Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues
22 november 2014
DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.
Het algemene doel van de volgende experimenten is om DNA en eiwitten specifiek te labelen met behulp van methyl transferases, die op natuurlijke wijze de geactiveerde methylgroep en de cofactor Sile l methionine genaamd aome naar D-N-A-R-N-A overbrengen. Eiwitten of kleine biomoleculen. Eenstaps labelen wordt bereikt door de natuurlijke cofactor om te vervangen door synthetische aine cofactoren die de loop van de reactie veranderen, wat leidt tot enzymatische koppeling van de gehele cofactor en dus covalent labelen van de substraatsequentie. Specifiek methyl transferase-geïnduceerd labelen van DNA wordt gedemonstreerd met de adine specifieke DNA methyl transferase, M-B-S-E-C een, die de biotinyleerde Aine cofactor zes BAZ koppelt aan de A-G-C-G-A-T herkenningssequentie, wat leidt tot sequentie, specifiek biotinyleerde, DNA methyl transferase-gestuurde overdracht van geactiveerde groepen is het gebruik van labeleiwit en wordt gedemonstreerd met MTA's set zeven negen, die een pro pargo groep overbrengt van C acht oin naar lysine vier van histone H drie.
Het gealkyleerde lysine residu wordt chemisch gelabeld door een azi-gemodificeerde Fluor met behulp van kopergekatalyseerde click-chemie, waardoor specifiek gelabeld eiwit ontstaat. Een voordeel van het gebruik van meth transferases voor labelen is dat ze het potentieel hebben om direct native substraten te targeten. Ik zal dit demonstreren door sequentiespecifiek bioTE elatie van plasmide, DNA Meth transferase, gekatalyseerde eiwijtmodificatie met de cofactor analoog zin en maakt de introductie van een grote verscheidenheid aan reportergroepen in twee stappen mogelijk.
Ik zal dit demonstreren door middel van fluorescentielabeling van het proteïne hisone H drie en het tonen van resultaten van het labelen van H drie met biotin. Bovendien kunnen dubbel geactiveerde cofactor run analogen eenvoudig worden gesynthetiseerd door S ail, el homocysteïne, het cofactorproduct na methylgroepoverdracht, te laden met verschillende geactiveerde alcoholen. De synthetische cofactor analogen worden gezuiverd door middel van reverse phase HPLC, en in sommige gevallen is het zelfs mogelijk om de epi Mars bij zwavel te scheiden.
Smiling DNA is een sequentiespecifiek methyl transferase-geïnduceerde labelen van DNA. Hier wordt het concept gedemonstreerd door het labelen van PB 3 22 plasmide DNA met zes BAZ Aine cofactor, en de adine specifieke DNA methyl transferase. M-B-S-E-C een begint met het hawen van de zes BAZ bij 20 graden Celsius.
Eenmaal gedacht, repareer het reactiemengsel op ijs. Het omvat een microgram plasmide, 60 micromolar van zes BAZ, en 10 equivalenten van M-B-S-E-C een. HER herkenningssequentie op het DNA in modificatiebuffer.
Zorg ervoor dat u de zes BAZ en M-B-S-E-C een als laatste toevoegt. Zorg ervoor dat er geen AME is gebonden aan de meth transferase die u gebruikt, omdat de natuurlijke cofactor de labelen zal blokkeren. React Voor controles.
Vervang de MTA's door water om eventuele niet-specifieke cofactor modificaties te visualiseren en voeg water toe in plaats van cofactor om te testen op natuurlijke cofactor in het enzymconcentraat. Meng nu de reacties voorzichtig met een pipet en incubeer ze gedurende een uur op 55 graden Celsius. Tegen het einde van de incubatie, repareer een endonuclease mengsel op ijs door 10 microliter van 10 x recombinante tach, een buffer toe te voegen aan 80 microliter water, en vervolgens 3,3 microliter van recombinante tak een restrictie-endonuclease toe te voegen.
Na de incubatie, draai de reacties met een snelle spin en verifieer vervolgens de DNA-modificatie voor elk. Voeg twee microliter van 10 x tak, een buffer toe, en 28 microliter van het endonuclease mengsel. Meng de reacties met voorzichtig pipetten.
Incubeer nu de reacties gedurende een half uur bij 65 graden Celsius. Wanneer de reacties voltooid zijn, draai de oplossing met een snelle spin en verzamel 25 microliter van de reacties in nieuwe buisjes. Aan deze aliquots, voeg 2,4 microliter van strep TTR toe in gebufferd bij een millimolar per monomer van strep adin.
Incubeer nu deze reactie gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, voeg vijf microliter van zes x laadbuffer toe aan de voltooide reacties en draai 10 microliter uit op een 1%agros gel bij 80 volt gedurende ongeveer een uur. Beeld vervolgens de banden mt A af, de afkorting voor methyl transferase-gestuurde overdracht van geactiveerde groepen.
In deze demonstratie worden de methyl transferase set zeven, negen en dubbel geactiveerde cofactor C acht. Oin gebruikt om lysine vier van zijn histone H drie te labelen. Na het ontdooien van de componenten op ijs, repareer 20 microliter reactiemengsels, de testoplossing bevat modificatiebuffer 10 micromolar van histone H drie en voeg als laatste 10 micromolar van methyl transferases toe plus 600 micromolar van cofactor.
Maak een enzymcontrole door deioniseringswater te vervangen voor de C acht ON. Maak ook een cofactorcontrole om niet-specifieke modificaties te visualiseren door 60 millimolars van ADO met op te nemen om te concurreren met de synthetische cofactoren. Meng nu de reacties met langzaam pipe pesting en controleer hun pH met teststrips. Dubbel geactiveerde cofactor analogen worden opgeslagen onder C-condities.
Daarom kan de pH van uw reactieoplossing veranderen door co-factor toe te voegen, indien nodig in kleine hoeveelheden van 50 millimolar natriumhydroxide om de pH aan te passen. Incubeer nu de reacties gedurende twee uur bij 37 graden Celsius tijdens de incubatie. Reparatie. Een 12%SDS polyacrylamide gel net voordat de incubatie eindigt, maak 20 microliter van vijf x click mix bevattend drie milli molar kopersulfaat, drie milli molar T-H-P-T-A ligand 250 millimolar, natrium ACO aas, en zes millimolar Tamara azide.
Aan het einde van de incubatie, voeg vijf microliter van de click mix toe aan elke reactie en meng de reacties langzaam door per petting. Bescherm de reacties tegen licht met behulp van folie en incubeer ze gedurende een uur bij 20 graden Celsius. Na een uur, verwijder het overtollige chloroform door de eiwitten te precipiteren.
Voeg 75 microliter methanol, 18,7 microliter chloroform en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de sequentiespecifieke labelering van DNA en eiwitten met behulp van methyltransferasen. Door synthetische cofactoranalogen te gebruiken, bereiken de onderzoekers een- of tweetrapslabeling van substraten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Molecuulbiologie
- Eiwitchemie
Achtergrond
- Methyltransferasen brengen natuurlijk geactiveerde methylgroepen over naar substraten.
- Synthetische cofactoranalogen kunnen de reactieroute wijzigen.
- Sequentiespecifieke labelering is cruciaal voor het bestuderen van biomoleculen.
- Labeling kan doeltreffend op inheemse substraten worden gericht.
Doel van het onderzoek
- Om het gebruik van methyltransferasen voor specifieke labelering van DNA en eiwitten te demonstreren.
- Om het potentieel van synthetische cofactoranalogen in enzymatische reacties te verkennen.
- Om een verscheidenheid aan reportergroepen te introduceren via methyltransferasekatalyse.
Gebruikte methoden
- Gebruik van aziridine en dubbelgeactiveerde cofactoranalogen voor labelering.
- Toepassing van biotinyleren cofactor voor DNA-methyltransferase.
- Kopergekatalyseerde click-chemie voor eiwitlabeling.
- Sequentiespecifieke biotinylering van plasmide DNA.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle eenstapslabeling van DNA met behulp van specifieke methyltransferasen.
- Demonstratie van eiwitlabeling via enzymatische overdracht van groepen.
- Introductie van diverse reportergroepen via tweetrapslabeling.
- Het potentieel voor het doeltreffend richten op inheemse substraten is aangetoond.
Conclusies
- Methyltransferasen zijn effectieve hulpmiddelen voor sequentiespecifieke labeling.
- Synthetische cofactoren breiden de mogelijkheden van enzymatische labeling uit.
- Deze aanpak kan de studie van biomoleculaire interacties verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Sequence-specific labeling of nucleic acids and proteins using methyltransferases and cofactor analogues enables precise, covalent modification of target biomolecules. This approach supports target validation and assay development by providing a direct readout of enzyme-substrate interactions. It enhances predictive confidence in early discovery by allowing functional interrogation of methylation-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of methyltransferase substrate specificity and pathway interrogation.
- Operational Value: Provides a direct, sequence-specific readout for validating enzyme activity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of epigenetic targets through covalent labeling of native substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, covalent labels for high-confidence detection of methyltransferase activity.
- Operational Value: Enables standardized assay formats using biotin or fluorescent reporters for downstream detection.
- Scalability: Supports multiplexing via distinct cofactor analogues and reporter groups for parallel target profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Labels native histone and DNA substrates, enabling biomarker-aligned readouts in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target activity of epigenetic modulators in preclinical models.
- Pathway Clarification: Maps methylation-dependent signaling cascades through site-specific protein and nucleic acid labeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a functional readout for methyltransferase activity, supporting lead identification and preclinical validation through direct substrate labeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling covalent labeling of known methylation sites on DNA and histone proteins.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via biotinylation or fluorescence labeling for compound effect assessment.
- Analytics: Generates detectable modifications (e.g., streptavidin shift, fluorescence) that allow comparison of enzyme activity across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by labeling native substrates in chromatin and plasmid systems relevant to epigenetic regulation.
- Enterprise Reuse: Platform technology adaptable across DNA, RNA, protein, and small molecule targets using interchangeable cofactor analogues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and covalent signal stability for longitudinal tracking.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in epigenetic drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on direct, enzyme-specific labeling evidence.
Implementation Considerations
- Expertise in enzymology, protein purification, and cofactor handling required.
- Need for temperature-controlled storage (-20°C) and ice-based handling of labile cofactor analogues.
- Requirement for detection systems such as streptavidin-based gels or fluorescence imaging.
- Adaptation considerations for different methyltransferases and substrate contexts (DNA, RNA, protein).
- pH sensitivity of reactions may require adjustment with sodium hydroxide during setup.
