Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van veel eiwitten tussen monsters te vergelijken door middel van massaspectrometrie met behulp van ready proteomics. Dit wordt bereikt door eerst het eiwit uit elk monster te verteren om peptidemixturen te genereren. Vervolgens worden de twee monsters gemengd en worden peptiden in het gemengde monster gefractioneerd en ontzilt.

Vervolgens wordt het gemengde monster geanalyseerd door massaspectrometrie. Ten slotte worden de peptiden geïdentificeerd door de MS twee spectra te vergelijken met een doelwitdecoy-database van alle potentiële peptiden in de monsters en wordt de relatieve abundantie van peptiden tussen de monsters gekwantificeerd. Uiteindelijk maakt ready proteomics de kwantificering van de relatieve abundantie van veel eiwitten tussen complexe monsters mogelijk.

De belangrijkste voordelen van destructieve demethylering boven andere methoden voor stabiele isotoopmarkering zoals iLite, is dat ready een snelle, goedkope en nauwkeurige methode is die geen specifiek trois of een synthetisch medium vereist, wat betekent dat het op bijna elk type monster kan worden toegepast. Om te beginnen, bereidt u een milligram cellulair eiwit en 500 microliters voor door sonicatie of een French press te gebruiken om de cellen te lyseren om de eiwitten te laten precipiteren. Voeg een volume trichlorazijnzuur toe aan vier volumes eiwit en laat 10 minuten op ijs koelen.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant. Gebruik vervolgens één milliliter ijskoud aceton om te hersuspenderen. Suspendeer de pellet voordat u voor de tweede keer spint.

Na het aspireren van de snat, droogt u de pellet in een warmteblok van 56 graden Celsius om de eiwitten te denatureren en de kleurstofsulfidebindingen te verminderen. Gebruik 500 microliters denaturerende en reductiebuffer om te hersuspenderen. Hersuspendeer de eiwitten tot ongeveer twee milligram per milliliter.

Incubeer de eiwitten gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius, gevolgd door 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 25 microliters vers bereide 0,3 molaire IDO-acetamide in water toe aan 500 microliters eiwit en incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie, dooft u de reactie door 10 microliters drie millimolar DTT toe te voegen.

Bewaar de alkyleerde eiwitten bij min 80 graden Celsius om de alkyleerde eiwitten te verteren na TCA-precipitatie. Gebruik een molaire ureum in 50 millimolar heis pH 8,2 om het eiwit te hersuspenderen. Bereid een voorraadoplossing van Lysol, endo-proteïnase of ly C in water voor met een concentratie van twee microgram per microliter en voeg het enzym toe aan het verteerde eiwit bij een eindconcentratie van 10 nanogram per microliter. De monsters worden gedurende zes uur of een nacht bij kamertemperatuur bewaard. Suspendeer 20 microgram sequencing grade trypsine in 40 microliters 50 millimolar azijnzuur en voeg vijf microliters toe aan de lyce-verteringsreactie.

Incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius voor de alkyleerde eiwitten. Voeg trifluorazijnzuur of TFA toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Bevestig een C 18-kolom aan een extractiemanifold. Gebruik vervolgens zes milliliter acetonitril of een CN om de kolom nat te maken.

Gebruik vervolgens met de hoogst mogelijke stromingssnelheid zes milliliter van 80%a CN 0,1%TFA om de kolom te wassen voordat u zes milliliter van 0,1%TFA gebruikt om de kolom te gelijkstellen, stop de vacuümdruk en laad 500 microgram peptiden op de kolom met een stromingssnelheid van ongeveer één milliliter per minuut. Zodra de peptiden aan de kolom zijn gebonden, start u de vacuüm opnieuw en gebruikt u met de hoogst mogelijke stromingssnelheid 0,1%TFA gevolgd door drie milliliter citroenzuurbuffer om de kolom te wassen om onco, reductieve, dim-methylering of ready-labeling uit te voeren. Bereid onder een chemische kap 12 milliliter van zowel lichte als zware ready-buffers voor om peptide vrij te methyleren.

Voeg vervolgens 10 milliliter van de lichte of zware ready-buffer toe aan de kolom met een stromingssnelheid van één milliliter per minuut. Na het aanbrengen van een tweede 10 milliliter aliquoot. Om het labelen te garanderen, gebruik zes milliliter 0,1%TFA, gevolgd door één milliliter 0,5%azijnzuur.

Om de kolom te wassen om de eiwitten te elueren, stopt u de vacuüm en brengt u één milliliter van 40%a CN 0,5%azijnzuur aan met een stromingssnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Voeg vervolgens één milliliter 80%a CN 0,5%azijnzuur toe en elueer met een vijf milliliter spuit als gewenst. Meng een een-op-eenverhouding van zware en lichte gelabelde peptidemonsters en kwantificeer door massaspectrometrie om er zeker van te zijn dat zowel de als het lichte labelen effectief was. Fractioneer het peptidemengsel door het eerst aan te brengen op een C 18 HPLC-kolom.

Gebruik vervolgens 5%a CN om de kolom vijf minuten te wassen, gebruik vervolgens een gradiënt van vijf tot 35%a CN gedurende 60 minuten om de peptiden in gelijke fracties te elueren. In een 96-wellplaat, gevolgd door 90%A CN gedurende één minuut. Na een extra vier minuten van 90%A CN, gebruik 5%a CN om de kolom opnieuw te gelijkstellen.

Combineer vervolgens fracties op de volgende manier met de vacuümcentrifuge. Verwijder het oplosmiddel van de gecombineerde fracties. Gebruik vervolgens 130 microliters van één molaire ureum 0,5%TFA om te hersuspenderen.

Suspendeer de peptiden uit de volgende fracties en bewaar de set fracties bij min 20 graden Celsius om een stop-and-go extractie uit te voeren op de hersuspendeerde fracties. Bereid C 18-stagetip-microkolommen voor uit 200 microliter pipettenpunten door twee C 18-schijven met een binnendiameter van 1,07 millimeter te gebruiken om ze te verpakken. Plaats de stagetips in microcentrifugebuizen en voeg 130 microliters methanol toe en draai rond.</