Name: Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Leer kwantitatieve proteomics met reductieve dimethylering voor stabiele isotopen labeling. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve kwantificering van eiwitten in complexe monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken SP Gygi en GM Church voor hun hulp en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een CNRS chaire d'excellence aan ACT.

OPMERKING: Deze methode werd eerder beschreven 12. 1. Eiwitisolatie Bereid 1 mg cellulair eiwit door het lyseren van cellen, bij voorkeur door fysische werkwijzen zoals Franse pers, kralen slaan of sonicatie. Vermijd-lysozym-gemedieerde cellysis omdat het enzym massaspectrometrie metingen zullen beschamen. 2. TCA precipitatie van de eiwitten Voeg 1 volume trichloorazijnzuur (TCA) aan 4 delen eiwit en chill op ijs gedurende 10 minuten om eiwitten neer te slaan. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude aceton en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en keer de buis op de bank om de pellet gedurende 15 minuten drogen. WINKEL eiwit pellets bij -80 ° C. 3. Denaturatiesectie Eiwitten en verminderen zwavelbruggen Renaar ~ 2 mg / ml in 500 pl denaturatie en vermindering buffer (hetzij 4 M ureum of 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT) schorten eiwitten. Eventueel omvatten een proteaseremmer in de buffer. Incubeer eiwitten gedurende 30 min bij 56 ° C, gevolgd door 10 min bij kamertemperatuur. 4. Aklylate Gratis sulfohydrylgroepen onomkeerbaar Disrupt disulfidenbinding Vorming Bereid verse 0,3 M iodoacetamide in water. LET OP! Iodoacetamide is zeer giftig. Voeg 25 gl 0,3 M joodaceetamide (15 mM eindconcentratie) 500 pi eiwit en incubeer gedurende 20 min in het donker bij kamertemperatuur. Quench iodoacetamide door het toevoegen van 10 pi van 300 mM DTT (5 mM DTT uiteindelijke concentratie). Slaan gealkyleerde eiwitten bij -80 ° C. 5. Eiwitvertering TCA precipiteren eiwitten (zoals beschreven in stap 2) en resuspendeer in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M ureum. Bereid een voorraad oplossing van Lysyl endoproteinase (Lys-C) in water bij een concentratie van 2 ug / ul en voeg 5 ul aan de eiwitoplossing. Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Controleer de uiteindelijke Lys-C concentratie 10 ng / ul en het eiwit naar LysC verhouding (w / w) 1/50 tot 1/200. Resuspendeer 20 ug sequentie rang trypsine in 40 ui 50 mM azijnzuur, 5 pi (10 pg trypsine) de Lys-C digest, en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. Gebruik dezelfde protease concentratie en protease-to-eiwit verhouding voor Lys-C als voor trypsine. 6. Reversed-phase Peptide Extractie <ol><li> Zuur peptiden door toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot een eindconcentratie van 0,5% (pH ≈ 2). Bevestig een C18-kolom aan een extractie spruitstuk. Gebruik de hoogst mogelijke debiet voor alle stappen behalve laden en elutie van de peptiden. </li><li> Natte kolom met 6 ml acetonitril (ACN). Waskolom met 6 ml 80% ACN 0,1% TFA, vervolgens evenwicht met 6 ml 0,1% TFA. Sta niet toe dat dekolom droog komt te staan ​​tussen de stappen. </li><li> Stop vacuümdruk en 500 ug laden van peptiden op de kolom met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min. Zodra peptiden gebonden aan de kolom, herstart vacuüm en was met 6 ml 0,1% TFA, vervolgens met 3 ml citroenzuur buffer (0,09 M citroenzuur, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5). Opmerking: met peptide bedragen codeerbaar maar de C18 bindingscapaciteit moet ten minste tweemaal hoger dan de peptide hoeveelheid monster verlies te voorkomen. </li></ol> 7. On-column Peptide Labeling door Reductieve dimethylering (Redi Labeling) Voer deze stap onder een chemische kap als waterstof cyanide vrijkomt bij lage concentratie tijdens de etikettering proces. <ol><li> Bereid 12 ml van &quot;lichte&quot; en &quot;zware&quot; Redi buffers om peptide vrije amines methyleren. Licht Redi buffer bestaat uit 0.8% formaldehyde en 0,12 M natriumcyaanboorhydride dragen waterstofatomen in their natuurlijke isotopische distributies in citroenzuur buffer. Zware Redi buffer bestaat uit 0,8% gedeutereerd formaldehyde en 0,12 M gedeutereerd natriumcyaanboorhydride in citroenzuur buffer. </li><li> Kolom bevattende peptiden Incubeer door 10 ml hetzij lichte of zware Redi buffer om de peptide bevattende kolommen stroomsnelheid van 1 ml / min en herhaal volledige etikettering te waarborgen. Was de kolom met 6 ml 0,1% TFA en vervolgens met 1 ml 0,5% azijnzuur. </li><li> Stop vacuüm en elueer gemerkte peptiden eerst met 1 ml 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens met 1 ml 80% ACN, 0,5% azijnzuur met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 ml / min. Indien gewenst, het meten van de etikettering efficiëntie van individuele monsters met behulp van massaspectrometrie voor het mengen zware en lichte monsters (zie &quot;Representatieve resultaten&quot;). Meng 01:01 zwaar en licht gemerkt peptide monsters worden gekwantificeerd met behulp van massaspectrometrie. </li></ol> 8. Aparte peptidenmengsel door Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatography &lt;/ P&gt; Eenvoudig pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie om het peptidemengsel te scheiden in verschillende fracties, die onafhankelijk geanalyseerd door LC-MS/MS aan proteoom bereik vergroten. <ol><li> Het peptidemengsel te fractioneren op een kolom C18-HPLC door toepassing van een gradiënt van toenemende ACN concentratie in 10 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8). Begin met 5% (v / v) ACN gedurende 5 min, toenemen tot 35% ACN in 60 minuten en vervolgens tot 90% ACN in 1 minuut. Bewaar de 90% ACN gedurende 4 min voor het verminderen van de ACN tot 5% opnieuw equilibreren de kolom 9 minuten. Verzamel 96 fracties van gelijk volume in een 96-well plaat (A1 tot H12). Bewaken van de fractionering met behulp van een UV-detector bij 220 nm terwijl peptiden elueren uit de kolom (10-70 min voor de hier beschreven voorwaarden). </li><li> Combineer fracties uit putten A1, C1, E1 en G1 (fractie A1), uit bronnen B1, D1, F1 en H1 (fractie B1), uit bronnen A2, C2, E2, G2 (fractie A2) en derhalve voor de overige fracties. Verwijder de solvent gebruik van een vacuüm centrifuge. Resuspendeer peptiden uit fracties A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 en B12 in 130 ui 1 M urea/0.5% TFA en zuiveren met StageTips zoals beschreven in stap 9. Store fracties B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 en A12 bij -20 º C. </li></ol> 9. Zuiver Peptiden door stop en go Extraction (StageTips) Bereid C18-StageTip 7 microkolommen door de verpakking 200 ul pipet tips met twee C18 schijven met een inwendige diameter (ID) van 1,07 mm. Zet Stage Tips in Eppendorf buizen. Gebruik een microcentrifuge om tips wassen met 130 pl methanol, vervolgens 130 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Equilibreer StageTips met 130 ul 0,1% TFA. Transfer peptidemengsel te StageTips en wassen met 130 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 pi 0,5% azijnzuur. Elueer peptiden eerst met 20 ul 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens 20 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Combineer eluaten eennd droog door vacuümfiltratie. 10. Microcapillaire LC-MS/MS <ol><li> Los peptiden in 1-5 ul 5% mierenzuur, 5% ACN tot een concentratie van ongeveer 1 ug / ul. Oplossing ~ 1 ug peptiden op een 100 urn x 20 cm C18-omgekeerde fase HPLC kolom met een gradiënt van 6-22% ACN in 0,125% mierenzuur aangebracht op 75 of 100 minuten bij een stroomsnelheid van ~ 300 nl / min. </li><li> Identificeer peptiden met behulp van een LTQ Orbitrap Velos 12 of soortgelijke vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platform met een massaspectrometer leveren van hoge resolutie en hoge nauwkeurigheid massa. Bedien de massaspectrometer in data-afhankelijke modus met een volledige MS scan (resolutie van 60.000) verworven in de Orbitrap analyzer. Genereer lineaire ion trap MS / MS-spectra voor de 20 meest voorkomende ionen gedetecteerd in de volledige MS spectrum. Stel Automatic Gain Control (AGC) targets tot 1 x 10 6 voor de volledige MS en 2000 voor MS / MS. Stel een maximum ion accumulatie tijden tot 1000 msecvoor MS en 150 msec voor MS / MS. Uitsluiten gefragmenteerd peptide precursorionen van verdere selectie van MS / MS voor 20-60 sec. </li></ol> 11. MS / MS Data Acquisition Identificeer peptiden door vergelijking van MS / MS spectra RAW een theoretische database een algoritme zoals SEQUEST 8 met behulp van deze parameters (tabel 1). Tabel 1. Peptide Database Zoekparameters. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Algemene parameters </td><td> volledig tryptische digestie met maximaal 2 gemiste splitsingen </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm precursorion tolerantie </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 Da fragmention tolerantie </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Statische Wijzigingen </sTrong&gt; </td><td> 57,02146 Da op cysteïne, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> 28,03130 Da op lysine en peptide N-terminus, licht dimethylering label </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Dynamische Wijzigingen </td><td> 15,99491 Da op methionine, oxidatie </td></tr><tr height="19"><td> 6,03766 Da op lysine en peptide N-terminus, zware dimethylering label </td></tr></tbody></table><ol><li> Filter peptiden een 1% fout ontdekt waardering met een methode als het doel-decoy 9 aanpak vanuit een database van open reading frames in de huidige en omgekeerde oriëntaties. </li></ol> 12. Peptide Kwantificering Bereken het gebied van zware en lichte paren van MS1 gewonnen ion chromatogrammen (MS1 piekgebieden) en peptide signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding 10. Omvatten peptide paren alleen wanneer hun gemiddelde signaal-noise, groter dan vijf. Kwantificeer de relatieve abundantie van een peptide in de twee monsters als de verhouding tussen MS1 ​​piekoppervlakten van zware en lichte versie van hetzelfde peptide (MS1 piekoppervlakte-verhouding). Berekenen relatieve abundanties eiwit als de mediaan MS1 ​​piekoppervlak verhouding voor alle peptiden in het proteïne.

<ol><li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li>
<li>Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li>
<li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li>
<li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li>
<li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li>
<li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li>
<li>Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+N%28%CE%B1%29-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Een aantal punten maken stabiele isotoop labeling van peptiden met behulp van reductieve dimethylering (Redi etikettering) een aantrekkelijke methode voor kwantitatieve proteomics: goedkoop etikettering reagens (reagentia kost minder dan $ 1 per monster), snelle reactiesnelheid (~ 10 min), de afwezigheid van nevenproducten, hoge reproduceerbaarheid (figuren 3, 4), stabiele reactieproducten, mogelijkheid om een protease te gebruiken en hoge ionisatie-efficiëntie van gelabelde peptiden. Chemische labeling...

Het meten van de concentratie verschillen van veel eiwitten tussen complexe monsters is een centrale uitdaging in proteomics. In toenemende mate wordt dit gedaan door het merken van eiwitten in elk monster met verschillende isotopische labels combineren van de monsters en met massaspectrometrie om concentratieverschillen kwantificeren. Verschillende methoden bestaan ​​voor stabiele isotopische labeling van eiwitten en peptiden. 15 N etikettering 1 en 2 SILAC voeren isotopische labels metabolisch in vivo, terwijl iCAT 3, iTRAQ 4 en vermindering dimethylering 5 commentaar stabiele isotoop labels na eiwitextractie en vertering. Onder deze methoden, is reductieve dimethylering (Redi etikettering) aan populariteit wint als een goedkope en reproduceerbare methode om eiwitconcentratie verschillen in bijna elk type monster te kwantificeren. Redi etikettering omvat peptiden reageren met formaldehyde om een ​​Schiff base, dat vervolgens wordt gereduceerd vormendoor cyanoboorhydride. Deze reactie dimethylates vrije aminogroepen op N-uiteinden en lysinezijketens en monomethylates N-terminale prolines. De hier beschreven protocol methyleert peptiden in monster 1 met een &quot;lichte&quot; label met reagentia met waterstofatomen in hun natuurlijke isotopische distributie en monster 2 met een &quot;zware&quot; label met gedeutereerd formaldehyde en dride (figuur 1). Elke digemethyleerd aminogroep op een peptide resulteert in een massaverschil van 6,0377 Da tussen lichte en zware vormen, die wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee vormen met een massaspectrometer. In het bijzonder, zijn ten opzichte van peptide abundanties gekwantificeerd als de verhouding van MS1 ​​gewonnen ionenchromatogram gebieden (MS1 piekoppervlakte ratio) van lichte en zware uitvoering voor elk peptide ionenpaar. De relatieve abundantie van een eiwit wordt berekend als de mediaan MS1 ​​piekoppervlak verhouding tussen alle peptiden in het proteïne. In dit rapport beschrijven we een robuust protocol voor gedraging Redi markeringsexperimenten door LC-MS/MS dat omgekeerde fase peptide vaste fase extractie op-kolom Redi etikettering peptide fractionering door basische pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie en zuivering van peptide mengsels met StageTips (figuur 2) omvat . We bespreken de voordelen en beperkingen van het gebruik van Redi etikettering voor kwantitatieve proteomics.

<table><tbody><tr><td>Trichloorazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>eiwitprecipitatie</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>eiwitprecipitatie</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>denatureren, eiwit reduceren</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>denatureren, eiwit reduceren</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>denatureren, reduceren, eiwit alkyleren</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>denatureren, eiwit reduceren</td></tr><tr><td>Iodoaceetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>eiwit alkyleren</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>opnieuw suspenderen, extraheren, eiwit labelen</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>eiwit opnieuw suspenderen</td></tr><tr><td>Lysyl Endoprotease</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>eiwitopsplitsing</td></tr><tr><td>Sequencing grade trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>eiwitopsplitsing</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>eiwitopsplitsing</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Omgekeerde fase peptide extractie</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>Omgekeerde fase peptide extractie</td></tr><tr><td>Extractie manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td>Omgekeerde fase peptide extractie</td></tr><tr><td>Acetonitriel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>diversen</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>&ldquo;licht&rdquo; peptide labelen</td></tr><tr><td>Cyanoboorhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>&ldquo;licht&rdquo; peptide labelen</td></tr><tr><td>Gedeutereerd formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>&ldquo;zwaar&rdquo; peptide labelen</td></tr><tr><td>Natriumcyanoborhydride</td><td>CDN isotopes</td><td>D-1797</td><td>&ldquo;zwaar&rdquo; peptide labelen</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>peptide labelen</td></tr><tr><td>C18-HPLC kolom (4,6 x 250 mm, 5 &micro;m deeltjegrootte)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>Omgekeerde fase chromatografie bij basis pH</td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>diversen</td></tr><tr><td>C18 Empore Disks</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>STAGE tips</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE tips</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve proteomics behulp reductieve dimethylering voor stabiele isotopen labeling

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stabiele isotopen van peptiden door reductieve dimethylering (Redi labeling) is een methode om nauwkeurig kwantificeren eiwitexpressie verschillen tussen monsters met behulp van massaspectrometrie. Redi etikettering wordt uitgevoerd met behulp van gewone (licht) of gedeutereerde (zware) vormen van formaldehyde en natriumcyaanboriumhydride twee methylgroepen toevoegen aan elke vrije amine. Hier laten we zien een robuust protocol voor Redi etikettering en kwantitatieve vergelijking van complexe eiwitmengsels. Eiwitmonsters ter vergelijking worden gedigesteerd in peptiden gelabeld ofwel lichte of zware methyl markeringen, gemengd en samen geanalyseerd met LC-MS/MS dragen. Relatieve dichtheden eiwit gekwantificeerd door vergelijking van de ionenchromatogram piekoppervlakten van zware en lichte gemerkte versies van de samenstellende peptide geëxtraheerd uit de volledige MS-spectra. De hier beschreven methode is inclusief monstervoorbereiding met reversed phase vaste-fase-extractie, on-column Redi etikettering van peptiden, peptide fractionering door basische pH reversed-fase (BPRP) chromatografie, en StageTip peptide zuivering. We bespreken de voordelen en beperkingen van Redi etikettering met betrekking tot andere methoden voor een stabiele isotoop oprichting. We belichten nieuwe toepassingen met Redi labeling als een snelle, goedkope en nauwkeurige methode om eiwit abondantie vergelijken in bijna elk soort monster.

We evalueerden de nauwkeurigheid, precisie en reproduceerbaarheid van Redi labeling met Saccharomyces cerevisiae en Clostridium phytofermentans gehele cellysaten. We hebben eerst gekwantificeerd de Redi etikettering efficiëntie van een mix van C. phytofermentans eiwitlysaten uit cellulose (zware gelabeld, H) en glucose (licht label, L) culturen. Wanneer gefilterd om een ​​1% peptide valse ontdekking tarief, dit monster bevatte 11.194 unieke peptide sequenties met een 98% Redi etikettering effi...

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van vele eiwitten tussen monsters te vergelijken via massaspectrometrie met behulp van ready proteomics. Dit wordt bereikt door eerst het eiwit uit elk monster te verteren om peptidemengsels te genereren. Vervolgens worden de twee monsters gemengd, waarna de peptiden in het gemengde monster worden gefractioneerd en ontzout.Vervolgens wordt het mengsel geanalyseerd middels massaspectrometrie. Ten slotte worden de peptiden geïdentificeerd door de MS2-spectra te vergelijken met een target-decoy database van alle potentiële peptiden in de monsters, waarna de relatieve abundantie van de peptiden tussen de monsters wordt gekwantificeerd. Uiteindelijk maakt ready proteomics de kwantificering van de relatieve abundantie van talrijke eiwitten tussen complexe monsters mogelijk.De belangrijkste voordelen van reductieve demethylering ten opzichte van andere methoden voor stabiele isotopenmarkering, zoals iLite, zijn dat het een snelle, goedkope en nauwkeurige methode is die geen specifieke reagentia of een synthetisch medium vereist, wat betekent dat het op bijna elk type monster kan worden toegepast. Begin met het voorbereiden van 1

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Reactive oxygen species niveau wordt verhoogd wanneer de cellen tegenkomen stress. Hier laten we het voorbeeld van 3'-3 'diaminobenzidine vlekken en cysTMT etikettering en massaspectrometrie om de redox proteoom profileren...

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Twee methoden voor het toewijzen van de α- en ε-dimethylamine nucleaire magnetische resonantiesignalen van een reductief 13C-gemethyleerd N-terminaal lysine worden beschreven. De ene methode maakt gebruik van de pH-geïnduceerde selectiviteit van de reductieve methyleringsreactie, en de andere maakt gebruik van aminopeptidase om selectief het N-terminale lysine te verwijderen.

Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Leer kwantitatieve proteomics met reductieve dimethylering voor stabiele isotopen labeling. Deze methode maakt snelle, kosteneffectieve kwantificering van eiwitten in complexe monsters mogelijk.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Meer video's verkennen