Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie
August 5th, 2008
Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.
De volgende korte presentatie is een video die het hybridisatieprotocol voor de 27 K sub megabase ting array laat zien. Deze array of smart array bestaat uit 26.946 individueel gesequencede back clones die op een enkele slide zijn gedrukt. Ze worden gespot in duplicaat voor een totaal van 54.000 elementen per slide gedrukt in een oppervlakte van 18 bij 54 millimeter.
De resulterende gegevens zijn vergelijkbaar met high density oligo arrays zonder dat er gegevensinterpretatie door bioinformatica nodig is. Een groot voordeel van het gebruik van een array met grote inserts zoals back clones is dat het de gebruik van slechts 100 nanogram monster DNA toelaat zonder amplificatie. Dit maakt de analyse van een verscheidenheid aan monsters mogelijk zoals DNA van bloed, ingevroren weefsel, gesorteerd cellen en FFPE materiaal.
De smart array is in de klinische omgeving nuttig gebleken. Bij de BC Cancer Agency kan de analyse van meerdere patiëntenmonsters gemakkelijk worden geïntegreerd in de gemiddelde werkweek. Voor cytogenetica.
De meeste stappen die worden gebruikt in array CGH zijn vergelijkbaar met conventionele CGH of vis. Hierdoor kan het protocol snel worden geïntroduceerd in gevestigde labs. De kwaliteit van DNA is de grootste invloed op de resultaten in arrays.
CGH hybridisatie, slechte kwaliteit of besmette DNA zal de incorporatie van PSI in het product nadelig beïnvloeden, wat resulteert in zwakke beelden of ruis in de gegevens. De NanoDrop spectrofotometer is een uitstekend hulpmiddel om de DNA-kwaliteit te beoordelen vóór hybridisatie. Om de DNA-set te kwantificeren, meet de NanoDrop nucleïnezuur en de modus om DNA te meten 50 blanco, de NanoDrop met 1,5 microliter van dezelfde oplossing als uw gesuspendeerd monster.
In dit geval is het water Tris. Het is aangetoond dat EDTA potentieel negatieve effecten heeft op PS D-incorporatie. Verwijder de blanco doek met een Kimdoek en voeg 1,5 microliter van uw monster toe en noteer uw monsterconcentratie.
De twee 60 over twee 80-metingen op de NanoDrop is een goede indicator van DNA-kwaliteit waarbij een ratio van 1,8 optimaal is. De dubbele ratiomethode twee 60 over twee 80 en twee 60 over twee 30 biedt een nog betere manier om de zuiverheid van uw monsters te bepalen. De NanoDrop toont een curve die de absorptie relatief aan de golflengte weergeeft.
Een vloeiende curve zonder pieken is een indicatie van goede kwaliteit DNA veeg en reinig de NanoDrop met water en een Kimdoek, of als het monster beperkt is, pipet de monster van het voetstuk af. Dit protocol is geoptimaliseerd voor tussen de 100 en 400 nanogram monster. 200 nanogram is de doelhoeveelheid voor goede kwaliteit DNA Om het monster te labelen, zijn de volgende reagentia en apparatuur vereist.
Buffer SCI drie SCI vijf willekeurige ERs 10 keer DNTP mix referentie-DNA steriele water 0,2 microliter steriele PCR buisjes ijs hitteblok op 100 graden Celsius incubator op 45 graden Celsius. Zet een reactiebuis op voor referentie-DNA en een reactiebuis. Voor monsters DNA, zullen ze worden gelabeld met sci-fi en SCI drie respectievelijk.
In een onderzoeksomgeving geven we de voorkeur aan het gebruik van CY drie voor ons monsters DNA omdat het beter bestand is tegen ozon Degradatie. Combineer uw DNA water en kanaalbuffer naar het monster en herhaal dit voor het referentie-DNA. In ons lab combineren we de 10 keer buffer met de willekeurige Optimus.
Om een vijfvoudige oplossing te maken, voeg steriele water toe tot een totaal volume van 17 microliter. Breng de buisjes over naar een hitteblok, denatureer gedurende vijf minuten bij 100 graden Celsius. Breng onmiddellijk over naar ijs.
Voeg vier microliter van 10 keer DNTP mix toe. Voeg de side eyes toe. Voeg twee microliter SCI drie gelabelde DCTP toe aan monsters DNA.
Voeg twee microliter scifi gelabelde DCTP toe aan referentie-DNA. Voeg 2,5 microliter kanaal toe en meng. De oplossing kan handmatig worden gemengd of gevortext.
Snel het oplossing naar de bodem van de buis centrifugeren met een korte puls in een tafelcentrifuge. Breng over naar een oven en incubeer gedurende 37 graden overnacht. De overnacht hybridisatietijd kan worden aangepast tussen 14 tot 24 uur zonder de labelproces nadelig te beïnvloeden.
Om een laboratoriumschema te passen met behulp van een MicroCon YM 30 kolom, voeg 100 microliter gevangen 1D NA toe aan de kolom. Wees voorzichtig om de membraan niet aan te raken met een pipettetip gevangen. DNA batch tot batch variatie is bekend om te voorkomen, zelfs wanneer gekocht bij grote distributeurs.
Het wordt aanbevolen om grote batches te kopen en te testen voor gebruik. Er zullen nu twee buisjes zijn voor elke monsterhybridisatie, een blauw gekleurd en een rood gekleurd. Combineer de buisjes voor elk monster en meng door te pipetteren.
Vervolgens brengt u de hele oplossing over naar de MicroCon membraan. Plaats de kolom in de geleverde MicroCon buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G. De MicroCon kolom is een kolom voor grootte-exclusie en zal het DNA met de geïncorporeerde side kleurstoffen vangen en de niet-geïncorporeerde kleurstoffen laten wassen door de membraan.
Om eventuele resterende niet-geïncorporeerd nucleotiden of side weg te spoelen, voegt u 200 microliter sterieel gedistilleerd water toe aan de membraan. Centrifugeer opnieuw gedurende 10 minuten bij 13.000 G. Gooi de buis weg en voeg 45 microliter van de hybridisatieoplossing toe aan de bovenkant van de MicroCon concentrator kolom.
De hybridisatieoplossing die we gebruiken is Dig Easy van Roche Scientific vijf microliter gedeeld haring sperma kan ook worden toegevoegd aan de oplossing. Traditioneel werd dit gebruikt om niet-competitieve binding aan het oppervlak van de slide te blokkeren. De komst van nieuwe bindstoffen heeft de eliminatie van deze stap mogelijk gemaakt.
Echter, het wordt soms toegevoegd om de viscositeit van de hybridisatieoplossing te verhogen. Draai de MicroCon kolom om en plaats in een nieuw gelabeld buisje. Centrifugeer het buisje gedurende drie
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video demonstreert het hybridisatieprotocol voor een whole genome tiling path array CGH, waardoor het mogelijk is om het gehele menselijk genoom te scannen met minimale DNA-input. De methode maakt de analyse van verschillende monstersoorten mogelijk, inclusief archiefmaterialen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genomics
- DNA-analyse
- Hybridisatietechnieken
Achtergrond
- De array bestaat uit 26.946 afzonderlijk gesequencede back clones.
- Elke slide bevat in totaal 54.000 elementen.
- Verkregen data is vergelijkbaar met high-density oligo arrays.
- Bioinformatica interpretatie is niet vereist voor data-analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een hybridisatieprotocol voor genoomscannen te demonstreren.
- Om minimale DNA-monsters te gebruiken voor uitgebreide genomische analyse.
- Om het gebruik van diverse monstersoorten in genomische studies te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Hybridisatieprotocol voor whole genome tiling path array CGH.
- Gebruik van 25-100 ng DNA van verschillende bronnen.
- Toepassing van back clones die in duplicaat op slides zijn gedruppeld.
- Analyse van monsters zonder amplificatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol scannen van het menselijk genoom met lage DNA-input.
- Mogelijkheid om DNA van bloed, bevroren weefsel en FFPE-materiaal te analyseren.
- Datakwaliteit vergelijkbaar met arrays met hogere dichtheid.
- Vereenvoudigde analyse zonder uitgebreide bioinformatica vereisten.
Conclusies
- Het hybridisatieprotocol is effectief voor genoom-wide analyse.
- Minimale DNA-vereisten verbreden de omvang van monstersoorten.
- Deze methode verbetert de toegankelijkheid voor genomisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
