Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van vele eiwitten tussen monsters te vergelijken via massaspectrometrie met behulp van ready proteomics. Dit wordt bereikt door eerst het eiwit uit elk monster te verteren om peptidemengsels te genereren. Vervolgens worden de twee monsters gemengd, waarna de peptiden in het gemengde monster worden gefractioneerd en ontzout.

Vervolgens wordt het mengsel geanalyseerd middels massaspectrometrie. Ten slotte worden de peptiden geïdentificeerd door de MS2-spectra te vergelijken met een target-decoy database van alle potentiële peptiden in de monsters, waarna de relatieve abundantie van de peptiden tussen de monsters wordt gekwantificeerd. Uiteindelijk maakt ready proteomics de kwantificering van de relatieve abundantie van talrijke eiwitten tussen complexe monsters mogelijk.

De belangrijkste voordelen van reductieve demethylering ten opzichte van andere methoden voor stabiele isotopenmarkering, zoals iLite, zijn dat het een snelle, goedkope en nauwkeurige methode is die geen specifieke reagentia of een synthetisch medium vereist, wat betekent dat het op bijna elk type monster kan worden toegepast. Begin met het voorbereiden van 1 mg cellulair eiwit en 500 µL door middel van sonicatie of een French press om de cellen te lyseren om de eiwitten neer te slaan. Voeg één volume trichloorazijnzuur toe aan vier volumes eiwit en koel dit 10 minuten op ijs.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 12,000 Gs en 4 °C en verwijder het supernatant. Gebruik vervolgens één milliliter ijskoud aceton om het pellet opnieuw te suspenderen voordat u een tweede keer centrifugeert.

Na het aspireren van het supernatant, droog het pellet in een heatblock van 56 °C om de eiwitten te denatureren en de disulfidebruggen te reduceren. Gebruik 500 µL denaturatie- en reductiebuffer om het pellet opnieuw te suspenderen. Resuspendeer de eiwitten tot een concentratie van ongeveer 2 mg/mL.

Incubeer de eiwitten gedurende 30 minuten bij 56 °C, gevolgd door 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens, om vrije sulfidegroepen te alkyleren, 25 µL vers bereid 0,3 M IDO-acetamide in water toe aan 500 µL eiwit en incubeer dit in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Stop na de incubatie de reactie door 10 µL 3 mM DTT toe te voegen.

Bewaar de gealkyleerde eiwitten bij -80 °C. Om de gealkyleerde eiwitten te ligeren na TCA-precipitatie, wordt 1 M ureum in 50 mM HEPES pH 8,2 gebruikt om het eiwit opnieuw te suspenderen. Bereid een voorraadoplossing van Lys-C endoproteïnase in water met een concentratie van 2 µg/µL en voeg het enzym toe aan het gedigesteerde eiwit tot een eindconcentratie van 10 ng/µL; de monsters worden zes uur of overnacht bij kamertemperatuur gelaten. Suspendeer 20 µg trypsine van sequencing-kwaliteit in 40 µL 50 mM azijnzuur en voeg 5 µL toe aan de Lys-C digestiereactie.

Incubeer gedurende zes uur bij 37 °C om de eiwitten te alkyleren. Voeg trifluorazijnzuur of TFA toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Bevestig een C18-kolom aan een extractiemanifold. Gebruik vervolgens zes milliliter acetonitril of ACN om de kolom te bevochtigen.

Was vervolgens de kolom met zes milliliter 80%a CN 0,1%TFA bij de hoogst mogelijke stroomsnelheid, gevolgd door zes milliliter 0,1%TFA om de kolom te equilibreren. Stop de vacuümdruk en breng 500 microgram peptiden op de kolom aan bij een stroomsnelheid van ongeveer één milliliter per minuut. Zodra de peptiden aan de kolom zijn gebonden, wordt het vacuüm opnieuw gestart en wordt de kolom bij de hoogst mogelijke stroomsnelheid gewassen met 0,1%TFA, gevolgd door drie milliliter citroenzuurbuffer, om onco-, reductieve, dim-methylering of ready-labeling uit te voeren. Bereid onder een zuurkast telkens 12 milliliter lichte en zware ready-buffers voor om peptiden vrij te methyleren.

Voeg 10 milliliter van zowel de lichte als de zware kant-en-klare buffer toe aan de kolom met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Breng vervolgens een tweede aliquot van 10 milliliter aan. Gebruik ter waarborging van de labelering zes milliliter 0,1% TFA, gevolgd door één milliliter 0,5% azijnzuur.

Om de kolom te wassen voor het elueren van de eiwitten, stopt u het vacuüm en brengt u 1 mL van 40% a CN 0,5% azijnzuur aan met een stroomsnelheid van 0,5 mL per minuut. Voeg vervolgens 1 mL van 80% a CN 0,5% azijnzuur toe en elueer indien gewenst met een spuit van 5 mL. Meng de zwaar en licht gelabelde peptide-monsters in een verhouding van 1:1 en kwantificeer deze via massaspectrometrie om te bevestigen dat zowel de zware als de lichte labeling effectief was; fractioneer het peptidemicstuur door het eerst aan te brengen op een C 18 HPLC-kolom.

Was daarna de kolom gedurende vijf minuten met 5%a CN, waarna een gradiënt van 5 tot 35%a CN gedurende 60 minuten wordt gebruikt om de peptiden in gelijke fracties te elueren in een 96-wells plaat, gevolgd door 90%A CN gedurende één minuut. Na nog eens vier minuten met 90%A CN wordt 5%a CN gebruikt om de kolom opnieuw te equilibreren.

Combine vervolgens de fracties op de volgende manier met de vacuümcentrifuge. Verwijder het oplosmiddel uit de gecombineerde fracties. Gebruik daarna 130 µL urea 1 M 0,5% TFA om te resuspenderen.

Resuspendeer de peptiden uit de volgende fracties en bewaar de set fracties bij -20 °C om een stop-and-go-extractie uit te voeren op de geresuspendeerde fracties. Maak C 18 stage tip microkolommen van 200 µL pipetpunten door ze te vullen met twee C 18-schijfjes met een interne diameter van 1,07 mm. Plaats de stage tips in microcentrifugebuisjes, voeg 130 µL methanol toe en centrifugeer.

Voeg vervolgens 130 µL 80% CN 0,5% azijnzuur toe voordat u opnieuw centrifugeert; nadat de tips zijn geëquilibreerd met 130 µL 0,1% TFA, brengt u het peptidemengsel over naar de tips en wast u deze. Eerst met 130 µL 0,1% TFA, gevolgd door 40 µL 0,1% TFA. Gebruik vervolgens 40 µL 0,5% azijnzuur om de peptiden te elueren.

Voeg eerst 20 µL van 40% toe aan een CN 0,5% azijnzuur. Voeg daarna 20 µL van 80% toe aan een CN 0,5% azijnzuur. Combineer de IIT's en filtreer onder vacuüm om ze te drogen voor de uitvoering van microcapillaire vloeistofchromatografie.

Tandemmassaspectrometrie of L-C-M-S-M-S begint met het resuspenderen van de eiwitten tot een concentratie van ongeveer 1 µg/µL met behulp van 5% mierenzuur en 5% ACN. Breng ongeveer 1 µg peptiden aan op een 100 µm x 20 cm C18 reverse phase HPLC-kolom en elueer met een gradiënt van 6 tot 22% ACN in 0,1-25% mierenzuur bij een stroomsnelheid van ongeveer 300 nL/min, gedurende 75 tot 100 minuten.

Gebruik een massaspectrometer met een hoge resolutie en hoge massanauwkeurigheid en identificeer peptiden in het monster door Ms.Ms-spectra raw-bestanden te vergelijken met een theoretische database met een algoritme zoals SE quest, waarbij de hier getoonde parameters worden gebruikt met de database van open reading frames in de actuele en reverse oriëntaties; filter peptiden tot een false discovery rate van 1% met een methode zoals de target decoy. Om de geïdentificeerde peptiden te kwantificeren, worden de oppervlakten van zware en lichte paren van MS one geëxtraheerde ionenchromatogrammen en de signaal-ruisverhoudingen van peptiden berekend; neem peptideparen alleen op wanneer hun gemiddelde signaal-ruisverhouding boven de vijf ligt. Kwantificeer de relatieve abundantie van een peptide in de twee monsters als de ratio van de MS one piekoppervlakten van de zware en lichte versies van hetzelfde peptide; bereken de relatieve proteïne-abundanties als de mediaan van de MS one piekoppervlakte-ratio voor alle peptiden in het proteïne wanneer er gefilterd is op een peptide false discovery rate van 1%.

De labeling-efficiëntie van een mengsel van c phyto-ferment uit zwaar en licht gelabelde culturen die 11.194 unieke peptidesequenties bevatten, was 98%. Niet gefractioneerd visier-proteïnelysaat werd op vergelijkbare wijze geanalyseerd. Verschillen in proteïne-expressie weerspiegelen reproduceerbaar de ratio's waarin de zware en lichte monsters over een breed scala aan mengverhoudingen zijn gemengd. Specifiek was de fold change van 99% van de proteïnen kleiner dan 1,6 voor de 1-op-1 gemengde monsters in de 1-op-10 en 10-op-1 monsters.

99% van de eiwitten bevond zich binnen 3,8 keer de verwachte ratio, waarbij een toename van de standaarddeviatie werd waargenomen bij een grotere afstand van een één-op-één mengsel. Wanneer de ready labeling werd toegepast op het proteoom van Clostridium phytoferment, werden meer dan 2000 eiwitten gekwantificeerd, waarbij 94% van de eiwitten werd gemeten binnen tweevoudige niveaus voor replica-culturen die groeiden op glucose protein fold. Veranderingen voor dubbele paren culturen waren ook sterk gecorreleerd.

Samen ondersteunen deze experimenten dat Ready proteomics een nauwkeurige en reproduceerbare methode is om verschillen in eiwitexpressie tussen complexe monsters te kwantificeren. Omdat deze techniek op vrijwel elk type monster kan worden toegepast, heeft het de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de proteomics om veranderingen in de eiwitexpressie te onderzoeken in allerlei monsters, waaronder nieuwe microben, vissen en zoogdiercellen.