van abnormale regio's, of tot het niet identificeren van de genomische onbalans en kunnen worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder een slechte DNA-kwaliteit, of de aanwezigheid van straling en ozongehaltes in de atmosfeer. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe patiëntenmonsters moeten worden verwerkt voor testen via aCGH en hoe er kwalitatief goede data kunnen worden gegenereerd voor downstream-analyse en detectie van kopie-aantalvariaties.